Summary
Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.
Abstract
Kalsiyum sinyali, hemen hemen her dokunun ayrılmaz bir düzenleyicisidir. Bağırsak epiteli içinde kalsiyum, salgı aktivitesinin, aktin dinamiklerinin, inflamatuar yanıtların, kök hücre proliferasyonunun ve diğer birçok karakterize edilmemiş hücresel fonksiyonun düzenlenmesinde rol oynar. Bu nedenle, bağırsak epiteli içindeki kalsiyum sinyal dinamiklerinin haritalanması, homeostatik hücresel süreçler hakkında fikir verebilir ve çeşitli uyaranlara benzersiz tepkileri ortaya çıkarabilir. İnsan bağırsak organoidleri (HIO'lar), bağırsak epitelini incelemek için yüksek verimli, insan kaynaklı bir modeldir ve bu nedenle kalsiyum dinamiklerini araştırmak için yararlı bir sistemi temsil eder. Bu makale, HIO'ları genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) ile kararlı bir şekilde dönüştürmek, canlı floresan mikroskobu gerçekleştirmek ve kalsiyum sinyallerini anlamlı bir şekilde karakterize etmek için görüntüleme verilerini analiz etmek için bir protokolü açıklamaktadır. Temsili bir örnek olarak, 3 boyutlu HIO'lar, yeşil floresan protein bazlı sitozolik bir GECI olan GCaMP6'ları stabil bir şekilde eksprese etmek için lentivirüs ile dönüştürüldü. Tasarlanan HIO'lar daha sonra tek hücreli bir süspansiyona dağıtıldı ve tek katmanlar olarak tohumlandı. Farklılaşmadan sonra, HIO tek tabakaları rotavirüs ile enfekte edildi ve/veya kalsiyum yanıtını uyardığı bilinen ilaçlarla tedavi edildi. Sıcaklık kontrollü, nemlendirilmiş canlı görüntüleme odası ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu, enfekte olmuş veya ilaçla tedavi edilmiş tek tabakaların uzun süreli görüntülenmesine izin verdi. Görüntülemenin ardından, elde edilen görüntüler ücretsiz olarak kullanılabilen analiz yazılımı ImageJ kullanılarak analiz edildi. Genel olarak, bu çalışma HIO'larda hücresel sinyallemeyi karakterize etmek için uyarlanabilir bir boru hattı oluşturur.
Introduction
Kalsiyum, hücresel fizyolojinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynayan, yaygın olarak korunan ikinci bir habercidir1. Güçlü yükü, küçük boyutu ve fizyolojik koşullarda yüksek çözünürlüğü göz önüne alındığında, kalsiyum, protein konformasyonunun ideal bir manipülatörüdür. Bu, kalsiyumu elektrokimyasal sinyalleri enzimatik, transkripsiyonel veya transkripsiyon sonrası değişikliklere dönüştürmek için güçlü bir araç haline getirir. Endoplazmik retikulum (ER) ve plazma membranları boyunca katı kalsiyum konsantrasyonu gradyanları, sitozolik kalsiyum konsantrasyonunda hızlı değişikliklere izin veren yüksek bir itici güç oluşturur. Hem arabelleğe alma hem de aktif aktarım dahil olmak üzere birden çok mekanizma bu gradyanı sıkı bir şekilde korur. Normal hücresel fonksiyonlar için gerekli olsa da, bu bakım enerjik olarak pahalıdır ve bu da onu stres durumlarında özellikle duyarlı hale getirir 2.
Bu nedenle, sitozol içindeki kalsiyumun düzensizliği, birçok hücresel stres türünün neredeyse evrensel bir sinyalidir. Metabolik bozukluklar, toksinler, patojenler, mekanik hasar ve genetik bozulmaların tümü kalsiyum sinyalini bozabilir. Uyarandan bağımsız olarak, tüm hücre düzeyinde, sitozolik kalsiyumdaki sürekli, kontrolsüz artışlar apoptozu ve sonunda nekrozu teşvik edebilir 3,4. Bununla birlikte, daha düşük genlikli veya daha yüksek frekanslı sitozolik kalsiyum seviyelerindeki değişikliklerin değişen etkileri vardır2. Benzer şekilde, kalsiyum dalgalanmalarının sonuçları, meydana geldikleri uzamsal mikro alana bağlı olarak farklılık gösterebilir5. Bu nedenle kalsiyum seviyelerinin izlenmesi, dinamik sinyalleme süreçleri hakkında fikir verebilir, ancak bu, nispeten yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip örnekleme gerektirir.
Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleri (GECI'ler), canlı hücre sistemlerinde sürekli örnekleme için güçlü araçlardır6. En yaygın kullanılan GECI'lerden bazıları, GCaMPs7 olarak bilinen GFP bazlı kalsiyuma duyarlı floresan proteinlerdir. Kanonik GCaMP, üç farklı protein alanının bir birleşimidir: dairesel olarak permütasyonlu bir GFP (cpGFP), kalmodulin ve M136. Kalmodulin alanı, kalsiyumun bağlanması üzerine bir konformasyon değişikliğine uğrar ve M13 ile etkileşimine izin verir. Kalmodulin-M13 etkileşimi, cpGFP'de, uyarma üzerine floresan emisyonunu artıran konformasyonel bir değişikliğe neden olur. Bu nedenle, kalsiyum konsantrasyonundaki bir artış, GCaMP floresan yoğunluğundaki bir artışla ilişkilidir. Bu sensörler sitozolik olabilir veya belirli organellerihedefleyebilir 8.
Çoğu dokuya benzer şekilde, kalsiyum gastrointestinal epitel içindeki çeşitli işlevleri düzenler. Bağırsak epiteli, besin ve sıvı emilimi için ayrılmaz bir parçadır, ancak aynı zamanda patojen istilasını veya toksik hakaretleri önlemek için sıkı bir bariyer ve bağışıklık arayüzü oluşturmalıdır. Kalsiyuma bağımlı yollar bu hayati fonksiyonların neredeyse tamamını etkiler 9,10,11. Bununla birlikte, bağırsak epiteli içindeki kalsiyum sinyali, terapötik bir hedef olarak umut verici potansiyele sahip, yeterince keşfedilmemiş bir sınır olmaya devam etmektedir. Bağırsak epitelindeki kalsiyum dinamiklerinin in vivo olarak izlenmesi zorluklar sunmaya devam ederken, insan bağırsak organoidleri (HIO'lar) deney için uyarlanabilir bir ex vivo sistem sunar12. HIO'lar, insan bağırsak kök hücrelerinden türetilen 3 boyutlu (3D) sferoidlerdir ve farklılaşma üzerine, doğal bağırsak epitelinin hücresel çeşitliliğinin çoğunu özetler12.
