Summary
Bij het werken met media en reagentia die worden gebruikt om cultuur micro-organismen, moet een aseptische techniek worden toegepast om ervoor te zorgen besmetting tot een minimum beperkt. Verschillende platen methoden worden routinematig gebruikt voor het isoleren, propageren of sommen bacteriën en faag, die opgenomen procedures die de steriliteit van experimentele materialen handhaven.
Abstract
Micro-organismen aanwezig zijn op alle levenloze oppervlakken te creëren overal de mogelijke bronnen van verontreiniging in het laboratorium. Experimentele succes is gebaseerd op het vermogen van een wetenschapper aan het werk oppervlakken en apparatuur te steriliseren en te voorkomen dat contact van steriele instrumenten en oplossingen met niet-steriele oppervlakken. Hier presenteren we de stappen voor de verschillende plating methodes routinematig gebruikt in het laboratorium te isoleren, te verspreiden, of micro-organismen zoals bacteriën en faag te sommen. Alle vijf methoden te nemen aseptische techniek, of procedures die de steriliteit van experimentele materialen te behouden. Beschreven procedures omvatten (1) streak-plating bacteriële culturen om enkele kolonies te isoleren, (2) giet-plating en (3) spread-plating om levensvatbare bacteriële kolonies te sommen, (4) zachte agar overlays om faag en enumerate plaques te isoleren, en ( 5) replica-plating van cellen van de ene plaat naar de andere dezelfde ruimtelijke verdeling. Deze procedures worden uitgevoerd bij thij laboratoriumtafel, op voorwaarde dat zij voornamelijk de niet-pathogene stammen van micro-organismen (Biosafety Level 1, BSL-1). Als het werken met BSL-2 organismen, dan zijn deze handelingen moeten plaatsvinden in een bioveiligheid kast. Raadpleeg de meest recente editie van de bioveiligheid in Microbiologische en Biomedische Laboratories (BMBL) en Material Safety Data Sheets (MSDS) voor infectueuze stoffen, om de biologisch indeling en de veiligheidsvoorschriften en insluiting faciliteiten die nodig zijn voor het micro-organisme in kwestie te bepalen. Bacteriële stammen en faag voorraden kan worden verkregen uit onderzoek onderzoekers, bedrijven, en collecties onderhouden door bepaalde organisaties zoals de American Type Culture Collection (ATCC). Het verdient aanbeveling niet-pathogene stammen worden gebruikt als informatie over de verschillende platen methoden. Door het volgen van de procedures beschreven in dit protocol, moet de student in staat zijn om:
- Voer plating procedures zonder contaminating media.
- Isoleer een bacteriële kolonies door de streak-plating methode.
- Gebruik pour-plating en verspreiding-plating methoden om de concentratie van bacteriën te bepalen.
- Voer zachte agar overlays bij het werken met faag.
- Overdracht bacteriecellen van een plaat naar de andere met de replica-plating procedure.
- Bij een experimentele taak, selecteert u de juiste plating methode.
Protocol
1. Bereid een veilige en steriele werkruimte
- Bekend zijn met alle laboratorium-regels en veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen bij het werken met micro-organismen. Ongeacht biohazard classificatie worden alle materialen die in contact komen met micro-organismen als infectueus afval moet gereinigd voordat de verwijdering. Volg de veiligheidsrichtlijnen in overeenstemming met die van institutionele Environmental Health and Safety afdelingen, het opzetten van geschikte afval recipiënten voor onmiddellijke en correcte afvoer van mogelijk besmette materialen (biologische gevaren).
- Steriliseren alle instrumenten, oplossingen, media en vóór het gebruik ervan voor plating procedures.
- Ruim alle materialen verrommeling uw werkgebied op de laboratoriumtafel.
- Maak werkgebied met een desinfecterend middel om besmetting te minimaliseren.
- Het opzetten van een bunsenbrander en werk langzaam, zorgvuldig, en opzettelijk binnen het steriele veld gebied gecreëerd door de updraft van de vlam.
- Als het werken met BSL-2 organismen, het opzetten van uw werkruimte in een bioveiligheid kast. Een Bunsen brander kan worden gebruikt in de kast, omdat de warmte van de vlam verstoort luchtstroom essentieel functionaliteit.
- Leg alle benodigdheden die nodig zijn voor de procedure op het laboratorium bankje in de buurt van het steriele veld. Zorg ervoor dat alle materialen correct geëtiketteerd zijn. Het organiseren van het werkgebied om de efficiëntie te maximaliseren en onnodige bewegingen zal het minimaliseren van de blootstelling tijd van experimentele materialen aan luchtverontreinigingen.
- Plaats de bunsenbrander aan uw rechterhand op de bank.
- Plaats agar platen of petrischaaltjes aan uw linkerhand.
- Regel celculturen, kolven en flessen in het midden van de bank.
- Draai de doppen van buizen, flacons en flessen, zodat ze gemakkelijk kunnen worden geopend met een hand bij volgende manipulaties.
- Was je handen grondig met antiseptische zeep en warmwater voordat u micro-organismen.
2. Streak Plate Procedure: Isolatie van bacteriële kolonies Met behulp van de Quadrant-methode
De streak-plaat procedure is bedoeld om zuivere culturen van bacteriën, of kolonies, isoleren van gemengde populaties door eenvoudige mechanische scheiding. Afzonderlijke kolonies bestaan uit miljoenen cellen groeien in een cluster op of in een agarplaat (figuur 1). Een kolonie, in tegenstelling tot een enkele cel, is zichtbaar voor het blote oog. In principe zijn alle cellen in een kolonie uit een bacterie eerste afgezet op de plaat en aldus worden aangeduid als een kloon of cluster van genetisch identieke cellen.
- Bacteriën bestaan in verschillende vormen en afmetingen. Bijvoorbeeld individuele Escherichia coli cellen staafvormige met een gemiddelde lengte van 2 pm en een breedte van 0,5 pm, terwijl Streptococcus cellen bolvormig met een gemiddelde diameter van 1 pm. Sommige bacteriën (sul als E. coli) bestaan enkele cellen terwijl andere vormen verschillende patronen van associatie. Streptococcus bijvoorbeeld groeien in paren vorm kettingen of clusters van cellen. Algemeen wordt aangenomen dat een enkele kolonie ontstaat uit een enkele cel die een binaire splijting, maar deze veronderstelling is niet waar voor de bacteriën die van nature bestaan als paren, kettingen, of clusters of dat delen door andere mechanismen. Alternatief, indien teveel bacteriën geplateerd, dan overlappen van cellen kunnen optreden en de kans groter twee of meer bacteriën die tot wat lijkt een kolonie. Om deze complicaties te voorkomen bij het beschrijven en opsommen van bacteriële culturen groeien op een vast medium, worden kolonies genoemd kolonievormende eenheden (kve).
Met de streep-plaat procedure wordt een mengsel van cellen over het oppervlak van een halfvaste stof, agar-gebaseerde voedingsmedium in een petrischaal zodanig dat steeds minder bacteriëlecellen zijn gedeponeerd bij ver uit elkaar punten op het oppervlak van het medium en na incubatie ontwikkelen tot kolonies. De kwadrant werkwijze voor het isoleren afzonderlijke kolonies uit een mengsel van cellen worden behandeld.
- Strook-plating kan worden bereikt met een aantal verschillende instrumenten (figuur 2). Een metalen lus kan worden hergebruikt meerdere keren wordt gebruikt voor strook-plating routine laboratoriumstammen. Wegwerp plastic lussen zijn in de handel verkrijgbaar en worden vaker gebruikt bij het werken met BSL-2 stammen in een bioveiligheid kast. Veel wetenschappers geven de voorkeur aan wegwerp, pre-gesteriliseerde houten stokken of appartement tandenstokers voor de streak-plating. Dit zijn een goedkoop alternatief voor de wegwerp plastic lussen en kan vooral nuttig zijn bij het werken met een milieu-monster zoals grond die waarschijnlijk bevat sporenvormende bacteriën.
- Wegwerp vooraf gesteriliseerd sticks en tandenstokers hoeft niet te worden geflambeerd met de bunsenbrander Dons het voorkomen van onnodige aërosolvorming van sporenvormende bacteriën en kruisbesmetting van laboratorium-oppervlakken of agar platen met sporen.
- Label de rand van de bodem (niet het deksel) van een agarplaat ten minste naam, de datum van het type groeimedium en het type organisme worden uitgeplaat op het medium.
- De platen moet volledig droog zijn zonder condensatie op het deksel en voorverwarmde tot kamertemperatuur vóór strook-plating. Indien de platen bij 4 ° C, verwijderen enkele uren of zelfs de dag. Verspreid ze in kleine versprongen stapels niet meer dan 2-3 platen laten drogen.
- Het monster van de streep-plaat geënt kan ofwel een suspensie van cellen in bouillon of bestaande kolonie een agarplaat zijn. Om te beginnen wordt aanbevolen slechts een monster worden gebruikt om een plaat te inoculeren. Om tijd en materialen op te slaan, kan een enkele plaat worden gebruikt voor meerdere samples, maar alleen als je eenmaal bedreven in strepen een monster op een bord.
- Voor het eerste kwadrant wordt het monster opgevangen en verdeeld over ongeveer een kwart van het oppervlak van het medium met een snelle, glad, heen en weer gaande beweging (Paneel A van figuur 3). Til de onderste helft van een omgekeerde plaatje van de bank. Beweeg de lus stok of tandenstoker en weer vaak in de agar oppervlak van de rand naar het midden van de plaat.
- Als entmateriaal een celsuspensie een entoog met bacterie verkrijgen met een metalen lus of 5 tot 10 ßl met een micropipettor. Zorg ervoor dat u werveling of vortex de celsuspensie voordat u een hoeveelheid voor plating. Gebruik aseptisch tijdens het uitvoeren van deze stap brandende niet alleen de lus maar ook de rand van de fles of buis voor en na verwijdering van de inoculum. Ook niet aan te raken de zijkanten van de buis of fles met de lus of loop van de micropipettor. Als pipetteren het inoculum, afzien van de celsuspensie op de appropriate plaats op de plaat vervolgens met een lus, stok of tandenstoker om het te verspreid over het eerste kwadrant van de plaat.
- Als het inoculum is een kolonie van een andere plaat, voorzichtig de kolonie aan te raken met de lus, stick of tandenstoker vervolgens verspreid deze over het eerste kwadrant van de plaat. Zorg ervoor dat de metalen lus wordt afgekoeld voordat u de kolonie. Om ervoor te zorgen de lus niet te heet, lichtjes aanraken op de agarplaat in een aangewezen gebied waar geen strepen zal optreden. Slechts enkele cellen nodig de kolonie niet de gehele kolonie.
