Summary
Questo protocollo descrive l'uso di microiniezione e di imaging ad alta risoluzione nel
Abstract
Questo protocollo descrive l'uso di embrioni di Drosophila melanogaster sinciziale per lo studio mitosi 1. Drosophila è genetica utile con un genoma sequenziato, e può essere facilmente gestito e manipolato. Mutanti mitotici esistono molte, e vola transgenici che esprimono funzionale fluorescente (es. GFP) - proteine mitotico tag sono stati e vengono generati. Espressione genica mirata è possibile con il sistema GAL4/UAS 2.
L'embrione di Drosophila primi svolge mitosi multipli molto rapidamente (durata del ciclo cellulare, ≈ 10 min). E 'adatto per l'imaging mitosi, perché durante i cicli di 10-13, i nuclei si dividono rapidamente e in modo sincrono senza intervenire citocinesi sulla superficie dell'embrione in un monostrato singolo appena sotto la corteccia. Questi nuclei si dividono rapidamente probabilmente usare gli stessi macchinari mitotico come le altre cellule, ma sono ottimizzate per la velocità, il checkpoint è generalmente ritenuto di non essere rigorosi, permettendo lo studio delle proteine mitotico la cui assenza avrebbe causato l'arresto del ciclo cellulare in cellule con un posto di blocco forte . Gli embrioni che esprimono proteine GFP etichettati o microiniettati con le proteine fluorescente può essere facilmente ripreso a seguire le dinamiche vivere (Fig. 1). Inoltre, gli embrioni possono essere microiniettati con funzione di blocco anticorpi o inibitori di proteine specifiche per studiare l'effetto della perdita o di perturbazione della loro funzione 3. Questi reagenti possono diffondere in tutto l'embrione, raggiungendo molti fusi per produrre un gradiente di concentrazione di inibitore, che a sua volta in un gradiente di difetti paragonabile ad una serie alleliche di mutanti. Idealmente, se la proteina bersaglio è fluorescente, il gradiente di inibizione può essere direttamente visualizzato 4. Si presume che il più forte fenotipo è paragonabile al fenotipo nullo, anche se è difficile escludere formalmente la possibilità che gli anticorpi possono avere effetti dominante in rari casi, i controlli in modo rigoroso e cauta interpretazione deve essere applicata. Più lontano dal sito di iniezione, la funzione delle proteine è solo parzialmente perso permettendo altre funzioni della proteina bersaglio a diventare evidente.
Protocol
Ricette:
Succo d'uva piastre:
- 5.5g bacto agar
- 14,5 g destrosio o glucosio
- 7,15 g di saccarosio
- 45 ml di succo concentrato d'uva (100% di succo).
- 204,5 ml di H 2 0
- 625 microlitri 10N NaOH
Mescolare tutti gli ingredienti e forno a microonde fino a ebollizione.
Aggiungere 2,8 ml di acido mix (mix di acido: 20,9 ml di acido propionico, acido fosforico 2,1 ml, 27 ml di H 2 0)
Mescolare e versare su 35 piatti millimetri Petri. Lasciate solidificare a temperatura ambiente per uno o due giorni. Se i pannelli non saranno utilizzati presto, sigillare con parafilm e conservare a 4 ° C (permette di equilibrare a RT prima di usare).
Lievito di pasta:
Sciogliere circa un cucchiaino di lievito (Sigma YSC2, lievito di Saccharomyces cerevisiae tipo II) in acqua per formare una pasta spessa. Mettete una piccola quantità di questo su ogni piatto succo d'uva appena prima dell'uso.
G-PEM buffer:
- 80 mm Na-TUBI, pH 6,9
- 1 mM MgCl 2
- 1 mM EGTA
- 1 mM GTP
Iniezione buffer:
- 150 mM K-aspartato
- 10 mM K-fosfato
- 20 mM imidazolo, pH 7,2
Eptano colla:
Srotolare il nastro doppio adesivo e mettere in un flacone da 100 ml, aggiungere circa 50 ml di eptano, sigillare la bottiglia, e il rock per diversi giorni. Durante l'utilizzo, aggiungere eptano se la colla è troppo spessa.
Camera di disidratazione:
Prendete un piatto di 100 millimetri di Petri, mettere una parte di un piatto 35 millimetri all'interno per fare una "tabella" e aggiungere Drierite (solfato di calcio anidro) intorno ad esso in modo che l'altezza del Drierite non è superiore al "tavolo" e copertura. Il coprioggetto con embrioni saranno messi su questo "tavolo" per la disidratazione prima dell'iniezione. E 'una buona idea di utilizzare almeno alcune Drierite indicazione e di cambiarlo quando ha cambiato colore.
Protocollo:
Questo protocollo può essere utilizzato per l'iniezione di qualsiasi reagente solubile in embrione di Drosophila sinciziale: per esempio, o una proteina fluorescente per l'osservazione o di un inibitore della proteina bersaglio o entrambi.