Bu protokol, GECI'leri eksprese eden HIO'ları tasarlamak ve daha sonra tasarlanmış HIO'ları canlı hücreli kalsiyum görüntüleme için tek katmanlar olarak hazırlamak için kapsamlı yöntemleri açıklar. Kalsiyum sinyalizasyonunu bozan patolojik bir manipülasyon örneği olarak viral enfeksiyonu sunar ve bu değişiklikleri ölçmek için analitik bir yaklaşım sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan tüm insan bağırsak organoidleri (HIO'lar) ve temsili deneyler, Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Enteroid Çekirdeği tarafından elde edilen ve sürdürülen insan dokusundan türetilmiştir. Tüm örnekler, Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak toplandı.
1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması
- Organoid bakımı için, hücre kültürü ile muamele edilmiş 24 oyuklu plakalar, bazal membran matrisi (BMM), 15 mL konik tüpler ve 1.5 mL konik tüpler toplayın.
- Büyüme faktörleri (CMGF-) olmadan tam ortam hazırlamak için, 500 mL gelişmiş DMEM F12'ye 5 mL 1M HEPES, 5 mL 100x antibiyotik-antimikotik, 5 mL 100x glutamin takviyesi ekleyin.
- Wnt-, R-spondin- ve Noggin içeren (WRNE) ortamı hazırlamak için, eşit miktarda CMGF ve Wnt koşullu ortamı karıştırın, Noggin koşullu ortam, hacimce %10, R-spondin koşullu ortam, hacimce %20, 50 ng/mL insan epidermal büyüme faktörü, 10 mM nikotinamid, 10 nM [Leu15]-Gastrin I, 500 nM A-83-01, 10 μM SB202190, 1x B27 takviyesi, 1x N2 takviyesi ve 1 mM N-asetilsistein.
- Lentiviral transdüksiyon için Fetal Sığır Serumu (FBS),% 0.05 Tripsin-EDTA 1x fosfat tamponlu salin (PBS),% 10 FBS ile CMGF, Steril 1x PBS, Polibren, 10 μM Y-27632, Lentivirus, Yüksek Wnt WRNE + 10 μM Y-27632 hazırlayın
- Organoid tek tabakalar oluşturmak için, cam tabanlı 10 oyuklu hücre kültürü slaytı, FBS, Kollajen IV (deiyonize (di)H2O'da1 mg/mL), bazal membran matrisi, 1x PBS'de 0,5 mM EDTA, 1x PBS'de 5 mM EDTA, enzimatik ayrışma tamponu, %10 FBS'li CMGF-, WRNE + 10 μM Y-27632.
- Organoid tek tabakaların viral enfeksiyonu için tripsin, rotavirüs stoğu, CMGF-, 25G iğne, Steril 1x PBS ve fenol kırmızısı içermeyen farklılaşma ortamı hazırlayın.
- Fenol kırmızısı içermeyen farklılaşma ortamı hazırlamak için 500 mL fenol kırmızısı içermeyen hücre kültürü ortamı alın, 5 mL 100x MEM esansiyel olmayan amino asit, 5 mL 100x L-Glutamin, 5 mL 100 nM sodyum piruvat ve 7.5 mL 1M HEPES ekleyin.
- Organoidlerin immünofloresan boyaması için,% 4 formaldehit (1x PBS'de seyreltilmiş% 16 formaldehit), Triton X-100 (1x PBS'de% 0.1 Triton X-100), Sığır serum albümini (1x PBS'de% 3 sığır serum albümini), NH4Cl çözeltisi (50 mM), DAPI (1x PBS'de 1 μg / mL DAPI çözeltisi).
2. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörlerini ifade etmek için mühendislik organoidleri
NOT: Bu protokol, 24 oyuklu bir plaka13 üzerinde 30 μL Bodrum Membran Matrisi (BMM) ile kaplanmış tek bir 3 boyutlu insan bağırsak organoidlerinin dönüştürülmesi adımlarını açıklar. Çoğu hat, kuyu başına yaklaşık 400.000 hücre içerecektir. İkinci, transdüksiyonsuz kuyu kontrol olarak dahil edilmelidir. Tüm reaktifleri ve hücre süspansiyonlarını buz üzerinde tutun.
- Son geçişten 2-5 gün sonra, bakım WRNE ortamını iki HIO kuyusundan çıkarın. Kuyucuk başına 300 μL% 0.05 Tripsin-EDTA ile değiştirin ve BMM'yi plakadan ayırmak için 5 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin. 37 °C'lik bir inkübatörde 4 dakika bekletin.
- Oyuk başına 500 μL CMGF- +% 10 FBS ekleyin. 1 mL FBS'yi 2 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1 mL düşük bağlanan pipet ucunu FBS ile önceden kaplayın. FBS, birden fazla uçta yeniden kullanılabilir. Önceden kaplanmış uçla HIO'ları 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Her kuyucuğun içeriğini kendi önceden kaplanmış 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Her birini ilave 500 μL CMGF- ile iyice durulayın ve yıkamayı ilgili tüpe ekleyin.
- Tüpleri 100 °C'de 5 dakika boyunca sallanan bir kova santrifüjünde 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı ve kalan BMM'yi çıkarın.
- 1 mL 1x PBS'de tekrar süspanse edin. Her tüpü toplam 4 tüp için iki mikrosantrifüj tüpüne bölün. Tüpleri 100 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
- Her tüpü 1x PBS'de bir kez daha tekrar süspanse edin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
- 400 μL transdüksiyon ortamı ve kontrol ortamı hazırlayın (Tablo 1). Kontrol ortamının 200 μL'sinde 2 tüpü ve transdüksiyon ortamının 200 μL'sinde 2 tüpü yeniden süspanse edin.