- Bij gebruik van een metalen lus vlam met behulp van een Bunsen-brander voor het verkrijgen van de inoculum van de plaat (panel B van figuur 3). Start ongeveer 3-4 cm van de lus, met de draad in de punt van de blauwe kegel, het heetste deel van de vlam. De metalen zou moeten worden roodgloeiend. Verplaats de draad, zodat de vlam nadert de lus. Deze manipulatie voorkomt aërosolvorming van bacteriën links op de lus van de vorige gebruik.
- Flaming doodt debacteriën (hoewel niet sporen) en convectie stromen van de verwarmde lucht voorkomen dat andere verontreinigingen in de lucht uit de afwikkeling van op de metalen draad tijdens de latere manipulaties.
- Bij gebruik van een steriele flat tandenstoker, Houd het smalle uiteinde tussen je duim en ringvinger op een 10 tot 20 ° hoek ten opzichte van het medium, en gebruik de brede einde aan streak van de kwadranten. Bij gebruik van een lus of houten stok, houd het als een potlood in dezelfde hoek. Niet zo hard drukken dat de lus, stick of tandenstoker opgravingen in de agar.
- Na het voltooien van het eerste kwadrant, omkeren en vastgelegd de plaat terug in het deksel op de bank. Gooi de stok of een tandenstoker of opnieuw vlam de metalen lus, zoals beschreven in stap 4.
- Zet de petrischaal 90 ° naar streak het tweede kwadrant. Til de onderste helft van een omgekeerde plaatje van de bank vervolgens op de loop, stick of tandenstoker om het eerste kwadrant nabij het einde van de laatste streep. Met behulp van de back-en weer patroon, oversteken van de last helft van de strepen in het eerste kwadrant vervolgens naar de lege tweede kwadrant. Omkeren en vastgelegd de plaat terug in het deksel op de bank zodra de tweede kwadrant wordt gevuld.
- De lus moet stick of tandenstoker nooit meer terug gaan in de eerste helft van de strepen in het eerste kwadrant, waar de meeste van de oorspronkelijke inoculum werd afgezet.
- Een nieuwe kunststof lus, houten stok of een tandenstoker moet worden gebruikt voor elk kwadrant.
- Herhaal stap 6 tweemaal voor de derde en vierde kwadranten.
- Zorg ervoor dat u beschikken over de stick of tandenstoker of opnieuw vlam het metalen lus tussen elk kwadrant.
- Niet ingaan op het eerste kwadrant als strepen het vierde kwadrant.
- Incubeer de plaat op zijn kop, zodat condens dat zich ophoopt op het deksel druipt niet op de koloniën.
3. Giet Plate Procedure: Bepaling van het aantal bacteriële cellen in een mengmonster
Deze methode is vaakd om het aantal micro-organismen tellen in een mengmonster, die is toegevoegd aan een gesmolten agar medium voor de uitharding. Het proces resulteert in kolonies gelijkmatig verdeeld over de vast medium als de juiste monsterverdunning wordt geplateerd. Deze techniek wordt gebruikt om levensvatbaar plaattellingen, waarbij het totale aantal kolonievormende eenheden in de agar en op het oppervlak van de agar op een plaat genoemde voeren. Levensvatbare plaattellingen de wetenschappers gestandaardiseerde middel groeicurves genereren, de concentratie van cellen berekenen de buis waaruit het monster werd uitgeplaat en het effect van verschillende omgevingen of groei voorwaarden bacteriecel overleving of groei onderzoeken.
- Label de rand van de bodem (niet het deksel) van steriel lege Petrischaal met tenminste naam, de datum van het type groeimedium en het type organisme te worden toegevoegd aan het gesmolten agar medium.
- Neem de verdunningsfactor als platformIng seriële verdunningen, of een reeks van herhaalde verdunningen, waardoor een systematische vermindering van de concentratie van cellen in het monster. Voorbereiding seriële verdunningen is noodzakelijk indien het aantal cellen in het monster de capaciteit van de agarplaat, waarin de significante bereik 30-300 cfu. Als er meer dan 300 kve op een bord, dan is de kolonies zullen zijn drukke en overlappende.
- Zorg voor een buisje met 18 ml gesmolten agar medium.
- De agar medium moet worden overgebracht in reageerbuizen en vooraf-gesteriliseerd in een autoclaaf. Op dezelfde dag is nodig voor een experiment zijn de agar worden gesmolten in een stoomkoker 30 minuten daarna overgebracht naar een 55 ° C waterbad. Slechts zoveel agar als nodig is voor het experiment te smelten omdat het niet opnieuw worden gebruikt.
- Tien minuten voor het storten platen, moeten de buizen van gesmolten agar worden overgedragen van de 55 ° C waterbad bij een warmtebron blok op de arbeidsmarktAtory bank ingesteld op 48 ° C. Zodra de agar bereikt deze temperatuur, is het klaar om te gieten. Als de agar te warm is, kan de bacteriën in het monster worden gedood. Als de agar is te koel, kan het medium zijn klonterig keer gestold.
- Verkrijgen uw monster dat moet ofwel een bouillon cultuur of een suspensie van cellen geproduceerd door het mengen cellen van een kolonie in buffer of zoutoplossing.
- De monsters kunnen worden verkregen uit een verdunningsreeks van een enkel monster.
- Monstervolume worden geplaat moet tussen 0,1 en 1,0 ml.
- Open het deksel van de lege petrischaal, en breng uw monster in het midden van de plaat (Panel A van figuur 4). Sluit het deksel.
- Gebruik aseptische technieken deze procedure.
- Gebruik een van beide een serologische pipet of micropipettor om je monster over te dragen aan de plaat. De stroom van het monster zodat het niet uit spat van de plaat.
- Verwijder de dop van het bade van het gesmolten agar en langs de rand van de open buis door de vlam van de brander Bunsen.
- Open het deksel van de petrischaal met uw monster en giet de agar in zorgvuldig (Panel B van figuur 4). Sluit het deksel en meng het monster met de agar onder voorzichtig schudden de plaat.
- Laat de agar grondig stollen voordat het omkeren van de plaat voor incubatie.
4. Spread Plate Procedure: Vorming van Discrete bacteriële kolonies voor plaattellingen, verrijking, selectie of Screening
Deze techniek gewoonlijk wordt gebruikt om afzonderlijke micro binnen een klein monster volume, dat over het oppervlak van een agarplaat, resulterend in de vorming van discrete kolonies gelijkmatig verdeeld over de agar bij montage van de geschikte concentratie van cellen uitgeplaat. Naast het gebruik van deze techniek voor levensvatbare plaattellingen, waarbij het totale aantal kolonievormende eenheden op een single plaat genoemde en gebruikt om de concentratie van cellen berekenen de buis waaruit het monster werd uitgeplaat wordt verspreid-plating gewoonlijk gebruikt in verrijking, selectie en screening experimenten. De gewenste resultaat voor deze drie experimenten meestal dezelfde als voor plaattellingen, waarin een verdeling van discrete kolonies vormt over het oppervlak van de agar. Echter, het doel is niet om ervoor te zorgen alle levensvatbare cellen vormen kolonies. In plaats daarvan zouden alleen die cellen binnen een populatie die een bepaald genotype hebben groeien. De verspreiding plaat procedure kan worden toegepast over de pour plaat techniek voor een opsomming experiment als het uiteindelijke doel is om kolonies te isoleren voor verdere analyse, omdat kolonies groeien toegankelijk op de agar oppervlak terwijl ze worden ingebed in de agar met de pour plaat procedure.
Er zijn twee strategieën hier beschreven voor de spreidplaat procedure. De eerste (methode A) omvat het gebruik van een draaitafel en glas of metaal rod vorm van een hockeystick. De tweede (methode B), aangeduid als de "Copacabana Method", omvat schudden vooraf gesteriliseerde glasparels. Beide vergemakkelijken gelijkmatige verspreiding van cellen in de agar oppervlak.
Methode A: Spread-plating met een draaitafel en glazen of metalen staaf
- Label de rand van de bodem (niet het deksel) van een agarplaat ten minste naam, de datum van het type groeimedium en het type organisme worden uitgeplaat op het medium.
- Neem de verdunningsfactor als plateren seriële verdunningen.
- De platen moet volledig droog zijn zonder condensatie op het deksel en voorverwarmde tot kamertemperatuur vóór verspreiding-plating. Indien de platen bij 4 ° C, verwijderen enkele uren of zelfs de dag. Verspreid ze in kleine versprongen stapels niet meer dan 2-3 platen laten drogen.
- Centreer de plaat op de draaitafel (figuur 5).
- Zorg voor ur monster hetgeen een bouillon cultuur of een suspensie van cellen geproduceerd door het mengen cellen van een kolonie in buffer of zoutoplossing.
- De monsters kunnen worden verkregen uit een verdunningsreeks van een enkel monster.
- Monstervolume worden geplaat moet tussen 0,1 en 0,2 ml.
- Open het deksel van de petrischaal, en afzien van uw monster op het midden van de agar. Sluit het deksel.
- Gebruik aseptische technieken deze procedure.
- Gebruik een micropipettor om je monster over te dragen aan de plaat. De stroom van het monster zodat het niet uit spat van de plaat.
- Dompel de glazen staaf of draadmetaal (ook wel spreider) in een bekerglas van 70% (v / v) ethanol.
- LET OP: Nooit een warme spreader onderdompelen in een beker van alcohol.
- De ethanol mag alleen aanraken het onderste gedeelte van de inrichting en de eerste inch van de steel.
- Giet ze af en ontsteken dan ethanol door het passeren van het door de vlam van een Bunsen brander.
- De vlam moet reizen de lengte van de spreider en de stuurpen die in contact kwam met de ethanol dan snel te blussen.
- Mocht de beker van ethanol vlam vat, geen paniek! Plaats een glazen afdekplaat over de beker, die snel zal doven het vuur.
- Open het deksel van de agar plaat, die de deksel in uw linkerhand met de duim en wijsvinger. Koel het verspreidorgaan door aanraking van de agar langs de rand bij de rand.
- Raak de agar waar de cellen werden toegevoegd. De hete strooier zal doden de cellen.
- Met je linkerhand (houdt u de deksel van de agar plaat), langzaam draaien de draaitafel.