Ottenere tutto pronto:
1 .- 2 o 3 giorni prima dell'esperimento, fanno piatti succo d'uva e impostare laici gabbia: Prendere una bottiglia di plastica (6 oz, fondo rotondo da Applied Scientific Drosophila), tagliare due piccoli fori (circa 1 cm 2) sui lati opposti del bottiglia e riempire con un pezzo di cotone (questo permette all'aria di circolare), toccare le mosche nella bottiglia e coprire con un piatto di succo d'uva. Mantenere a 25 ° C (o temperatura ambiente), mosche dovrebbero definire gli embrioni per circa 10 giorni.
2 .- Almeno un giorno prima l'esperimento tirare aghi per l'iniezione, si usa un ago Kopf / Pipettare modello estrattore 720 e filamenti sottili pareti di vetro (World Strumenti di precisione tw100f). Per l'iniezione di tubulina fluorescente, mantenere gli aghi a 4 ° C per evitare che la temperatura indotta polimerizzazione nella ago.
Tubulina preparazione:
Nota: Tutti i lavori con la tubulina dovrebbe essere fatto a 4 ° C per prevenire la polimerizzazione.
- Prendere tubulina etichettati dal freezer e metterlo in ghiaccio per 5 a 15 minuti.
- Diluire con G-PEM tampone (4 a 10 volte a seconda della intensità richiesta).
- Centrifugare a 13k rpm a 4 ° C per 10-15 minuti.
- Carico 1-2 microlitri in ago.
Anticorpi o inibitori chimici:
Preparare gli aghi come per tubulina, utilizzando una concentrazione appropriata (questo può avere bisogno di essere testati). L'anticorpo può essere nel buffer di iniezione, G-PEM buffer o PBS. Se un altro tampone è necessario, questo buffer dovrà essere iniettato come controllo per assicurarsi che questo buffer non causa alcun danno per conto suo.
Nota: tubulina inibitore e fluorescenti possono essere miscelati e iniettati insieme, se la concentrazione lo consentono. Altrimenti, iniettare il tubulina fluorescenti e attendere 5 a 10 minuti prima di iniettare l'inibitore. Quando si esegue una doppia iniezione, iniziare con più embrioni, dal momento che un minor numero di embrioni si riprenderà normalmente.
Raccolta degli embrioni:
- Mettere un nuovo piatto succo d'uva sulla gabbia laici.
- Rimuovi questo piatto dopo un'ora, questa è la prima collezione della giornata e spesso non è molto buona. Può essere scartato.
- Cambia la piastra ogni ora per tenere raccolta embrioni per un'ora ciascuno.
Coprioggetto preparazione:
- Mettere un coprioggetti 50 x 22 millimetri su un lato di un vetrino da microscopio. Nastro i quattro angoli alla diapositiva in modo che non si muove.
- Utilizzando un cotone con punta applicatore, mettere uno strato di colla eptano in una riga sul coprioggetto (la colla non deve essere viscoso e deve asciugare in pochi secondi, altrimenti aggiungere più eptano).
- Mettete un pezzo didoppio nastro adesivo sul vetrino verso il lato del coprioggetto.
Embrione preparazione:
Nota: Gli embrioni devono essere esposte circa 2 ore dopo l'inizio della raccolta, in modo da iniziare la seguente procedura che consente un tempo sufficiente per finirli entro questo arco di tempo.
- Con un pennello inumidito con attenzione raccogliere gli embrioni dalla piastra di succo d'uva e il luogo in doppio nastro adesivo sul vetrino.
- Utilizzando la parte esterna delle pinzette, rotolare gli embrioni sopra il nastro doppio adesivo fino a quando il corion (la membrana esterna) si rompe.
- Prendete l'embrione con delicatezza ribaltamento del corion così si attacca alla pinzetta e posizionarlo sulla colla eptano sul vetrino con il lato lungo del parallelo embrione al lato lungo del vetrino coprioggetto. Impostare 10-20 embrioni in una riga.
- Rimuovere il coprioggetto e posizionarlo nella camera di disidratazione per 3 a 8 minuti (questo dipende l'umidità della stanza e la quantità da iniettare).
- Mettere su una camera di metallo con grasso per vuoto.
- Coprire gli embrioni con 700 Halocarbon olio per evitare ulteriori disidratazione. Gli embrioni sono ora pronti per l'iniezione.
Embrione iniezione:
- Trova gli embrioni sotto un obiettivo 16x.
- Spostare gli embrioni di distanza, e trovare l'ago senza spostare il piano focale.
- Centro l'ago e spostarlo senza spostarlo nella direzione xo y..
- Se l'ago non è aperto, messo ai margini del vetrino nel campo di vista, ma non dove l'ago sarà, e abbassare l'ago stesso piano focale. Con molta attenzione spostare il coprioggetto fino a raggiungere l'ago e delicatamente spezza aperto. Se l'ago è aperto, passare al punto 5. (Aghi possono essere aperti con acido fluoridrico prima del riempimento).