- 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat inkübe edin. Düzgün transdüksiyonu teşvik etmek için kaplanmış bir uçla periyodik olarak (örn. transdüksiyondan 2 saat sonra (hpt), 12 hpt, 18 hpt) yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
- 24 saat sonra, tüpleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
- Yıkamak için peleti 500 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
- Buz gibi 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, 4 peletin her birini 30 μL BMM'de yeniden süspanse edin. Eşit şekilde dağıtmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Her tüpün içeriğini 24 oyuklu bir plaka üzerinde kendi kuyucuğuna yerleştirin. 500 μL HighWnt WRNE + 10μM Y-27632 eklemeden önce BMM'nin katılaşmasına izin vermek için 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- Dönüştürülen HIO'ların 1 hafta boyunca büyümesine izin verin, ortamı (HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632) her gün yenileyin. 1 hafta sonra, floresan indikatörün ifadesini mikroskopi ile kontrol edin. Sinyal güçlüyse, ilaç seçimine başlayın. Sinyal zayıfsa, iletimi yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın.
- Hat kurulduktan sonra, agonist tedavisi ile floresan göstergesinin işlevini doğrulayın. 100nM ADP, GCaMP doğrulaması için güvenilir bir agonisttir. Aşağıda açıklandığı gibi ilk doğrulama için 3D organoidleri test edin.
- Bir geçişten sonra, BMM'de bir kuyu (veya birden fazla) organoidi ayrı bir görüntüleme alt plakası üzerine yerleştirin. Görüntüleme sırasında aşırı örtüşmeyi önlemek için organoidleri normal yoğunluğun yaklaşık 1 / 3'ünde plakalayın. Steriliteyi sağlamak zor olduğundan, agonist tedaviyi takiben bu HIO'ları geçmeye devam etmeyin.
- HIO'ların geçiş sonrası iyileşmesi için 2-3 gün bekleyin. Görüntülemeden önce, ortamı fenol kırmızısı içermeyen farklılaşma ortamına geçirin.
- Bir floresan mikroskobu kullanarak, 488 nm uyarma ve bir FITC/GFP filtre seti kullanarak her 5 saniyede bir elde edilen görüntülerle 3 dakikalık bir çalışma ayarlayın. 30 saniyelik görüntülemeden sonra, 100 nM ADP veya araç kontrolü ekleyin. Sinyal taban çizgisine yakın olana kadar görüntülemeye devam edin, ~2 dakika. ADP tedavisi ile GCaMP floresansında geçici, ~2 kat artış, başarılı transdüksiyon ve biyosensör fonksiyonunu gösterir. Transdüksiyon verimliliğinin daha kesin bir tahmini için, bölüm 3'te açıklanan işlemle oluşturulan tek katmanları kullanarak görüntüleme ile agonist testini tekrarlayın.
3. Canlı floresan görüntüleme için HIO tek katmanlarının hazırlanması
- 10 oyuklu görüntüleme alt haznesi lamının tüm kuyucuklarını Kollajen IV ile kaplayın. Bunu yapmak için 34 μL 1 mg/mL Kollajen IV'ü 960 μL steril deiyonize su ile karıştırın. Her bir oyuğa 95 μL seyreltilmiş kollajen IV çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 0.5-2 saat inkübe edin.
- WRNE bakım ortamını 4 kuyu 3D HIO'dan çıkarın. HIO'lar son geçişlerinden itibaren 5-7 gün olmalıdır.
NOT: 1 10 oyuklu plaka tipik olarak ~ 1.25 x 106 hücre gerektirir. Bu tipik olarak, her biri 30 μL BMM ile kaplanmış 2-4 kuyucuklu 3D HIO gerektirir, ancak yoğunluğa bağlı olarak değişecektir. - Kuyucuk başına 500 μL 1x PBS + 0.5 mM EDTA ekleyin. Önceden kaplanmış 1 mL'lik bir uçla, BMM'yi plakadan ayırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Süspansiyonu önceden kaplanmış 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve benzer kuyucukları aynı tüpte birleştirin.
- Her bir kuyuyu ilave 500 μL PBS + 0,5 mM EDTA ile durulayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatan ve artık BMM'yi çıkarın.
- Önceden kaplanmış bir uç kullanarak, kalan peleti 3 mL PBS + 5 mM EDTA içinde yeniden süspanse edin (bunun ilk yıkamadan 10 kat daha fazla EDTA olduğunu unutmayın).
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatan ve artık BMM'yi çıkarın. Peletin 2 mL enzimatik ayrışma tamponunda yeniden süspanse edilmesi.
- 37 °C boncuk/su banyosunda 5 dakika inkübe edin. 3 mL CMGF- + %10 FBS ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipetleyin.
- 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL CMGF- ekleyin.
- HIO'ları mekanik olarak tek hücrelere ayırmak için önceden kaplanmış bir 80x-100x uçla kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
- 1 mL WRNE + 10 μM Y-27632 içinde yeniden süspanse edin. 1 mL süspansiyon için bir hücre sayısı elde edin.
- 1.25 x 105 hücre/100 μL (1.25 x 10 6 hücre/mL) konsantrasyon elde etmek için hücre süspansiyonunu WRNE + 10μMY-27632 ile seyreltin.
- 200 μL'lik bir pipet kullanarak, kollajen çözeltisini 1. adımda hazırlanan plakadan çıkarın, çünkü kollajen şimdi kuyunun dibine yerleşmiştir. Pipet ucuyla kuyunun dibine dokunmaktan kaçının.
- Önceden kaplanmış 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, oyuk başına 3.11. adımdan (1.25 x 105 hücre) 100 μL hücre çözeltisi ekleyin.
- 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, kültür ortamını tüm oyuklardan çıkarın ve oyuk başına 100 μL farklılaşma ortamı ile değiştirin.
NOT: Bu noktada, hücreler plakaya yapışmış olmalıdır. Tek katmanın büyük olasılıkla birleşik veya tamamen düzlemsel olmayacağını unutmayın. - Slaytı 37 °C hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Farklılaşma ortamını, tek katman birleşene kadar her 24 saatte bir yenileyin. Bu genellikle kaplamadan 3-5 gün gerektirir. Bu noktadan sonra, tek katmanlar sonraki uygulamalar için hazırdır.
4. HIO tek katmanlarının viral enfeksiyonu
- Virüs aşısını hazırlayın. Gerekirse, tripsin virüs stoğunu aktive eder. Rotavirüs için, virüs stoklarına 10 μg / mL Worthington's Trypsin ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Etkinleştirilmiş virüs stoğunu aşağıdaki iki yöntemden birini kullanarak seyreltin.
- Sadece bir viral suş kullanarak maksimum enfekte hücre sayısını hedefliyorsanız, 50 μL aktive edilmiş viral stoğu 50 μL CMGF- ile karıştırın.