- Hoewel het best vermeden, als je moet het deksel neerzetten, plaats het gezicht naar beneden op een gedesinfecteerde oppervlak binnen het steriele veld van de bunsenbrander. Met een deksel dat naar boven is gericht, is er een grotere kans op besmetting van de bewegingen van voorwerpen of handen, het creëren van luchtstromen die ervoor zorgen datmicro-organismen en stofdeeltjes te dalen naar de binnenzijde van het deksel.
- Met je rechterhand voorzichtig houd de strooier op het oppervlak van de agar en geleidelijk verspreidde de steekproef gelijkmatig over de gehele plaat. Beweeg de spreider heen en weer over de plaat als de draaitafel draait.
- Laat het monster grondig te absorberen (minstens 5 minuten) voordat het omkeren van de plaat voor incubatie.
Methode B: Spread-plating met glazen kralen: de "Copacabana Methode"
- Label de rand van de bodem (niet het deksel) van een agarplaat ten minste naam, de datum van het type groeimedium en het type organisme worden uitgeplaat op het medium.
- Neem de verdunningsfactor als plateren seriële verdunningen.
- Open het deksel van de agar plaat, die de deksel in uw linkerhand met de duim en wijsvinger. Open vervolgens de glazen buis of fles met daarin vooraf gesteriliseerd glkont kralen. Met je rechterhand, vlam de rand van de buis of fles dan voorzichtig afzien van 10-12 steriele glazen kralen op een agar plaat (Figuur 6). Sluit het deksel van de plaat, en de vlam de rand van de buis of fles opnieuw voor het vervangen van de dop en deze te vernietigen.
- Giet de kralen uit de buis of fles een paar centimeter boven de agar, zodat de kralen niet uit stuiteren van de petrischaal.
- Gebruik glazen kralen die zijn 4 mm in diameter. Steriliseren in glazen flessen of reageerbuisjes in de autoclaaf bij 121 ° C aan de droogcyclus (zwaartekracht instelling) gedurende 30 minuten.
- Een voordeel van korrels in plaats van een spreider is dat geen open containers ethanol nodig herhaald vlam.
- Open het deksel van de agar plaat, en afzien van uw monster op het midden van de agar. Sluit het deksel.
- Gebruik aseptische technieken deze procedure.
- Hoeveelheid 100-150 ßl monster per plaat. Dezevolume vergemakkelijkt gelijkmatige verspreiding van cellen. Gebruik een micropipettor om je monster over te dragen aan de plaat. De stroom van het monster zodat het niet uit spat van de plaat.
- Het monster door zachtjes schudden de korrels over het oppervlak van de agar 6-7 keer. Om ervoor te zorgen cellen gelijkmatig verdelen, gebruik dan een horizontale schudden beweging.
- Niet zwenk de kralen of anders alle cellen zal eindigen op de plaat rand.
- TIP: Als dit goed wordt gedaan, de procedure klinkt als "schudden maracas".
- Draai de plaat 60 ° dan horizontaal weer schudden 6 tot 7 keer.
- Draai de plaat 60 ° een tweede keer en horizontaal weer te schudden. Door nu, zou je zo gelijkmatige verspreiding van cellen in de agar oppervlak.
- Na afloop spread-plating, dient het monster opgevangen en het oppervlak van de agar moeten droog. Giet de verontreinigde kralen in een opvallende collectie bekerglas met 10% chloor.
- Doe nietgooi de parels in de prullenbak! De gebruikte kralen worden gespoeld en geautoclaveerd, opnieuw steriliseren ze voor herhaling gebruik.
- OPMERKING: Als de agar oppervlak nog nat is na het schudden drie keer, laat de plaat te zitten voor een paar minuten toe te staan om de vloeistof te worden geabsorbeerd door de agar, dan herhaalt u de stappen # 4-6 tot aan het plaatoppervlak droog lijkt.
- Keer de plaat voor incubatie.
5. Zachte agar Overlay Procedure: vorming van plaques voor Isolatie en telling van de faag (plaque assay)
Deze techniek wordt gebruikt om te detecteren en te kwantificeren bacteriofaag (faag) of bacteriële virussen die in grootte variëren van 100 tot 200 nm. Elektronenmicroscoop nodig om afzonderlijke faagpartikels zien. Echter, de aanwezigheid van infectieuze faagdeeltjes worden gedetecteerd platen op een agarplaat (figuur 7A). Fagen kunnen niet repliceren buiten hun gastheer bacteriële cellen, zodat voortplanting eend detectie vereist mengen fagen en gastheercellen elkaar voorafgaand aan de beplating. Voor zachte agar overlay procedure wordt een kleine hoeveelheid, in het algemeen in het bereik van 50 pi aan 200 ul van een faag suspensie overgebracht in een buis met ongeveer 10 8 bacteriën (gastheercellen) die gelijkmatig gedispergeerd in 2,5-3,0 ml zachte (0,5 tot 0,7% [w / v]) gesmolten voedingsagar. Het verkregen mengsel wordt uitgegoten op het oppervlak van een vaste (1,5 tot 1,9% [w / v]) voedingsagar plaat. De plaat is voldoende geschud dat de zachte agar het gehele oppervlak van de vaste agar omvat. Daarna wordt de plaat wordt geplaatst op een vlakke ondergrond tot aan de bovenste laag agar tijd heeft gehad om te stollen en vervolgens kan worden geplaatst in de incubator.
Na verloop van tijd een bewolkte suspensie van bacteriële cellen, aangeduid als een gazon, zichtbaar in de zachte agar medium (figuur 7B). Plaques ontstaan als een faag infecteert een van de bacteriële cellen, repliceert binnen ee cel, dan lyseert de cel loslaten maar liefst 100 nakomelingen fagen (ook bekend als de burst-formaat). De nieuwe faagdeeltjes diffunderen in de zachte agar, infecterende bacteriën in de omgeving van de gelyseerde bacteriecel. Na meerdere cycli van de infectie en lysis, de bewolkte bacteriële celsuspensie in de zachte agar verdwijnt, waardoor een zone van open plek heet een plaque. Elke plaque meer dan 10 9 faagdeeltjes, alle genetisch identiek aan het origineel infectieuze faagdeeltje. Omdat plaque ontstaat uit een faagdeeltje, kan de resulterende aantal plaque vormende eenheden (pfu) geteld en wordt de oorspronkelijke concentratie of de titer van de faag suspensie kan worden berekend. Dit type experiment genoemd plaque assay, biedt ook wetenschappers een gestandaardiseerde manier om een stap groeicurves genereren, gastheerbereik specificiteit te onderzoeken en bacteriële cellen te transduceren genetische experimenten.
- <strong> Bereid de indicator bacteriën: een exponentieel groeiende cultuur van de bacteriële gastheer stam moet worden voorbereid voor de zachte agar overlay experiment. Elke host heeft zijn eigen groei eisen. 0,3 ml en 0,5 ml van een suspensie van indicator bacteriën voor elke plaat. Als een fles indicator bacteriën is bereid (bijvoorbeeld 25 ml), moet de cultuur worden onderverdeeld in kleinere porties (bijv. 5 ml aliquots op steriele schroef-capped-buizen) aan de mogelijkheid van kruisbesmetting te minimaliseren. De buizen kunnen worden op ijs gehouden (bij 4 ° C) tot gebruik in het experiment. Gebruik aseptische techniek om steriele voedingsoplossing bouillon enten dan incubeer volgens de specificaties van de bacteriestam. Overgebleven culturen worden die aan het einde van de dag.
- Bereid adsorptie buizen: Plaats twee steriele microcentrifugebuizen in een rack. Label het deksel van de eerste buis "Faag" en het deksel van het tweede buisstuk "Controle".
- Typischly seriële verdunningen van faag lysaten bereid en uitgeplaat in welk geval extra reactievaatjes worden toegevoegd aan de rek en voorzien de verdunningsfactor.
- Faag bestanden worden gemaakt uit een vers plaques en bewaard bij 4 ° C. Om faagpartikels splitsen, moeten de voorraden worden opgewarmd tot omgevingstemperatuur voor het uitvoeren van een experiment.
- Faag voorraden moet voorzichtig worden behandeld - niet vortex of pipet krachtig.
- Voeg 50 pi van faag monster naar de eerste buis voeg 50 pi van faag buffer van de tweede buis, dat als negatieve controle voor de plaque assay.
- Gebruik aseptische technieken alle manipulaties van faag en bacteriën.
- Voeg vervolgens 500 pi van indicator bacteriën aan elke adsorptie buis.
- Bacteriële cellen naar de bodem van een buis als zittend op ijs of bank lange tijd. Als de cultuur niet door elkaared voor het verwijderen van een aliquot van het experiment, onvoldoende bacteriële cellen wordt overgedragen aan het adsorptiebuisje. Er moet een voldoende aantal bacteriële kolonies gevormd in de zachte agar (dat wil zeggen, een grasveld) voor de detectie van plaques. Gebruik een vortex mixer voorzichtig de indicator bacteriën opnieuw te schorten tot een homogene suspensie voor de overdracht van monsters aan de adsorptie-buizen.
- Meng de bacteriële cellen en faag door voorzichtig flicking de buizen.
- Incubeer de faag / bacteriën mengsel 15-20 minuten (niet langer dan 30 minuten) bij een temperatuur geschikt is voor de indicator stam.
- Bereid voedingsstoffen zachte agar en hard agarplaten: Terwijl adsorptie zich voordoet, plaatst u twee zachte agar-buizen (voorheen gesmolten en bewaard bij 55 ° C) in een verwarmingsblok op uw laboratoriumtafel ingesteld op 46-48 ° C.
- De gesmolten zachte agar moet geëquilibreerd de temperatuur van het verhittingselement gedurende 10-15 minuten. Indien de gesmolten zachteagar zit langer dan 15 minuten, zal het beginnen te stollen en vormt klonten indien zij, gegoten op de harde agar. Indien de gesmolten zachte agar ligt minder dan 10 minuten, zal het te heet wordt opgeteld bij de faag / bacteriën mengsel gastheercellen doden voor platen. Bijgevolg kan een gazon geen deel en weinig of geen plaques kan worden afgelezen.
- Bereid extra zachte agar buizen als plateren seriële verdunningen van de faag lysaat.
- Label de rand van de bodem (niet het deksel) van twee nutriënt vaste agarplaten plaat met tenminste naam, de datum van het type groeimedium en "faag" of "Control" voor de adsorptie buizen.
- Inclusief extra borden aangeduid met de verdunningsfactor als plateren seriële verdunningen.