- Mettere gli embrioni in vista (ma non dove l'ago sarà), abbassare l'ago nel petrolio e assicurarsi di ottenere gocce di liquido bella dall'ago.
- Con attenzione ma costantemente spostare l'embrione in l'ago e iniettare una goccia in embrione e spostare l'embrione distanza. (Oppure seguire le istruzioni del tuo apparato di iniezione).
- Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, sono pronti per l'osservazione di un microscopio confocale.
Imaging:
Immagine gli embrioni in un microscopio confocale con un obiettivo 60 o 100X:
Note:
- L'intervallo di tempo su una serie lasso di tempo dovrebbe essere al massimo di pochi secondi, dal momento che la mitosi nell'embrione è molto veloce, a seconda del processo esatto da studiare.
- Una serie di immagini 3D o di un singolo piano può essere acquisito a seconda del processo di interesse.
- Per gli inibitori ad azione rapida, il trasferimento da microscopio iniezione per l'imaging microscopio deve essere veloce.
Figura 1: Studio della mitosi negli embrioni di Drosophila sinciziale. Nuclei nell'embrione precoce subire divisioni rapido senza citodieresi, durante i cicli di 10 e 13 formano un monostrato a nuclei della corteccia. A. Schematica di embrione precoce con i nuclei di corteccia. Embrione può esprimere la GFP e / o RFP proteine marcate e può essere microiniettati con altre proteine marcate e / o inibitori. B. lapse imaging Tempo di embrioni che esprimono GFP-tubulina e RFP-istoni. Plot C. polo-polo di separazione per cicli di 11 , 12 e 13 in un embrione di tipo selvatico. Lunghezza del mandrino presenta periodi di lunghezza isometrica e periodi di allungamento, che sono molto coerenti e riproducibili. D. Dinamica dei microtubuli del fuso. L'iniezione di bassa concentrazione di tubulina rodamina porta a macchie formato da una subunità di tubulina pochi, che può essere utilizzato per studiare la dinamica dei microtubuli.
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Discussion
Questo protocollo è relativamente semplice, tuttavia, ogni passo richiede pratica per assicurarsi che gli embrioni non siano danneggiati. Esperimenti di controllo attento sempre bisogno di essere fatto per garantire che i risultati affidabili si stanno ottenendo. Un buon modo per cominciare questo è microinjecting tubulina buffer o rodamina in embrioni di controllo che esprime GFP-tubulina per assicurarsi che la mitosi procede normalmente attraverso tutti i cicli in superficie dell'embrione (cicli da 10 a 13). Negli embrioni di controllo non si dovrebbe osservare alcun collegamento fisico tra i mandrini che sono spesso il risultato di disidratazione troppo, in modo da abbassare il tempo di disidratazione. Quando gli embrioni sono danneggiati, fallout nucleare è spesso osservato, centrosomi libero o spaziatura irregolare dei nuclei o mandrini sono indicativi di danno. Appezzamenti di polo-polo a distanza sono molto riproducibili e sono una misura molto affidabile di "successo", in embrioni di controllo che dovrebbe essere simile a quelli mostrati in figura 1.
Abbiamo usato questo protocollo per studiare molti aspetti del montaggio del mandrino, manutenzione e allungamento con monoclonali, anticorpi anti-peptide o policlonali sollevate contro la proteina di interesse 1,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Inibitori della proteina specifica o altre sostanze chimiche colpisce la proteina di interesse può essere anche microiniettati ei loro effetti osservati e misurati quantitativamente. Per valutare l'effetto di un inibitore particolare, si confronta la lunghezza del mandrino dopo l'inibizione a quello osservato in embrioni di controllo. Possiamo anche osservare le dinamiche tubulina tramite microscopia a fluorescenza Speckle 14 dopo microiniezione di una bassa concentrazione di tubulina fluorescenti (Fig. 1d).
In genere raccogliere per un'ora e lasciare che gli embrioni maturi per un'ora in più prima di osservazione, questo significa che gli embrioni sono tra 1 e 2 ore di vita quando osservati. Se le mosche stanno gettando bene e molti embrioni vengono raccolti in un'ora, poi il tempo di raccolta può essere abbreviato in modo che più gli embrioni sincrono-si ottengono dividendo. Se i tempi di inibizione è critico o di interesse per lo studio, l'inibitore può essere iniettato sotto osservazione confocale. Questo è più difficile, ma è possibile comunque.
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Acknowledgments
Questo protocollo è attualmente utilizzato nel nostro laboratorio ed è stato affinato negli anni da molte persone tra dottori David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur. Ringraziamo il dottor Bill Sullivan (UCSC), che ci ha fornito ottimi consigli sulla manipolazione e la microiniezione di primi embrioni di Drosophila quando il nostro lavoro in questo sistema era in fase di avvio (rif. 13). Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Scholey. Il nostro lavoro sulla mitosi in Drosophila è sostenuto da NIH concedere GM55507.
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