- Birden fazla suş karşılaştırıldığında, eşdeğer enfeksiyon çoklukları (MOI'ler) elde etmek için aşıları hazırlayın. İstenen MOI için gerekli olan kuyu başına virüs stoğu hacmini belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın. Kuyu başına 100 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için hesaplanan virüs stoğu hacmine CMGF- ekleyin.
NOT: 5.46 mm çapında (96 oyuklu plaka) bir kuyuya kaplanmış tek bir HIO tek tabakası yaklaşık 200.000 hücre içerir. Tek tabakalarda enfeksiyon etkinliğinin düşük olması nedeniyle, yüksek MOI (hücre başına 100-1 milyon viral partikül) tercih edilir. Optimal MOI ampirik olarak belirlenmelidir.
- 200 mL'lik bir pipet kullanarak ortamı HIO tek katmanından nazikçe çıkararak tek katmanları enfekte edin. 100 mL virüs aşısı veya sahte aşı ile değiştirin.
- Çoğu rotavirüs stoğu MA104 hücrelerinde çoğaltıldığından, sahte aşılama için enfekte olmamış bir MA104 hücre lizatı kullanın. Enfekte kuyucuklar için kullanılan virüs stoğunun hacmine eşdeğer bir hacim kullanın ve kuyucuk başına 100 mL'lik bir son hacim için CMGF- ekleyin.
- Rotavirüs14 gibi hücreleri bazolateral olarak enfekte eden virüsler için, tek tabakayı puanlamak için 25G'lik bir iğne kullanın. Tek katmanın uzunluğu boyunca, kuyunun altından üstüne kadar tek bir puan yapmak en kolay yoldur. İğneyi, eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde, hareket yönünün tersine bir açıyla tek katmana hafifçe bastırın ve bir yara izi oluşturmak için tek katmanın uzunluğu boyunca sürükleyin (Şekil 2A).
- 37 °C'lik bir inkübatörde 2 saat inkübe edin. Virüsü çıkarın ve sahte aşılama. Tek katmanları 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- 100 μL fenol kırmızısı içermeyen farklılaştırma ortamı ekleyin. Slaytı görüntülemeye hazır olana kadar 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Optimal görüntüleme penceresi, viral enfeksiyonun kinetiğine bağlı olarak değişecektir. Rotavirüs için, enfeksiyondan 6-8 saat sonra görüntülemeye başlayın.
- Etkinleştirilmiş virüs stoğunu aşağıdaki iki yöntemden birini kullanarak seyreltin.
5. Ca2+ Enfekte tek tabakaların görüntülenmesi
- Sahne üstü inkübatörü önceden 37 °C'ye ısıtın. Nemlendirilmiş CO2'yi 0,02 L/dk'da çalıştırın. Enfekte olmuş tek katmanlarla birlikte slaytı inkübatör odasına yerleştirin ve kapağı kapatın.
- Parlak alan (BF) aydınlatması ve 20x objektif kullanarak, görüntülenecek tek katman içindeki görüş alanlarının X ve Y koordinatlarını seçin. Enfekte olmuş hücrelerin çoğu çiziğe yakın olacağından, puanlanan bölge göz önünde olacak şekilde noktaları seçmek en iyisidir.
- Görüntüleme parametrelerini optimize edin ve 488 nm uyarma kullanarak bir görüntü elde edin. Fototoksisiteyi en aza indirmek için ışık kaynağını 50 ms pozlama süresiyle %50 güce ayarlayın. Uygun alım parametreleri değişebilir ve birden fazla alım alınarak optimize edilmelidir. Hiçbir pikselin doygun olmadığından emin olun. Floresan kalsiyum sensörünün tüm dinamik aralığının algılanabilmesini sağlamak için pozlama süresini ve ışık gücünü gerektiği gibi ayarlayın.
- Diğer floroforlar (örneğin, floresan etiketli virüsler) kullanıyorsanız, bu kanallarda optimizasyonu tekrarlayın. Görüntüleme döngüsünü ayarlayın ve 1 dakikalık bir döngüde seçilen her X, Y koordinatında 488 nm'lik bir görüntü elde edin. Bu döngüyü sürekli olarak görüntüleyin. Floresan etiketli bir virüs kullanırken, her 10. döngüde bir uygun kanalda bir görüntü elde edin (yani, 1 görüntü/10 dakika).
- ~ 18 saat boyunca görüntüleri toplayın. Floresan etiketi olmayan virüsler kullanıyorsanız, tek katmanları düzeltin ve enfekte olmuş hücreleri tanımlamak için immünofloresan boyama yapın. Bunu, aşağıda açıklandığı gibi görüntüleme çalıştırmasını tamamladıktan sonra gerçekleştirin.
- Görüntüleme ortamını çıkarın ve 1x PBS'de 100 μL %4 formaldehit ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Sabitleyiciyi çıkarın ve 100 μL 50mM NH4Cl ile 10 dakika söndürün. NH4Cl'yi çıkarın. Tek katmanları 1x PBS'de 100 μL% 0.1 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de geçirgenleştirin.
- Geçirgenlik tamponunu çıkarın. 1 saat boyunca 1x PBS'de 100 μL% 3 sığır serum albümini ile bloklayın.
- Engelleme çözümünü çıkarın. 1x PBS'de önerilen/optimize edilmiş konsantrasyona seyreltilmiş birincil antikorlar ekleyin. Kuyucuk başına 100 μL antikor çözeltisi ekleyin.
- Gece boyunca 4 °C'de hafifçe sallayarak inkübe edin. Birincil antikorları çıkarın. 1x PBS ile 3x yıkayın.
- 1x PBS'de önerilen/optimize edilmiş konsantrasyona seyreltilmiş floresan konjuge ikincil antikorlar ekleyin. Oyuk başına 100 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
NOT: FPBase15 , çoğullama sırasında taşmayı önleyecek ikincilleri seçmeye yardımcı olacak harika bir kaynaktır. İkincillerin çoğu, 1x PBS'de 1:1000 seyreltmede etkilidir. - İkincil antikorları çıkarın. 1x PBS'de 1 μg/mL DAPI çözeltisi yapın ve oyuk başına 100 μL ekleyin. 20 dakika inkübe edin. DAPI'yi çıkarın. 1x PBS ile 3x yıkayın.