- De vaste agarplaten moet volledig droog zijn zonder condensatie op het deksel en voorverwarmde tot kamertemperatuur vóór toevoegen van de zachte agar. Indien de platen bij 4 ° C, verwijderen enkele uren of zelfs day voor. Verspreid ze in kleine versprongen stapels niet meer dan 2-3 platen laten drogen. Overmatig vocht in de vaste agar laag zal verdunning van de zachte agar, waardoor faag gemakkelijker diffunderen door de zachte agar bij plaquevorming. Bijgevolg zal plaque vergroten.
- Plaat adsorptie buizen een voor een als volgt: Gebruik een P1000 micropipettor aan de faag / bacteriën mengsel (moet ongeveer 550 ul zijn) aseptisch over te dragen aan een zachte agar buis vervolgens snel te draaien tussen de palmen van je handen om de inhoud te mengen. NIET schudden de buis, zodat luchtbellen worden geïntroduceerd. Houd de tube in je linkerhand, opent u het deksel van een harde agarplaat met je rechterhand en onmiddellijk de volledige inhoud van de buis giet op het oppervlak van een harde agarplaat. Voor het sluiten van het deksel en schud de plaat maar snel aan de gesmolten zachte agar verspreid over het gehele oppervlak van de plaatvoordat deze tijd stollen. Vermijd spatten de gesmolten zachte agar op de zijkanten van de petrischaal. Sluit het deksel.
- Herhaal stap 9 voor adsorptie buizen, een buis op een moment.
- Leg de platen op een vlakke ondergrond en laat ze staan ongestoord tot de zachte agar is gestold.
- Gewoonlijk 30 minuten is voldoende.
- Keren de platen incubatie.
- Meerdere platen kunnen worden gestapeld en aan elkaar geplakt vervolgens omgekeerd voor incubatie.
Na incubatie kunnen de platen worden gecontroleerd plaques. De negatieve controle moet slechts een gazon bacteriën (geen gaten indicatief plaques). Plaques variëren in termen van grootte, vorm en algehele uitstraling. Een bepaald faagtype kan worden geïsoleerd uit een heterogeen mengsel van plaques door zorgvuldig ponsen het centrum van een plaat met een steriele tandenstoker en overbrengen van de inoculum een steriele microcentrifuge tUbe met 100 tot 1000 ul bouillon of faag buffer. Dit lysaat kunnen worden uitgeplaat met de bovenstaande procedure. Tenminste 3 tot 6 opeenvolgende enkele plaque isolatie nodig om een zuivere faag is verkregen. Vaak lysaat moet worden verdund over een groot bereik (10 -1-10 -10) een titer die niet overlappende plaques produceert op een plaat te zoeken. Het aantal is afhankelijk van de grootte van de plaat.
6. Replica Plate Procedure: Overdracht van cellen voor Screening Mutants en Auxotrophs
Deze techniek maakt de vergelijking van celgroei op een primaire plaat secundaire platen, die een middel voor het screenen cellen voor een selecteerbare fenotype. Eerst een primaire of kapitein, plaat geënt met cellen ofwel door spread-plating een verdunning die enkele kolonies produceert of door ze op een plaat in een ruimtelijk patroon aangegeven door raster markeringen. Secundaire platen met media met een groei inhibteuren of media die een bepaalde voedingsstof niet over zijn geënt met cellen van kolonies op de primaire plaat. De ruimtelijke verdeling van kolonies wordt eerst weergegeven door een stuk van fluweel de primaire plaat. Bacteriële cellen hechten aan de fluwelen omdat een grotere affiniteit voor de fluweel dan de agar. De opdruk van cellen op de fluweel wordt overgebracht naar de secundaire platen celgroei die dezelfde kolonie patroon als de primaire plaat. Met andere woorden, het is als het hebben van een rubberen stempel, repliceren het groeipatroon van de ene plaat naar de andere. Deze techniek is voordelig omdat hierdoor een relatief groot aantal kolonies gelijktijdig worden gescreend voor vele fenotypen in een experiment.
- Bereid primaire plaat: Label rond de rand van de bodem (niet het deksel) van een agarplaat met ten minste uw naam, de datum en de aard van de groei medium.
- Markeren een raster op de onderzijde van de plaat metten minste twee gelijke afstand van elkaar verticale lijnen en ten minste twee gelijke afstand van elkaar horizontale lijnen. Nummer de resulterende vierkanten.
- Gebruik een pre-gesteriliseerde tandenstoker om elke vierkante inoculeren met een cel monster. Voor elk monster, schar het midden van het plein. Bedek het hele plein met cellen (figuur 8) of anders de steekproef zal overwoekeren als geïncubeerd en vervuilen omliggende pleinen.
- Elk vierkant wordt ingeënt met een ander monster, afgeleid van bouillon culturen of kolonies op een andere plaat.
- Omkeren en incubeer de eerste plaat, die zal worden gebruikt om verschillende secundaire media inoculeren.
- Inoculeer secundaire platen: Stapel de eerste plaat en alle secundaire platen. Met een marker heeft, een stempel op de oriëntatie van de platen. Zorg het merkteken op de onderzijde van elke plaat, niet het deksel.
- Zorg voor een steriele fluwelen doek en plaats het op de cilinderblok (FIGUUR 9). Zet de fluwelen doek op zijn plaats met de houder. Let op de oriëntatie markering op het blok.
- Het blok moet even groot als de bodem van een petrischaal (10,2 cm diameter) zijn. Het moet komen met een borgring die klemt de fluwelen doek om het blok, terwijl replica plating.
- De fluwelen doek (15,2 x 15,2 cm in het vierkant) moet vooraf worden gesteriliseerd. Stapel 10 of 12 schone pleinen, omwikkelen met aluminiumfolie en plaats deze in de autoclaaf bij 121 ° C op de droge cyclus (de zwaartekracht instelling) gedurende 30 minuten. Voordat ze in een replica plating experiment, zorg ervoor dat ze volledig droog zijn door ze in een warme oven gedurende enkele uren. Merk op dat fluwelen pleinen kan het nodig zijn de-linted met tape voorafgaand aan de sterilisatie.
- Velveteen pleinen kunnen opnieuw worden gebruikt. Na gebruikt schuimrubber vierkantjes zijn ontsmet in de autoclaaf, moeten zij worden gespoeld in gewoon water en opnieuw gesteriliseerd zoals hierboven beschreven.
- De cilindrische blokk en klem worden ontsmet tussen toepassingen met een korte spoelen in 70% (v / v) ethanol of 10% chloor.
- Verwijder het deksel en keer de primaire plaat. Dusdanig dat de oriëntatie op de sjabloon met de markering op het blok. Laat de plaat, zodat het oppervlak van de agar in contact met de schuimrubber doek op de cilindrisch blok. Licht maar gelijkmatig naar beneden drukken met de vingertoppen op de achterkant van de primaire plaat en dan voorzichtig weg omhoog de primaire plaat uit het blok. Plaats het deksel op de plaat.
- De fluweel indruk van cellen uit de primaire plaat kan worden gebruikt om ongeveer 7-8 secundaire geïncubeerd voordat indruk inoculeren met een nieuwe fluwelen moet worden.
- Herhaal stap 7 met elk van de secundaire platen.
- Als een positieve controle, moet de laatste plaat in de serie een agar medium waarin alle geteste stammen te groeien. Zo kunt u bevestigen dat cellen werden overgebracht naar alle secundaire plAtes in de serie. Anders kan geen groei op een bepaalde testmedium worden toegeschreven aan onvoldoende cel overdracht plaats van een fenotype van de stam.
- Om valse positieven te vermijden, moeten de secundaire borden worden besteld van minst tot meest gunstige ondergrond. Anders zou nutriënten worden overgedragen tussen de platen waardoor cellen om te groeien op een ongunstige medium.
- Keer de platen en incubeer.
- Opmerking: Bij de inspectie van de secundaire platen voor de groei, moet u onderscheid te maken tussen groei en een opdruk. Dit laatste is een negatief resultaat.
7. Het schoonmaken van de werkruimte
- Schakel de bunsenbrander vervolgens weggezet alle benodigdheden inclusief culturen op platen of in buizen, extra media en andere reagentia.
- Sta niet toe dat oude culturen, zowel op platen of in buizen, op te stapelen op de laboratoriumtafel of in opslagruimten. Deze monsters, die een belangrijke oorzaak van verontreinigingzoals schimmels en ongewenste soorten bacteriën, worden zo spoedig ze niet meer nodig verwijderd.
- Plaats verontreinigde Labware (handschoenen, pipetpunten, kimwipes), glaswerk (buizen, flessen, flessen), en gevaarlijk afval (bacteriële culturen of faag oplossingen, gebruikte platen) in de juiste afvoer aansluiting. Bij het werken met een niet-pathogene E. coli stam (BSL-1), alleen niet-infectieuze gevaarlijk afval. Bij het uitvoeren van deze zelfde procedure met pathogene organismen (BSL-2 of hoger), is besmettelijk gevaarlijk afval gegenereerd. Ongeacht biohazard classificatie, moet gevaarlijk afval worden geautoclaveerd of gedesinfecteerd voordat het wordt weggegooid. Volg de richtlijnen beschreven in de BMBL (5 e Ed.) Evenals die van uw institutionele Environmental Health and Safety afdeling voor de onmiddellijke en correcte verwerking van biologische gevaren die tijdens een experiment.
- Reinig het werkgebied met een ontsmettingsmiddel.
- Was de handengrondig met antiseptische zeep en warm water voor het verlaten van het laboratorium.
8. Representatieve resultaten
Streep-plaat techniek. Een monster aanvraag strook plating is weergegeven in figuur 1. Deze procedure wordt gebruikt voor het isoleren van bacteriële kolonies van gemengde celculturen en is veruit een van de belangrijkste technieken onder de knie in de microbiologie en moleculaire genetica. Elke kolonie staat voor een populatie van cellen die genetisch identiek zijn. Voor veel toepassingen later is het noodzakelijk te beginnen met een kolonie of zuivere bacteriekweken gegenereerd door het enten media met cellen van een kolonie. Zo kan de morfologie van individuele cellen in een kolonie worden geïnspecteerd behulp van een lichtmicroscoop. Genetische identiteit kan worden toegewezen door de volgorde voor de kleine subeenheid ribosomale RNA gen van genomisch DNA geïsoleerd uit een celkweek begon met een enkele kolonie.En metabole eigenschappen kan worden beschreven door het onderwerpen cellen aan verschillende en fysiologische assays. Alleen door het uitvoeren van deze experimenten met reincultures kan men er zeker van de eigenschappen toegeschreven aan een bepaalde micro-organisme. De resultaten worden niet gestoord door de mogelijkheid dat de cultuur wordt vervuild. Technische fouten kunnen optreden als de steriliteit van het instrument voor de streep de cellen over de plaat niet wordt gehandhaafd tijdens de gehele procedure. Vergeten aan vuur een lus of op te halen een frisse tandenstoker tussen de kwadranten het moeilijk maken om enkele kolonies te verkrijgen. Sommige bacteriesoorten kunnen niet worden geïsoleerd in reincultuur als ze afhankelijk zijn van een coöperatieve vereniging met een andere bacteriesoort voor bepaalde groei eisen. Aangeduid als syntrophs kunnen deze organismen alleen worden gekweekt onder gelijktijdige kweekomstandigheden dus kolonies (of gevormd) altijd bestaan uit twee of meer soorten. Een andere uitdaging voorkomen in het laboratorium bij het uitvoeren van destreak-plaat procedure met bacteriën afkomstig van het milieu monsters is dat cellen de groei kenmerken die afwijken van traditionele laboratorium stammen zoals E. vertonen coli. Een dergelijke bacteriële stammen kunnen kolonies die filamenteuze (in tegenstelling tot strakke clusters van cellen) met takken die verspreid over een groot gedeelte van een agarplaat te produceren, verkalkt en dus ongevoelig voor penetratie door een streak-plaat instrument, of omringd door een kleverige capsule zodat afzonderlijke kolonies worden onderscheiden. Deze kenmerken maken het moeilijk om enkele kolonies te zuiveren door de streak-plate techniek.
Pour-plaat techniek. Met de schenkopening plaat techniek de kolonievorming in de agar en op het oppervlak van het agarmedium aldus een geschikte middelen om het aantal levensvatbare cellen te tellen in een monster. Deze procedure wordt gebruikt in een groot aantal industriële toepassingen. Zo, dit essentieel is voor een afvalwater treatment plant, die verantwoordelijk is voor het opruimen van vloeibaar afval (bijvoorbeeld riolering, het aflopen van storm drains) gegenereerd door huishoudelijke, commerciële en industriële eigenschappen en landbouwpraktijken, om watermonsters te analyseren naar aanleiding van de uitgebreide zuiveringsproces. Gezuiverde afvalwater (niet drinkwater) wordt hergebruikt in verschillende manieren - voor irrigatie van niet-voedselgewassen in de landbouw, voor sanitair spoelen in woningen en in industriële koeltorens - dus moet vrij van chemische en microbiële besmetting. Het drinken van water (drinkwater) moet worden gezuiverd volgens EPA-normen en wordt getest met behulp van microbiologische plating methoden die opsomming van specifieke menselijke pathogenen mogelijk te maken. In figuur 10 zijn kolonies verkregen uit bacteriën cellen aanwezig in een water monster van een openbare drinkfontein. Het is onwaarschijnlijk bacteriële pathogenen geproduceerd deze kolonies, gezien de zuivering maatregelen voor drinkwater, maar microben zijn elkewaar en besmetting met zelfs niet-pathogène stammen alleen worden geminimaliseerd, geen geheel geëlimineerd. Een ander voorbeeld is een farmaceutisch bedrijf nodig heeft om te beoordelen van de mate van microbiële verontreiniging, of biologische belasting, van een nieuw geneesmiddel tijdens de productie, opslag en transport. Door het bemonsteren van het geneesmiddel in verschillende fasen van het proces en uitplaten met gebruikmaking van pour-plaat procedure de microbiële belasting of het aantal contaminerende bacteriën, gemakkelijk kan worden bepaald. Voorzorgsmaatregelen vervolgens kunnen worden bedacht om een minimum te beperken of te elimineren microbiële besmetting. Een van de meest voorkomende technische fouten die optreedt wanneer het uitvoeren van de pour-plaat techniek onvoldoende menging van het monster met de gesmolten agar waardoor kolonies samenklonteren waardoor plaattellingen onnauwkeurig. Een andere veel voorkomende fout is het gieten van de gesmolten agar als het te warm is, het doden van veel van de bacteriële cellen in het monster. Deze fout zal ook van invloed op de nauwkeurigheid van de plaat telt het geven van nummers die onder-ste vertegenwoordigene totale aantal kolonievormende eenheden in het monster.
Spread-plaat Techniek. De verspreiding-plate techniek is analoog aan de pour-plate procedure nuttig te zijn als middel om levensvatbare plaattellingen uit te voeren. Omdat de kolonies met gebruikmaking van het verspreidorgaan plaat techniek worden gelijkmatig verdeeld over het oppervlak van het agarmedium kunnen cellen van individuele kolonies geïsoleerd en gebruikt in de volgende experimentele manipulaties (bijvoorbeeld als entmateriaal een streep-plaat of bouillon cultuur). Drie voorkomende toepassingen waarbij de verspreiding-plate techniek is een belangrijk onderdeel zijn verrijking, selectie en screening experimenten. In alle drie toepassingen kan het gewenst celtype worden gescheiden van het mengsel en later onderworpen aan een aantal biochemische, fysiologische of genetische tests.
Een verrijking experiment gaat plating een gemengde cultuur op een medium of incuberen platen in eMILIEU omstandigheden die de groei van deze micro-organismen in het monster dat de gewenste metabolische eigenschappen, groei kenmerken of gedrag aan te tonen te bevorderen. Deze strategie remt de groei van andere organismen, maar resulteert in een toename van het aantal gewenste micro-organismen ten opzichte van andere in de kweek. Zo, de kolonies die zich vormen op een verrijking plaat waarschijnlijk vertonen fenotypische eigenschappen die de gewenste genotype te geven. Zo zal, indien de doelstelling is stikstoffixerende bacteriën kweken uit milieu monster met een mengsel van meer dan 1000 verschillende soorten bacteriën, dan plating het monster op een stikstof-deficiënte medium verrijkt voor bacteriën die deze verbinding kan produceren van sfeer met behulp van metabole mogelijkheden van een suite van genen die nodig zijn voor de vaststelling stikstof.
Een selectie experiment houdt in plating een gemengde cultuur op een medium dat laat alleen die cellen die conTain een bepaald gen of een set van genen om te groeien. Dit type experiment is gebruikelijk in de moleculaire biologie laboratoria bij het transformeren van bacteriële stammen met plasmiden die antibiotica-resistente genen. Als uw doel is om te kweken alleen recombinante cellen, of degenen die met succes nam het plasmide, dan plating het monster op een medium dat is aangevuld met de juiste concentratie van het antibioticum kiest voor die cellen die weerstand vertonen om dit specifieke drug.
Een screening experiment omvat het plateren een mengcultuur van een medium om alle levende cellen groeien, maar de cellen met de gewenste genotype kunnen worden onderscheiden van andere cellen op basis van hun fenotype. Nogmaals, dit soort experiment is vaak in de moleculaire biologie laboratoria bij het uitvoeren van mutagenese testen of het klonen van genen in plasmiden. Een klassiek bijvoorbeeld zoals weergegeven in figuur 11, maakt gebruik van het lacZ-gen Encoding β-galactosidase, dit enzym kan cellen metaboliseren X-Gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) een substraat analoog zijn natuurlijke substraat, lactose. Splitsing van X-Gal van β-galactosidase resulteert in een onoplosbaar product blauw. Als dus een medium bevat X-gal, en een monster dat cellen met ofwel een wild-type (functionele) of mutant (niet-functionele) lacZ gen uitgeplaat op dit medium, vervolgens na incubatie wild-type cellen die een functionele lacZ gen wordt weergegeven als blauw-gepigmenteerde kolonies, terwijl mutant cellen met een niet-functioneel lacZ-gen zal verschijnen als ongepigmenteerde ("witte") kolonies.
Een technisch probleem ondervonden het vaakst bij de eerste te leren hoe de verspreiding-plate techniek uit te voeren is een ongelijke spreiding van cellen in de agar oppervlak. Bij gebruik van een draaitafel en glasstaaf kan het monster te snel, dat de kolonievorming alleen nabij het midden van de plaat worden opgenomen. Wanneer het doen van de "Copacabana Methode" worden de glazen kralen gedraaid in plaats van geschokt over de agar oppervlak. Bijgevolg veel kolonies groeien langs de buitenrand van de plaat. In beide gevallen de resulterende verdeling van kolonies niet zo te maken van het gehele beschikbare oppervlakte cellen kunnen samen klonteren en groeien tot overlappende kolonies maken plaattellingen onjuiste of onderscheid celtypen onhaalbaar.
Zachte Agar Overlay Techniek. De procedure lijkt op het verspreidorgaan plaat techniek om bacteriële kolonies tellen kan worden stroken van het aantal faag. Overwegende tussen 30 en 300 bacteriële cellen worden verspreid over het oppervlak agar plaattellingen (kve / ml), worden tussen 100 en 400 infectieuze faagdeeltjes gemengd met 10 augustus-10 september gastheercellen voor plaque tellen (pfu / ml) in een laag van zachte agar verspreid over het oppervlak van harde voedingsagar. Tenzij anders wordt aangetoond, wordt algemeen aangenomen thoed een enkele bacteriële cel zich deelt en hoopt zich op grote aantallen genetisch identieke cellen in een cluster genaamd een kolonie. Zoals eerder besproken, deze aanname is niet geldig wanneer de cellen groeien in trossen (dat wil zeggen, paren, tetraden, kettingen, of clusters) of weer te geven groei-eigenschappen, zoals capsules, dat enkele kolonie vorming van de weg staan. Een soortgelijke aanname is voor plaquevorming, dat elke plaque is een activiteit van een faag. Deze uitspraak geldt alleen als een faag infecteert een bacterie. Wat gebeurt er als meerdere faagpartikels infecteren van een enkele bacterie? Dit probleem heeft betrekking op een belangrijke parameter statistische dat moet worden gehouden bij experimenten met faag - multipliciteit van infectie (MOI) - waarin de verhouding van infectieuze faagdeeltjes het aantal gastheercellen in een monster. Omdat sommige cellen adsorberen meerdere faag terwijl andere cellen adsorberen geen of slechts een faag, moet populatie gastheercellen worden geïnfecteerd bij een lage MOI (≤ 1) to minimaliseren van de kans dat een cel geïnfecteerd met meer dan een faagdeeltje. Gebruikmakend van de plaque-vormende eenheid (PFU) als een functionele definitie voorkomt deze complicaties bij het uitvoeren van plaque telt om de titer van een faag voorraad te berekenen.