- Görüntüleme için sabit tek katmanları 100 μL 1x PBS'de tutun. Slaytı mikroskop tablasına geri yerleştirin, canlı görüntüleme çalışmasından X ve Y koordinatlarını yeniden yükleyin ve boyama için kullanılan ikincil antikora karşılık gelen kanaldaki her çok noktayı görüntüleyin. Aynı noktaların yakalandığından emin olmak için canlı görüntüleme çalışmasından elde edilen görüntülere bakın.
6. Hücreler arası kalsiyum dalgalarının kantitasyonu
- Fiji'nin Just ImageJ (FIJI) olduğundan emin olun ve aşağıdaki eklentilerle birlikte yüklenmiştir: Bio-Formats (FIJI'ye önceden yüklenmiş olmalıdır ancak ImageJ'de olmayacaktır); Yemek Kitabı: Yüklemek için FIJI menüsünden Yardım > Güncellemeleri > Güncelleme sitelerini yönet'e gidin. Yemek Kitabını Kontrol Edin. FIJI'yi yeniden başlatın.
- Canlı görüntüleme çalışmasından gelen veri dosyasını, her X, Y koordinatını ayırarak birden çok dosyaya bölün. Nikon NES Elements'te, Dosya > İçe/Dışa Aktar > Çoklu Noktaları Böl'ü seçin. Dışa aktarmak için bir klasör ve uygun bir önek seçin.
- FIJI'yi açın. Bölünmüş çoklu noktalardan tek bir dosya yükleyin. Çok kanallı bir görüntü kullanıyorsanız, kanalları bölün. 488 nm kanalından (GCaMP) görüntülerin bulunduğu pencereyi seçin.
- Her piksel değerindeki değişimi bir zaman noktasından diğerine belirlemek için DeltaF Up işlevini çalıştırın. Bunu yapmak için, Delta F Up > Yemek Kitabı > T-fonksiyonlarını seçin.
- Kalsiyum dalgasına sahip bir görüntü bulunana kadar yığında ilerleyin. Kalsiyum dalgası görüntülenirken, Eşiği Ayarla > Görüntü > Ayarla'ya tıklayarak bir eşik ayarlayın. Eşiği geçmesini sağlayan dalganın parçası olmayan sinyal miktarını en aza indirmek için alt sınırı ayarlayın. Yukarıda açıklanan parametreler kullanılarak elde edilen 16 bit görüntüler için, 600 gibi daha düşük bir eşikle başlayın ve gerektiği gibi ayarlayın.
- Parçacıkları Analiz Et > Analiz Et'e tıklayarak dalgaları segmentlere ayırmak için partikül analizörünü çalıştırın. Aralığı ayarlayarak minimum dalga boyutunu μm2 olarak ayarlayın. Başlangıçta 0-sonsuz olarak ayarlanır. 20x objektif kullanılarak elde edilen MA104 hücrelerinin görüntüleri için, alt sınırı 10.000μm2'ye yükselterek başlayın ve uygun şekilde ayarlayın.
- Sonuçları görüntüle ve Sonuçları temizle kutularını işaretleyin. "Göster" açılır menüsünden Anahatlar'ı seçin ve ardından Tamam'ı tıklayın. Bu, 2 çıkışla sonuçlanmalıdır: Bir pencere, Sonuçlar, algılanan her dalgayı, dalganın alanını ve ortalama, minimum ve maksimum yoğunluk değerlerini (delta F'ye göre) listeleyecektir. [dosya adı] çizimi başlıklı diğer pencere, parçalı dalgaların ana hatlarını içeren yeni bir yığın içerecektir. Dalga algılamayı doğrulamak için bunu kullanın. Gerekirse eşik değerlerini ve boyut aralığını ayarlayın ve dalga çağrılarını yeniden kontrol edin.
- Toplu işleme için, birlikte verilen makro komut dosyasını kullanın (Ek Kodlama Dosyası 1). Bunu kullanmak için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
- Birden çok noktayı adım 6.2'de açıklandığı gibi tek dosyalara bölün. FIJI'yi açın. Toplu > Makro> İşlem'i seçin. "Giriş" kutusunda, bölünmüş çok noktalı dosyaları içeren klasörün haritasını sağlayın. "Çıktı" kutusunu boş bırakın.
- Komut dosyasını Ek Kodlama Dosyası 1'den kutuya yapıştırın. Koddaki yoğunluk eşiğini ve boyut eşiğini, 6.5 ve 6.6 adımlarındaki en iyileştirilmiş parametreleri yansıtacak şekilde ayarlayın.
- İşlem'e tıklayın. Çoklu noktaların sayısına ve bilgisayarın işlem hızına bağlı olarak, tüm görüntülerin işlenmesi 30 dakika veya daha uzun sürebilir. Tamamlandığında, veriler Masaüstünde "Yazdıktan sonra beni yeniden adlandır" adlı yeni bir elektronik tablo dosyasına yazılacaktır. Çıktı dosyası, her çok noktalı için bir dalga sayısı ve dalga ölçümleri (alan, ortalama yoğunluk, minimum ve maksimum yoğunluk ve yoğunluk yoğunluğu) içermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A , GCaMP6'ları stabil bir şekilde ifade etmek için dönüştürülmüş 3 boyutlu insan bağırsak organoidlerini içeren bir BMM kubbesini göstermektedir. Şekil 1B , tohumlamadan 24, 48 ve 72 saat sonra tek tabaka olarak yeniden kaplanan aynı organoid hattını göstermektedir. GCaMP6'ların işlevini doğrulamak için, tek tabaka 4 dakika boyunca her 2 saniyede bir floresan mikroskobu ile görüntülendi ve ~20 saniye sonra ortama 100 nM ADP eklendi. Her maruziyette 488 nm kanalında tespit edilen floresan yoğunluğu Şekil 1C'de çizilmiştir. İz, sabit bir başlangıç floresan yoğunluğunu, ardından ADP ilavesi üzerine hızlı bir artış ve taban çizgisine doğru kademeli bir dönüş gösterir. Yanıtın gerçek bir sinyalleşme olayı olduğunu ve yalnızca ortam ilavesinden kaynaklanabilecek floresan yoğunluğundaki bir değişiklik olmadığını doğrulamak için bir araç kontrolü dahil edilmiştir.