Zoals weergegeven in figuur 12 plaque morfologie verschilt per faag. Sommige faag genereren kleine platen (paneel A) en andere leiden tot grote platen (B). Een aantal variabelen invloed hebben op plaque grootte. Er zijn technische redenen die bijdragen aan deze variatie. Zo compleet medium en dikke vaste agar steun ontwikkeling van grotere plaques omdat gastheercellen kunnen houden faag groei langere tijd. Een hoge plating dichtheid van gastheercellen (> 10 9 kve per plaat) zal leiden tot een vermindering van de plaque grootte. Nog lagere concentraties zachte agar zal de snelheid van faagdeeltje diffusie in de zachte agar en daardoor de omvang van plaques. Recall eop deze toegenomen diffusiesnelheid kan onbedoeld optreden als de harde agar platen zijn niet volledig droog, zodanig dat condensatie of overtollig vocht in de schaal verdunt de zachte agar-agar in de overlay. Deze technische controle produceert tegenstrijdige resultaten met betrekking tot plaque grootte een bepaald faag.
Plaque grootte ook betrekking heeft op een aantal gastheercel gebeurtenissen zoals het rendement van adsorptie, de duur van de latentietijd (de tijdspanne van faag adsorptie aan lysis van de gastheercel) en de burst (het aantal nakomelingen vrijgegeven een infectie). Een heterogeen mengsel van plaque afmetingen worden waargenomen als faagdeeltjes gastheercellen infecteren in verschillende fasen van bacteriële groei. Zo, die adsorberen tijdens de vroege exponentiële fase maken grotere plaques met meer nakomelingen faag dan die adsorberen in de laat-exponentiële fase. Als algemene regel geldt, lytische fagen te produceren heldere plaques, terwijl lysogene faag vorm troebel plaques. HoWever, sommige lytische fagen te produceren interessante patronen zoals "bull's eye 'van de plaque in figuur 12B. Deze heldere plaques zijn omgeven door een troebele halogeen omdat de cellen aan de rand van de plaat niet volledig gelyseerd of kunnen tegen infectie faag. Een 'schot in de roos "patroon waargenomen met gematigde faag is een plaquette met een troebele centrum omgeven door een heldere ring. Dit weerspiegelt de morfologie MOI en de fysiologie van de gastheercel met betrekking tot de lysis-lysogeny beschikking. Wanneer de cellen eerst worden geïnfecteerd met faag, de MOI is laag en cellen groeien snel omdat voedingsstoffen zijn er in overvloed, samen dit vergemakkelijkt lytische groei. Naarmate meer en meer cellen worden gelyseerd, de MOI verhoogt en een duidelijke plaque vormen. Lysogens in het centrum van de plaat echter groeien omdat ze immuun lysis waardoor een duidelijke plaat met een troebele centrum.
De overlay techniek kan worden aangepast voor plaque assays met eukaryote virussen. Indezelfde wijze bacteriofaag vorm plaques op een veld van bacteriële cellen in zachte agar, eukaryotische virus vormen plaques een monolaag van cellen onder een gel. Een monolaag een confluente vellen van cellen groeien naast elkaar op het oppervlak van een kweekschaal elkaar raken maar groeien niet boven elkaar. Voor het uitvoeren van dit soort plaque assay, worden monsters van het virus toegevoegd aan gevoelig monolagen van eukaryote cellen. Vervolgens monolaag is bedekt met een agarose-gebaseerde voedingsmedium - dit gel beperkt de verspreiding van nakomelingen virussen zich van geïnfecteerde cellen aangrenzende cellen in de monolaag. Bijgevolg wordt een bolvormig gedeelte of plaque geproduceerd dat cellen bevat beschadigd door afgifte van virions. Om visualisatie van de plaques, kleurstoffen vlek levende cellen kan worden toegepast voor de celcultuur die contrast tussen geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen te bevorderen.
De zachte agar overlay techniek wordt gebruikt voor proeven anders dan plaque assays. Ten eerste is deignificant om te onthouden dat de harde voedingsagar is een dragermatrix dat de groei van bacteriën mogelijk maakt. Ten tweede kan de zacht-agar voor de overlay een andere voedingssamenstelling dan de vaste agar. Op deze wijze kan de zachte agar als middel om assay bacteriestammen voor verschillende groeikarakteristieken en metabolische eigenschappen. Zo wordt de overlay techniek die gebruikt wordt om te screenen bacteriën voor de mogelijkheid om cellulose (Teather en Wood 1982) af te breken. Enkele kolonies gekweekt op een niet-selectieve vaste agar medium dan zachte agar die 0,1% (w / v) carboxymethylcellulose (CMC) wordt over het oppervlak van de vaste agar. Na incubatie worden de platen overspoeld vlek die visualisatie van zones van clearing maakt om de kolonies in zachte agar. Het wissen is door hydrolytische enzymen afgescheiden door de bacteriën afbreken van de cellulose in het medium. Meer recentelijk heeft de overlay techniek gebruikt om bacteriën die de groei van methanoge remmen detecterennic Archaea gevonden in de pens van dieren (Gilbert et al.. 2010). Bacteriële isolaten van milieu-monsters worden gekweekt op een harde agar voedingsbodem dan kolonies worden overlayed met soft-agar met een cultuur van methanogenen. Na incubatie worden de platen gecontroleerd zones van groeiremming rond de kolonies. Deze methode geeft bacteriestammen die remmers van de methanogenen in de zachte agar te produceren.
De meest voorkomende technische fouten die zich voordoen met de soft-agar overlay-techniek zijn het gieten van de gesmolten soft-agar of als het te warm of te koud. Als het te warm is, de bacteriële cellen gemengd in het medium zullen voorafgaand gedood om plating. Als het te koud, dan is de soft-agar vormt klonten indien zij, gegoten op de harde agar. In beide gevallen zullen de resultaten zijn niet eenduidig of onleesbaar zijn op zijn best.
Replica-plaat voor de procesvoering. Overdracht van culturen van de ene soort voedingsbodemnaar een andere om te testen groei van eisen wordt het heel bewerkelijk als er meer dan alleen maar een paar stammen. Replica-plating is een methode die gelijktijdig screenen van een groot aantal micro-organismen mogelijk maakt. Bijvoorbeeld, na mutagenizing een cultuur van wild-type cellen kan worden uitgespreid-plaat verdunningen van de cultuur platen verkrijgen met afzonderlijke kolonies. De primaire platen bevatten een middel dat de groei van cellen ondersteunt met wild-type prototrofen, dat alle verbindingen vereist groei synthetiseren en mutant auxotrophs, die een mutatie in een biosynthetische route waardoor ze geen bijzondere verbindingen essentieel voor de groei synthetiseren dragen. Door plateren het mengsel van cellen op een compleet medium, de ontbrekende nutriënten worden vanuit de omgeving. Om onderscheid te maken tussen prototrofen en auxotrophs, de kolonies kunnen worden gerepliceerd op een minimaal medium. Alleen prototrofen in staat zal zijn om te groeien. Omdat het ruimtelijk patroon van de primaire plaat wordt bewaard, compariseen van de secundaire plaat met de primaire plaat maakt de identificatie van de mutant kolonies. Om te bepalen welke verbinding de mutanten niet meer in staat synthetiseren, door de kolonies herhaald op minimaal medium aangevuld met specifieke verbindingen (bijvoorbeeld aminozuren, koolstofbron, vitaminen, enz.). Op deze wijze kan honderden kolonies worden gescreend tegelijkertijd met de replica-plaat procedure. Een technische fout die kunnen optreden is het gebruik van agar-platen die zijn te nat, waardoor de kolonies te smeren elkaar besmetten alle culturen op de plaat. Dit geeft resultaten die volledig betrouwbaar. Een andere technische fout is de toepassing van te veel druk bij het overbrengen van cellen van de fluwelen naar de secundaire platen. Ook na incubatie de tweede platen, kan de resulterende kolonies overlappen die de groei fenotypen toegeschreven aan verontreinigingen niet auxotrofie.
Niet alle wild-type microbiële soorten prototrofen, zodat de replica-plaat procedure kan worden gebruikt om gelijktijdig screenen verschillende wild-type stammen voor karakteristieke groei eisen. Zoals getoond in figuur 13 "dotten" cellen vier Pseudomonas bacteriële stammen werden uitgeplaat in tweevoud een raster-gemarkeerde plaat met complete media genoemd YTA (paneel A). De stammen werden vervolgens herhaald op drie secundaire platen (panelen B, C en D), bestaande uit minimaal medium (MSA), aangevuld met een andere koolstofbron (aceetamide, lactose en glycine, respectievelijk). De resultaten tonen dat twee van de stammen Pseudomonas vier (P. aeruginosa en P. stutzeri) niet in staat groeien op deze drie koolstofbronnen. Als controle werden de stammen herhaald op kwart plaat met YTA medium te bevestigen cellen werden overgebracht in de procedure. Omdat alle vier de stammen groeien op de YTA control plaat, de groei tekortkomingen tentoongesteld op de vorige drie platen in de serie zijn betrouwbaar. De replica-plating resultaten zijn vermeld in tabel 1. Een fout vaak gemaakt wordt de interpretatie van een afdruk van de groei op een secundaire plaat als een positief resultaat. Vergelijk bijvoorbeeld het fenotype van P. aeruginosa die van P. stutzeri op MSA + acetamide (B). Dit laatste wordt een afdruk van de groei, een negatief resultaat, en kan optreden als voedingsstoffen uit de voorgaande plaat worden overgedragen met de ouder cellen. Geen groei van nieuwe cellen wordt veroorzaakt door het ontbreken van voedingsstoffen zijn niet beschikbaar voor nageslacht cellen. Het is gemakkelijk te verwarren een afdruk met de werkelijke groei. In geval van twijfel moet het experiment herhaald worden met behulp van een alternatieve methode, zoals streak-plating cellen van de primaire plaat op secundaire media.
Figuur 1. Voorbeeld afzonderlijke kolonies op een plaat. De roze bollen in het midden van de plaat zijn kolonies van Serratia marcescens, een Gram-negatieve, staafvormige Proteobacterium in de familie Enterobacteriaceae. Door de voorkeur vochtige omgeving dit microorganisme gewoonlijk aangetroffen in de hoeken van badkuipen, in spoelbak bassins, in tegel specie, en douchegordijnen. S. marcescens is gemakkelijk te herkennen, omdat het zorgt voor een rood pigment genaamd prodigiosin. De kolonies op deze plaat werden gegenereerd met de streep-plaat techniek, afzonderlijke kolonies verschijnen in het vierde kwadrant na incubatie bij 30 ° C gedurende 24 uur. De andere drie kwadranten tonen samenvloeiing groei in welke cellen afgezet op het agar oppervlak ontwikkeld tot overlappende kolonies.
Figuur 2. De werktuigen die voor streak-plate techniek. Van boven naar beneden, blijkt zijn tandenstokers (afgeplatte niet rond), een draad lus, een wegwerp plastic lus, en houten stokken. Tandenstokers typisch overgebrachteen kleine glazen beker met de brede kant naar beneden vervolgens bedekt met een folie als geautoclaveerd vóór steriliseren om te gebruiken. Houten stokken worden overgebracht naar 18 mm reageerbuisjes vervolgens geautoclaveerd te steriliseren voor gebruik.
Figuur 3. (A) Streak-plate techniek met behulp van het kwadrant methode. Een vooraf gesteriliseerde lus wordt stick tandenstoker gebruikt om het monster verspreid over een kwart van de agar oppervlak met een snelle, gladde, heen en vierde beweging van de rand naar het midden van de plaat. Deze actie wordt herhaald voor elk van de vier kwadranten van de plaat. Na incubatie celgroei wordt aan de baan van het instrument om de cellen op de plaat te deponeren. Mechanische scheiding van cellen in een mengmonster deze techniek moeten resulteren in afzonderlijke kolonies in het vierde kwadrant (zie figuur 1 een voorbeeld). Enkele kolonies worden genoemd kolonievormende eenheden (CFU). (B) Wanneer een metalen lus wordt gebruikt voor strook-plating moet worden gesteriliseerd de vlam van een Bunsen-brander voor contact met het inoculum of agar medium. Bedenk dat het heetste deel van de vlam is het topje van de blauwe kegel. Pak de handgreep van het instrument, plaats de draad in de vlam ongeveer 3-4 cm van de lus. Laat het lang genoeg voor de draad te worden roodgloeiend. Verplaats de draad, zodat de vlam nadert de lus. Zorg ervoor dat de metalen lus wordt afgekoeld voordat u het inoculum.
Figuur 4. Pour-plaat techniek. (A) Een kleine hoeveelheid van het monster (tussen 0,1 tot 1,0 ml) wordt aseptisch overgebracht in een lege, maar steriele petrischaal met het gebruik van een 5,0 ml serologische pipet. (B) Gesmolten agar geëquilibreerd met een temperatuur van ongeveer 48 ° C wordt vervolgens uitgegoten in de Petrischaal met het monster. Na sluiten van het deksel wordt de plaat zachtjes gewerveld om het monster te mengen engesmolten agar. De agar mag stollen ongeveer 30 minuten daarna platen omgekeerd voor incubatie.
Figuur 5. Spread-plaat techniek met een draaitafel en glazen strooier. Nadat de agar plaat wordt op een draaitafel, een kleine hoeveelheid monster (0,1 tot 0,2 ml) wordt aseptisch afgegeven op het midden van de plaat met een micropipettor. De spreider wordt gesteriliseerd door dompelen in een bekerglas van ethanol vervolgens door de vlam van de brander Bunsen overmaat ethanol ontsteken. Alvorens contact met het monster moet de inrichting worden gekoeld raken de agar bij de rand van de plaat. De strooier wordt voorzichtig heen en weer bewogen door het monster over de plaat, terwijl de draaitafel langzaam draaien. Deze actie maakt een geleidelijk, maar gelijkmatige verspreiding van het monster over de agar oppervlak. Na het sluiten van het deksel, moet de plaat worden ingesteld op de bank boven undisturbed minstens 5 minuten om het monster volledig absorberen in de agar voor het omkeren van de plaat voor incubatie.
Figuur 6. Spread-plaat techniek met glazen kralen (Copacabana-methode). Glasparels die vooraf zijn gesteriliseerd in een autoclaaf worden gegoten op het oppervlak van een agarplaat zitten op het tafelblad. Een kleine hoeveelheid monster (100 tot 150 pi) wordt aseptisch aangebracht op het midden van de agar met een micropipettor. Met het deksel van de plaat gesloten horizontaal schudden beweging wordt gebruikt om beweeg kralen heen en weer over de plaat 6 tot 7 keer, de verspreiding van het monster. Deze actie wordt herhaald na het draaien van de plaat 60 °. Het schudden beweging wordt herhaald voor de derde keer na een andere 60 ° rotatie. Nadat het monster volledig opgenomen in de agar medium, worden de korrels afgegoten in een beker die 10% bleekmiddel. Deplaten vervolgens omgekeerd voor incubatie.
Figuur 7. Zachte dekagar techniek voor het isoleren en noemen faag gebaseerd op de vorming van plaques (ook wel plaque assay). (A) De aanwezigheid van faag kan worden gedetecteerd zones van clearing of plaques op een confluente suspensie van bacteriële kolonies groeiend in de zachte agar. Faag T4 is een virulent, dubbelstrengs DNA faag dat zijn gastheer, Escherichia coli, waardoor de gastheercellen te lyseren en laat nageslacht faag infecteert. Na meerdere ronden van infectie en lysis, de naburige E. coli-cellen in de directe omgeving van het oorspronkelijke geïnfecteerde gastheercel verdwijnt het verlaten van een plaquette met daarin miljarden T4 faag deeltjes. Faag T4 produceert plaques die ongeveer 1 mm in diameter. In dit experiment, 200 pi van een 10 -5 verdunning van een 2 x 10 8 pfu / ml voorraad faag T4werd gemengd met ongeveer 300 pi E. coli-cellen indicator bereid als een exponentiële, beluchte kweken bij 37 ° C. Zowel de faag en bacteriën werden toegevoegd aan een EHA zachte agar buis gemengd, daarna uitgegoten op het oppervlak van een vaste EHA agarplaat. Merk op dat het niet nodig was om faag en bacteriën vóór hecht het zich aan plating in dit geval. Nadat men de zachte agar ongestoord stollen 20 minuten werden de platen omgekeerd en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 24 uur. (B) Aangezien infecteren faagdeeltjes, bacteriegroei resulteert in een bewolkte celsuspensie in de zachte agar waarin discrete kolonies niet zichtbaar. In plaats daarvan nog gazon van bacteriële cellen, in dit geval E. coli, vormen de gehele zachte agar laag.
Figuur 8. Voorbereiding van de primaire plaat (master) met bacteriële monsters. Om georganiseerd monsters houden, kan de bodem van de plaat worden aangebracht in een raster en de resulterende vierkanten genummerd. Elk monster kan worden toegewezen aan een vierkant op de grid. Afgebeeld zijn voorbeelden van juiste versus onjuiste inoculatie patronen. Idealiter wordt een klein aantal cellen overgebracht naar het midden van het vierkant met een steriele inoculatie gereedschap zoals een tandenstoker "schar" het monster (cel # 4). Vaak inoculatie fouten, zoals afgebeeld in cel # 5 ("patch") en cellen # 6 ("vullen") resulteren in een toename van bacteriële monsters na incubatie daarmee contaminerende aangrenzende velden.
Figuur 9. Replica-plate techniek die gebruikt wordt om cellen van lager naar secundair platen voor fenotype-schermen over te dragen. De markering op de primaire plaat is uitgelijnd met de markering op de fluwelen overdekte blok dan Lowe rood om de agar oppervlak het doek contact. De cellen worden overgebracht van de plaat naar de fluwelen door licht, maar gelijkmatig naar beneden te drukken op de primaire plaat met vingertoppen. Deze actie laat een afdruk van de cel monsters op de fluwelen in hetzelfde ruimtelijk patroon als de primaire plaat. Dezelfde procedure wordt gebruikt om cellen te dragen van de schuimrubber een tweede plaat. Maar liefst 7-8 secundaire platen kunnen worden ingeënt met dezelfde primaire plaat indruk op de fluwelen. De laatste plaat geënte van de fluwelen moeten dienen als een positieve controle. Het moet een medium dat de groei van alle geteste stammen ondersteunt, zodat voldoende cel overdracht plaats de gehele reeks platen zijn. Na de incubatie kan de bijkomende platen worden gecontroleerd en scoorde voor de groei ten opzichte van geen groei. Zo kunnen meerdere bacteriestammen gelijktijdig worden gescreend op verschillende groeimediums in een experiment.
_upload/3064/3064fig10.jpg "/>
Figuur 10. Voorbeeld resultaat met behulp van pour-plate techniek. Een 1,0 ml monster van water afkomstig van een openbare drinkfontein werd afgegeven in een steriele lege petrischaal. Dan gesmolten maar afgekoelde YTA werd uitgegoten in de schotel met het monster. De agar bevatte ook 100 ug / ml cycloheximide om de groei van gisten en schimmels die aanwezig zijn geweest in het watermonster te voorkomen. Na het voorzichtig schudden om te mixen, werd de plaat gezet op een vlakke ondergrond en de agar mocht helemaal stollen. De plaat werd geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 48 uur. Getoond wordt het resultaat van dit experiment. Merk het verschil in het uiterlijk van het oppervlak koloniën groot en rond zijn in vorm, versus ondergrond kolonies, die zeer kleine onregelmatig vorm omdat het verharde middel remt kolonie spreiding in ondergrond.
Figuur 11. </ Strong> Voorbeeld resultaat met behulp van spread-plate techniek. De "Copacabana Method" werd gebruikt om een mengsel van plaat E. coli cellen voor een screening experiment. In dit geval groeimedium (LB) X-gal bevatten, dus die cellen die een functionele β-galactosidase-enzym vormen blauwe kolonies terwijl de cellen een mutatie in het lacZ-gen en dus niet een functionele β-galactosidase-enzym vorm uitdrukking witte kolonies. Vaak aangeduid als "blauw / wit screen", kunnen de twee typen kolonies worden onderscheiden van elkaar op dezelfde plaat.
Figuur 12. Voorbeeld gevolg van plaque assay gebruik van soft-agar overlay techniek. Getoond zijn plaques gevormd op de gastheerstam Mycobacterium smegmatis mc 2 155 (ATCC 700.084) volgens twee verschillende phleeftijden: (A) Mycobacteriophage Destroyers en (B) Mycobacteriophage MSSS. Deze faag werd geïsoleerd door studenten in het UCLA practicum MIMG 103L in het voorjaar van 2010. M. smegmatis is een niet-pathogene Actinobacterium en behoort tot een familie van mycobacteriën dat een paar ziekteverwekkers waarvan bekend is dat ernstige ziekten zoals tuberculose (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) en lepra (M. leprae) veroorzaken omvat. Ongeveer 50 ul van een 10 -2 verdunning van Destroyers en 10 -3 verdunning van elk MSSS werden geïncubeerd met 500 pi M. smegmatis gedurende 20 minuten bij 37 ° C daarna gemengd met MBTA (zachte agar) en uitgegoten op MHA (vaste agar) platen. Nadat men de zachte agar ongestoord stollen 20 minuten werden de platen omgekeerd en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 48 uur. Let op de afzonderlijke plaque morfologieën door elk faag. Destroyers (A) vormt kleine (gemiddelde diameter van ongeveer 1 mm), heldere plaques kenmerkend een lytische faagterwijl MSSS (B) ontwikkelt grote "schot in de roos" plaques met duidelijke centra omgeven door een troebele halo (gemiddelde diameter van ongeveer 3,2 mm). De wazige ring kan bestaan uit bacteriën die resistent zijn tegen infectie faag. Dit patroon is verschillend van die gevormd door lysogene faag die troebele plaques produceren.