Bir HIO tek tabakasının puanlanması, rotavirüs enfeksiyonunun etkinliğini artırır. Puanlama teknikleri farklılık gösterse de, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, tek katmanın uzunluğu boyunca tek bir skor kullanarak tutarlı enfeksiyon elde etmek en kolay yoldur. Floresan proteinleri eksprese eden rekombinant rotavirüs suşları kullanıldığında, canlı görüntüleme sırasında enfeksiyon doğrulanabilir (Şekil 2B). Bir belirteç ifade etmeyen bir suş kullanıldığında, görüntülemeden sonra immünofloresan ile enfeksiyon tespit edilebilir. HIO tek katmanlarındaki hücrelerin hareketliliği göz önüne alındığında, zaman içinde tek bir enfekte hücreyi izlemek genellikle zordur. Bunun yerine, enfeksiyonu doğrulamak ve enfeksiyon çokluğunun görüş alanları arasında eşleştiğini doğrulamak için bir yöntem olarak uç nokta boyamayı kullanın (Şekil 2C).
HIO'lardaki hücreler arası kalsiyum dalgaları, Şekil 3A'da gösterildiği gibi kalitatif olarak gözlemlenebilir. Bununla birlikte, belirli bir görüş alanındaki kalsiyum dalgalarının frekansını belirlemek, kantitatif analiz gerektirir. Yukarıdaki protokolün 6. adımında açıklandığı gibi başarılı segmentasyon adımları Şekil 3A'da gösterilmektedir. Şekil, ham görüntüyü (Şekil 3Ai), önceki kareden piksel yoğunlukları çıkarıldıktan sonraki görüntüyü (Şekil 3Aii), ardından segmentli kalsiyum dalgasını (Şekil 3Aiii) göstermektedir.
Kalsiyum dalgaları, görüntüleme çalışması boyunca her bir görüş alanı için bölümlere ayrıldıktan ve ölçüldükten sonra, çeşitli koşullara maruz kalan tek tabakalardaki dalgaların frekansını karşılaştırmak genellikle bilgilendiricidir. Şekil 3B'deki şerit grafiği, sahte ve rotavirüs aşılanmış tek katmanlarda görüş alanı başına toplam kalsiyum dalgası sayısını göstermektedir. Bu örnek iki RV suşu içerir: bir insan rotavirüsü suşu (Ito HRV) ve mRuby'yi (SA11-mRuby) eksprese eden bir simian rotavirüs SA11 rekombinant suşu. Sahte enfekte kontrol, temel kalsiyum dalga frekansı olarak alınır, tedavi edilmemiş rotavirüs ile enfekte tek tabakalar pozitif kontroller olarak görev yapar ve rotavirüs ile enfekte, tedavi edilmiş tek tabakalar deneysel koşullardır. ADP reseptör inhibitörü BPTU da dahil olmak üzere ilaçlarla tedavi edilen sahte enfekte ve RV ile enfekte tek tabakalar daha sonra tek yönlü ANOVA ile her iki kontrol koşulu ile karşılaştırılabilir. Veriler, BPTU'nun hücreler arası kalsiyum dalgalarının sıklığını etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir.
Şekil 1: Jejunal insan bağırsak organoidlerinde GCaMP6s ekspresyonunun doğrulanması. (A) Lentivirüs transdüksiyonundan sonra, GCaMP eksprese eden HIO'lar, burada en son geçişten 7 gün sonra gösterilen seçilim ve çoklu geçişlere tabi tutuldu. 488 nm lazer ile stimülasyon üzerine, GCaMP6s ekspresyonu, 15 μL bazal membran matrisinde 3 boyutlu sferoidler (Ai) olarak kaplanmış transdüksiyonlu HIO'larda belirgindir. 50x objektif kullanılarak %50 lazer gücünde 20 ms pozlama elde edildi, ardından tüm bazal membran matris kubbesini görselleştirmek için bir araya getirildi. Benzer bir işlem, 4 ms parlak alan pozlamaları (Aii) kullanılarak gerçekleştirildi. Parlak alan görüntüsünde, kubbenin ortasındaki karanlık HIO'lar, kültürlerin geçişe hazır olduğunun bir göstergesidir. (B) HIO'lar enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi, daha sonra kollajen IV ile önceden kaplanmış bir görüntüleme alt plakasının oyuk başına 150.000 hücre yoğunluğunda (5 mm çapında) yeniden kaplandı. Tohumlamadan 72 saat sonra, tek tabaka birleşti ve sonraki uygulamalar için hazırdı. GCaMP'nin işlevini doğrulamak için, görüntüler 4 dakika boyunca her 2 saniyede bir% 50 lazer gücünde 50 ms pozlama ile 488 nm filtre seti kullanılarak elde edildi. (C) Burada gösterilen izler, görüntüleme sırasında ilk edinime normalize edilen tüm alan floresan yoğunluğunu temsil eder. Yaklaşık 20 s'de (ok), onuncu maruziyetten sonra, sitozolik kalsiyumda (kırmızı) bir artış ortaya çıkarmak için 100 nM adenozin difosfat (ADP) eklendi. Eşit hacimde 1x PBS'nin eklenmesi anlamlı bir yanıt (mavi) ortaya çıkarmadı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: RV enfeksiyonunu kolaylaştırmak için bir HIO tek tabakasının puanlanması. (A) Şekil, 25G iğne kullanarak tek tabakalı bir tabakayı puanlamak için uygun bir tekniği göstermektedir. (B) Bir HIO tek tabakası, enfekte olmuş hücrelerin tanımlanmasına izin veren mRuby floresan proteinini (macenta, ok) eksprese eden rekombinant bir RV suşu ile enfekte edildi. Alternatif olarak, doğal olarak oluşan bir RV suşu kullanıldığında, enfekte olmuş hücreler immünofloresan kullanılarak tanımlanabilir. (C) Gösterilen görüntüler, fiksasyon, DAPI boyama (mavi) ve rotavirüs antijeninin (macenta) antikor etiketlemesinden sonra 4 farklı HIO tek katmanından alınmıştır. Her iki teknik de tek tabakanın çentikli kısmının yakınında tercihli RV enfeksiyonunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RV ile indüklenen hücreler arası kalsiyum dalgalarının segmentasyonu ve kantitasyonu. GCaMP6'ları eksprese eden RV ile enfekte olmuş HIO'ların 488 nm maruziyetleri, protokol kullanılarak 16 saat boyunca her 1 dakikada bir elde edildi. (A) Şekil, hücreler arası kalsiyum dalgası segmentasyonu sürecini göstermektedir. İlk olarak, floresan yoğunluğundaki (Aii) değişikliği ölçmek için önceki edinimden (t-1) piksel değerleri her ham görüntüden (Ai) çıkarılır. Ardından, önceki kareden