Figuur 13. Voorbeeld resultaat met behulp van replica-plate-procedure. Vier Pseudomonas stammen (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens en P. stutzeri) getest in tweevoud voor groei op drie verschillende koolstofbronnen: acetamide, lactose en glycine. (A) De eerste plaat is een compleet medium (YTA) geïnoculeerd met de vier stammen zoals aangeduid. Na incubatie bij 30 ° C gedurende 24 uur, vier stammen groeien YTA. De primaire plaat werd gebruikt om de replica plaat op minimaal medium (MSA), aangevuld met een koolstofbron: acetamide (B), lactose (C) en glycine (D). De laatste plaat in de reeks een positieve controle YTA plaat (E). Zoals getoond is de stammen tonen variabele groeipatronen na incubatie op de secundaire platen. Merk op dat het soms moeilijk is om onderscheid te maken tussen groei en een afdruk van cellen. Bijvoorbeeld, vergelijk de afdruk die door P. stutzeri op de drie MSA platen tot geen groei op dezelfde drie platen door P. aeruginosa. Beide zijn negatief in vergelijking met de groeipatronen vertoond door P. putida P. fluorescens. Echter, alle stammen groeien op de positieve controle plaat bevestigd cellen werden overgebracht naar alle secundaire platen in de reeks. De resultaten van dit experiment zijn weergegeven in Tabel 1.
| YTA (Primaire) | MSA + aceetamide | MSA + lactose | MSA + glycine | YTA (Controle) | |
| P. aeruginosa | + | - | - | - | + |
| P. putida | + | + | + | + | + |
| P. fluorescens | + | + | + | + | + |
| P. stutzeri | + | - | - | - | + |
Tabel 1. Samenvatting van de replica plating resultaten. De groei aangeduid als plusteken (+) en geen groei voorgesteld als minteken (-). YTA is een compleet medium (gist trypton agar) en MSA is een minimaal medium (minimaal zouten agar). De platen werden MSA aangevuld met een koolstofbron zoals aangegeven.
Discussion
Kweken organismen omvat een aantal platen methoden, die vereisen dat aseptisch worden gehouden tijdens de manipulatie van cellen en media. Vijf verschillende procedures zijn beschreven in dit protocol. Hoewel deze platen technieken worden gewoonlijk gebruikt om bacteriën en faag manipuleren, ze kunnen ook worden toegepast om zoogdiercellen cultuur eukaryotische micro-organismen algemeen gebruikt in Molecular Genetics, zoals gist (bv., Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), algen en protozoa ( dat wil zeggen, Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium), en nematoden (dat wil zeggen, Caenorhabditis elegans). Er zijn ook tal van (en zelfs meer geavanceerde) variaties van elke plating methode, afhankelijk van de experimentele doel of organisme onder studie. Het is dus niet alleen belangrijk om de meest geschikte techniek een bepaald experiment of doel micro maar ook het aanpassen van de methode zoals tde hoed van de experimentele resultaten voldoende in op de onderzoeksvraag of probleem.
Enkele van de meest actuele toepassingen van de beplating technieken die in dit protocol te betrekken technologische vooruitgang die high-throughput resultaten voor screening en drug discovery experimenten opleveren. Bijvoorbeeld, genoom centra gebruik maken van de "Copacabana Methode" voor spread-plating kloon bibliotheken, die zijn E. coli getransformeerd met plasmiden met DNA-fragmenten uit het genoom van een micro-organisme. Omdat tientallen grote platen (de zogenaamde bioassay trays) worden bereid in een keer, is een geautomatiseerd plaat shaker gebruikt om de glazen kralen schud gedurende de hele partij van trays. Bovendien, bij de selectie van kolonies van deze platen na incubatie, wordt een robot kolonie picker gebruikt om cellen uit passende kolonies als inoculum voor LB bouillon in 384-wells microtiterplaten te verzamelen. Voor deze high-throughput screening assay, de procedurele beginselen van de spread-plaat techniek toe te passen, maar technologie maakt het mogelijk verschillende stappen worden geautomatiseerd en aangepast aan een groot aantal monsters om gelijktijdig en binnen een kort tijdsbestek worden geanalyseerd mogelijk te maken.
Biotechnologische en farmaceutische bedrijven investeren veel middelen in de ontwikkeling van high-throughput technologie voor de meest basale technieken in de microbiologie en moleculaire genetica. Zo zijn er multi-channel micropipettors om het volume transfers uit te voeren voor maximaal 8 of 12 monsters in een keer. Er zijn zelfs robot werkstations die manoeuvre een 96-kanaals pipet hoofd! Deze inspanningen omvatten multidisciplinaire teams van wetenschappers, koppelen biologen dat methodologische expertise bezitten met ingenieurs en programmeurs die de instrumentatie die nodig zijn om de mechanische werkzaamheden in verband met de experimenten uit te voeren te ontwikkelen. Ongeacht de onderzoeksaanvraag, het doel gedeeld wordt door bedrijven de ontwikkeling van deze technologieën is hetzelfde - te automatiseren laboratoriary processen, tools, systemen en instrumenten, waardoor ze minder arbeidsintensief en efficiënter te maken.
Disclosures
Ik heb niets te onthullen.
Acknowledgments
Met dank aan Cori Sanders op Iroc Ontwerpen voor het bereiden van illustraties en aan Kris Reddi en Bhairav Shah aan de UCLA voor het opzetten van monster culturen en helpen met cijfers. De financiering voor dit project werd verzorgd door HHMI (HHMI Grant nr. 52006944).
Materials
1. Yeast Tryptone Agar (YTA)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. If preparing tubes for the pour-plate procedure, allow the agar to cool to ~55°C then add 2.0 ml of 50 mg/ml cycloheximide. Aseptically dispense 18.0 ml of the melted agar per 18 mm tube then store at 4°C. The agar will solidify and will need to be melted in a steamer or microwave prior to use. 2. Minimal Salts Agar (MSA) + 0.1% (w/v) carbon source
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. * Carbon sources used for experiments presented in Figure 13 include acetamide, lactose, and glycine. ** Trace salts solution is prepared in 0.1 N HCl as follows. It is added to the base before sterilization (autoclave at 121°C for 20 minutes).
3. EHA soft agar (0.65 % w/v)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. 4. EHA hard agar (1.2% w/v)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. 5. 1X Middlebrook Top Agar (MBTA soft agar, 0.5% w/v)
Melt 50 ml of 2XTA and allow it to cool to ~55°C. Using aseptic technique, add the CaCl2 and 7H9 broth to the melted agar. Aseptically dispense 4.5 ml of the mixture per 13 mm tube and store in a 55°C incubator ≤7 days. Cooling MBTA to room temperature or 4°C will cause the CaCl2 to precipitate out of solution. * 100 mM CaCl2. stock must be stored at room temperature to prevent CaCl2 from precipitating out of solution. ** 7H9 liquid medium: Neat
Mix the base with water then add the glycerol while stirring. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. *** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1.0% w/v)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Dispense 50 ml aliquots into 100 ml bottles and store at 4°C. 6. Middlebrook 7H10 Agar Plates (MHA hard agar, 1.9% w/v)
Mix the agar base with water then add the glycerol while stirring. Heat the solution to boiling then stir for one minute to completely dissolve the base powder. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add the following reagents:
* AD supplement
Filter-sterilize this solution; do not autoclave. Store at 4°C. ** Filter-sterilize and store these solutions at 4°C for ≤60 days. 7. LB agar (1.5% w/v) + X-Gal (60 μg/ml)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add 3.0 ml of 20 mg/ml X-Gal solution. Freshly prepare X-gal stock by dissolving 400 mg X-Gal in 20 ml dimethylformamide (DMF). Table of specific reagents:
Table of specific equipment:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1998).
- US Department of Health and Human Services (DHHS). Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th, U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm (2009).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., Hirsch, M. S., Melnick, J. L., Monath, T. P., Roizman, B. Fields Virology. 1, 2nd, Raven Press. New York, NY. (1991).
- Gilbert, R. A., Ouwerkerk, D., Zhang, L. H., Klieve, A. V. Cooperative Research Center for Beef Genetic Technologies. In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens. Journal of Microbiological Methods. 80, 217-218 (2010).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. BioTechniques. 23, 648-650 (1997).
- Karam, J. D. Molecular Biology of Bacteriophage T4. , ASM Press. Washington, DC. (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E. Fundamental Virology. , 4th, Lippincott, Williams, and Wilkins. Philadelphia, PA. (2001).
- Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).
- Miller, J. H. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and related bacteria. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1992).
- Mills, K. V., Gareau, J. R., Garcia, A. M. Low-cost modification to the Copacabana method for spreading transformation mixtures. BioTechniques. 39, 188 (2005).
- Jordan, T., et al. RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual. , Howard Hughes Medical Institute. (2008).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
- Sanders, E. R., Miller, J. H. I. Microbiologist: A Discovery-based Course in Microbial Ecology and Molecular Evolution. , ASM Press. Washington, DC. (2010).
- Slonczewski, J. L., Foster, J. W. Microbiology - An Evolving Science. , 2nd, W.W. Norton & Co., Inc. New York, NY. (2011).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen. Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).
- Wise, K. Preparing Spread Plates Protocols. , Available from: http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols (2006).
- Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies. BioTechniques. 30, 738-742 (2001).
- American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: http://www.atcc.org/ (2012).
- EPA Microbiology Home Page. , Available from: http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html (2012).
- The GENE Project: Laboratory Methods and Materials. , Available from: http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html (2012).
- Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. , Available from: http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html (2012).
- Microbial Genetics (maintained by Stanley Maloy at UCSD). , Available from: http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics (2012).
- Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). , Available from: http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm (2012).
- Public Health Agency of Canada: Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss (2012).
- United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. , Available from: http://water.epa.gov (2012).
- American Society for Microbiology (ASM)'s Curriculum Recommendations Microbiology Majors Program. , Available from: http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html (2012).
- Introductory Course in Microbiology. , Available from: http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html (2012).