deneysel olarak optimize edilmiş minimum yoğunluk artışına dayalı bir eşik uygulanır. Görüntüler daha sonra hücreler arası kalsiyum dalgalarını (Aiii) seçmek ve tek hücreli kalsiyum sinyallerini hariç tutmak için minimum bitişik sinyal alanı için filtrelenir. Bu işlem, her görüş alanında kalsiyum dalgalarının ölçülmesine izin verir. Bu deneyde, tek tabakalar ya sahte enfekte edildi, insan rotavirüsünün (HRV) ITO suşu ile enfekte edildi ya da yapısal olmayan protein 3'ün (SA11-mRuby) akış aşağısındaki gen segmenti 7'de mRuby'yi kodlayan rekombinant bir simian rotavirüs suşu ile enfekte edildi. Enfekte tek tabakalar ya ADP reseptör inhibitörü BPTU ile tedavi edildi ya da tedavi edilmeden bırakıldı. Tek katmanlar daha sonra 8 farklı pozisyonda görüntülendi ve her görüş alanındaki kalsiyum dalgaları, bu protokolde açıklanan boru hattı kullanılarak ölçüldü. Şerit grafiğindeki noktalar, ortalama ve SD'yi işaretleyen bir çubuk grafik üzerine bindirilmiş her pozisyonda tespit edilen kalsiyum dalgalarının sayısını gösterir. Tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in testleri, her iki RV suşunun da enfekte olmamış grubunkinden daha fazla hücreler arası kalsiyum dalgalarının frekansını arttırırken, BPTU tedavisinin kalsiyum dalga frekansında RV aracılı artışı önlediğini göstermektedir. **p<0.01, ***p<0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Iletim | Kontrol |
| Y-27632 (1 mM stok) | 4 μL | 4 μL |
| Polibren (1 mg/μL stok) | 2 μL | 2 μL |
| Lentivirüs virüsü | değişken* | |
| HighWnt-WRNE *notlara bakın | 400 μL'ye kadar | 400 μL'ye kadar |
Tablo 1: Lentivirus transdüksiyon ortamı. Reaktifleri sırasıyla ikinci ve üçüncü sütunlarda belirtilen hacimlerde birleştirerek transdüksiyon ortamını ve kontrol ortamını hazırlayın. Hücre başına 10 lentivirüs transdüksiyon biriminden oluşan çok sayıda enfeksiyonu (MOI) hedefleyin. Şirket içinde paketlenmiş LV için bu genellikle ~25-50 μL konsantre LV gerektirir. Ticari olarak paketlenmiş LV'lerin çoğunun titresine Analiz Sertifikası verilecektir.
Ek Kodlama Dosyası 1: Toplu işleme ile kalsiyum dalgası nicelleştirmesine izin vermek için ImageJ makro komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sitozolik Ca2+ seviyelerindeki değişiklikler,epitel 10,16,17 içindeki patolojilerin hem nedeni hem de sonucu olabilir. Sitozolik kalsiyumdaki artışlar, kalsiyuma bağımlı klorür kanalının aktivasyonu yoluyla doğrudan sekresyona neden olabilirTMEM16A 18,19. Ca2+'ya yanıt olarak TMEM16A aktivasyonu, apikal klorür akışına izin vererek, sıvı sekresyonunu destekleyen ozmotik bir gradyanoluşturur 20,21. Ayrıca, enteroendokrin hücrelerdekiCa2+ artışları, enterik sinir sistemi22 içindeki aktiviteyi modüle edebilen afferent duyusal nöronları uyaran serotonin salınımını tetikler. Ca2+ sinyalleri ayrıca bariyer fonksiyonunu 23,24 etkilemek için sıkı bağlantıları modüle edebilir ve bağırsak kök hücrelerinde25 proliferasyonu düzenleyebilir. Bu nedenle,Ca2+'nın düzensizliği geniş ve geniş kapsamlı etkilere sahip olabilir.
Birçok virüs, replikasyona elverişli bir hücresel ortam oluşturmak için sitozolikCa2+'yı manipüle eder26. Rotavirüs, bağırsak epiteli27 içinde bunun en iyi örneğidir. Rotavirüs yapısal olmayan protein 4 (NSP4),Ca2+'nın endoplazmik retikulumdan sitozole28,29 akışına izin veren bir Ca 2+ iletken kanaldır. Bu, otofajiyi uyarır ve dış kapsid30,31,32'nin montajına yardımcı olur. Rotavirüs enfeksiyonu ayrıca ADP salınımını indükleyerek patogeneze katkıda bulunan hücreler arasıCa2+ dalgalarını tetikler17. Hem kalisivirüsler hem de enterovirüsler dahil olmak üzere diğer enterik virüsler, enfekte hücreler içinde benzer Ca2+ düzensizliğini tetikleyen Ca2+ iletken viroporinleri kodlar33,34.
İnsan bağırsak organoidlerinin canlı hücre Ca2+ görüntülemesi, epitel içindeki virüs kaynaklı sinyalleri incelemek için çok yönlü bir platform sunar. Bununla birlikte, görüntüleme verilerinden elde edilen sonuçların gücü, ayrılmaz bir şekilde, HIO'ların sağlığına ve kalitesine, uygun görüntüleme parametrelerine ve sağlam bir analitik yaklaşıma bağlıdır.
Etkili lentiviral transdüksiyon, yeni HIO hatları oluştururken genellikle sınırlayıcı adımdır, ancak yüksek titreli lentivirüs ve çoklu transdüksiyonlar, yeterli transgen ekspresyonunun sağlanmasına yardımcı olur. Daha da önemlisi, bunun transdüksiyon üzerine önemli hücresel stres potansiyeli ile dengelenmesi gerekecektir. Bu genellikle geçicidir ve seçimden ve çoklu geçişlerden sonra azalır. Bununla birlikte, GECI'leri ifade etmek için tasarlanan HIO'ların deneylere başlamadan önce normal büyüme ve çoğalma göstermesi çok önemlidir. Benzer şekilde, 3 boyutlu HIO'ların dağıtılması ve bunların tek tabakalar olarak yeniden düzenlenmesi hücresel strese neden olur. Tek katmanların kaplamadan sonra uyum sağlaması için üç veya daha fazla gün beklemek en iyi uygulamadır. Plakaların kollajen IV ile kaplanması tek tabaka bütünlüğü için kritiköneme sahiptir 35,36. Kollajen IV'ün alikote edilmesi ve kullanımlar arasında -80 °C'de saklanması, tek tabaka aderansının sağlanmasına yardımcı olur. Her HIO hattı için en uygun tohumlama yoğunluğunun belirlenmesi de tutarlılığın iyileştirilmesine yardımcı olabilir. Son olarak, uygun kontrollerin dahil edilmesi ve bunların deneyler arasında karşılaştırılması, herhangi bir gözlemin teknik bir karıştırıcıdan ziyade söz konusu değişkene bir yanıtı temsil etmesini sağlamak için vazgeçilmezdir.
Tek tabakalı bir puanlama istenmeyen hücre hasarına neden olabilirken, 2D HIO'ların RV enfeksiyonunu büyük ölçüde artırır. Şekil 2 bunu göstermektedir, çünkü neredeyse tüm enfekte olmuş hücreler doğrudan çiziğe bitişiktedir. Deneysel kanıtlar, RV'nin bağırsak epitel hücrelerinin bazolateral yüzeyinde en verimli şekilde enfekte olduğunu göstermektedir37. Bu nedenle, tek tabakalı bir tabakanın puanlanmasının bazolateral yüzeyi açığa çıkararak enfektiviteyi arttırdığı tahmin edilmektedir. Etkili tek tabakalı enfeksiyon, bazolateral yüzeye erişime izin veren kültür ortamı içeren kuyucuklarda asılı duran polikarbonat membranlar üzerine HIO'ların kaplanmasıyla da elde edilebilir. Bununla birlikte, plaka ile polikarbonat membran, polikarbonat membranın kendisi ve kuyu tabanındaki plastik yüzey arasındaki nispeten uzun mesafe, onları epifloresan görüntüleme için uygunsuz hale getirir. Bu nedenle, bu protokolde açıklanan puanlama yöntemi tercih edilen yaklaşım olmaya devam etmektedir. Puanlamanın kendisinin sinyal bozulmalarına yol açabileceği göz önüne alındığında, enfekte olmamış, puanlanmış kontrolün dahil edilmesi yorumlama için kritik öneme sahiptir. Apikal membran yoluyla etkili bir şekilde enfekte olan insan norovirüsü gibi virüsler için tek tabakanın puanlanması gerekli değildir38.
Herhangi bir canlı görüntüleme sisteminde olduğu gibi, fototoksisite, HIO tek katmanlarını kullanan deneyleri kolayca karıştırabilir. Bir görüntüleme deneyi boyunca, beklenmeyen vakuolizasyon, membran kanaması veya stresin diğer morfolojik göstergelerini izlemek önemlidir39. Bu belirtilerden herhangi biri tespit edilirse, uyarılma süresi, sıklığı veya gücü azaltılmalıdır. Sinyal-gürültü oranının arttırılması genellikle uzun vadeli hücre sağlığı pahasına gelir, bu nedenle parametrelerin ampirik olarak optimize edilmesi çok önemlidir. Foto ağartma, zamanla başlangıç floresan yoğunluğundaki bir azalma ile gösterildiği gibi, hücre stresinin habercisidir ve bundan kaçınılmalıdır.
Görüntüleme verilerinin görselliği, araştırmacıların nicel analizlerden ziyade nitel analizleri tercih etmesine yol açabilir. Bununla birlikte, herhangi bir modalitede olduğu gibi, tekrarlanabilir sonuçlar nicelleştirme gerektirir. Kantitatif görüntü analizi, tek bir makalede ele alınabilecek olandan çok daha fazla karmaşıklık içerir, ancak birkaç önemli noktayı vurgulamakta fayda var. İlk olarak, tutarlı nicelik, tutarlı bir kazanım gerektirir. Belirli bir dizi toplama parametresi için geliştirilen bir analiz hattı, farklı frekanslarda, pozlama sürelerinde, lazer güçlerinde veya dalga boylarında elde edilen görüntüler için etkili olmayabilir. İkincisi, enfeksiyonun çokluğu, viral olarak indüklenen kalsiyum sinyallerinin sıklığı üzerinde çok büyük bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, görüş alanı başına enfekte olmuş hücre sayısını değerlendirmek ve tedavi koşulları arasında tutarlılığı sağlamak önemlidir. Alternatif olarak, sinyal frekansını görüş alanı başına enfekte hücre sayısına normalleştirmek, hatayı azaltmaya yardımcı olabilir. Son olarak, yakın zamanda geliştirilen mNG tabanlı kalsiyum göstergesi (NEMO),40 hücrelerindeki mutlak Ca2+ konsantrasyonlarını belirlemek için umut verici bir yaklaşım sunarken, çoğu biyosensör biyolojik sistemler hakkında yalnızca göreceli bilgi iletir. Bu nedenle, arka plan çıkarma, normalleştirme ve bir denetimle karşılaştırma kritik öneme sahiptir.
Bu protokol viral enfeksiyon sırasında kalsiyum görüntülemeye odaklanırken, genel yaklaşım kolayca uyarlanabilir. Viral enfeksiyon, alternatif bir tedavi koşulu için kolayca ikame edilebilir ve birçok farklı hücresel yolu ve süreci izlemek için sürekli büyüyen bir biyosensör litanyası vardır. Herhangi bir protokol uyarlamasında, araştırmacılar analizi akılda tutmalı ve net, ölçülebilir sonuçları olan deneyler tasarlamalıdır.
Genel olarak, canlı görüntüleme rakipsiz zamansal çözünürlük sağlayarak son derece dinamik süreçlerin karakterizasyonunu geliştirir. Organoidlerin canlı görüntüleme deneylerine dahil edilmesi, bu süreçlerin dokuya doğru, fizyolojik olarak ilgili bir modelde gözlemlenmesine izin verir. Burada açıklanan protokolün deneysel tasarım ve optimizasyonu kolaylaştırdığını ve araştırmacıları hücre ve doku sinyalizasyonunun yeni yönlerini ortaya çıkarmaları için güçlendirdiğini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmek için rekabet eden mali çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH) R01DK115507 ve R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) hibeleri ile desteklenmiştir. Stajyer desteği, NIH hibe F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F.J. Scribano) ve F32DK130288 (PI: K.A. Engevik) tarafından sağlandı. Organoid bakım ortamını sağladığı için Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Enteroid Çekirdeğine teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E.
- Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
- Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
- Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
- Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
- Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
- Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
- Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
- Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
- Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
- Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
- Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
- Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
- Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
- Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
- Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
- Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
- Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
- Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
- Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
- Hyser, J. M., Estes, M. K.
- Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
- Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
- Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
- Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
- Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
