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Articles by Adam J. Harrington in JoVE
JoVE General
L'applicazione di una degenerazione C. elegans Dopamina Saggio Neuron per la convalida dei potenziali morbo di Parkinson geni
Department of Biological Sciences, University of Alabama
Questo video illustra come utilizzare C. elegans per valutare neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici come modello per la malattia di Parkinson. Inoltre, gli schermi genetici sono usati per identificare i fattori che o migliorare la degenerazione o sono neuroprotettivi.
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VPS41, Una Proteina Coinvolta Nella Lisosomiale Traffico, è Protettivo in Caenorhabditis Elegans E Mammiferi Modelli Cellulari Di Malattia Di Parkinson
VPS41 è una proteina identificata come un potenziale bersaglio terapeutico per la malattia di Parkinson (MdP) a seguito di uno schermo di RNAi high-throughput in Caenorhabditis elegans. VPS41 ha un collegamento meccanicistico plausibile alla patogenesi del PD, come nel lievito è noto per partecipare al traffico delle proteine al sistema lisosomiale e diverse linee recenti prove hanno sottolineato l'importanza della disfunzione del sistema lisosomiale nella neurotossicità dell'alfa-sinucleina (alfa-syn). Abbiamo trovato quell'espressione umana in forma di VPS41 (hVPS41) impedisce la perdita di neuroni della dopamina (DA) indotta da Alfa-syn sovraespressione e neurotossicità 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in c. elegans. Nei linee di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y stabile transfected con hVPS41, abbiamo determinato che la presenza di questa proteina conferisce protezione contro le neurotossine 6-OHDA e rotenone. Sovraespressione di hVPS41 non alterava la depolarizzazione della membrana mitocondriale indotta da queste neurotossine. hVPS41, tuttavia, bloccare gli eventi a valle nella cascata apoptotica, inclusa l'attivazione di caspase-9 e caspasi-3 e scissione PARP. Abbiamo anche osservato che hVPS41 riduce l'accumulo di forme insolubili alto peso molecolare di alfa-syn in SH-SY5Y cellule dopo trattamento con rotenone. Questi dati mostrano che hVPS41 è protettivo contro alfa-syn e lesioni neurotossici-mediata in modelli cellulari e invertebrati del PD. Queste funzioni protettive possono essere correlate a una maggiore clearance della proteina malpiegata o aggregata, tra cui Alfa-SYN. I nostri studi indicano che hVPS41 può essere un obiettivo utile per lo sviluppo di strategie terapeutiche per PD umana.
C. Elegans Come Organismo Modello Per Indagare Percorsi Molecolari Coinvolti Con La Malattia Di Parkinson
Malattia di Parkinson (MdP) è un disturbo del movimento legati all'età, in parte, risultante dalla perdita selettiva di Neuroni dopaminergici. Invertebrati e mammiferi modelli sono stati sviluppati per studiare i meccanismi cellulari alterati durante la progressione della malattia; Tuttavia non ci sono limitazioni all'interno di ogni modello. Modelli dei mammiferi rimangano preziosi per studiare il PD, ma sono costosi e che richiede tempo. Qui, passiamo in rassegna genetica e fattori ambientali associati con il PD e descrivono come il verme nematode, Caenorhabditis elegans, è stato utilizzato come organismo modello per studiare i vari aspetti di questa malattia neurodegenerativa. Schermi genetici e chimici sono state condotte in c. elegans per identificare vie molecolari, proteine e piccole molecole che possono avere un impatto patologia PD. Infine, evidenziamo le future aree di indagine, nel contesto dei campi emergenti in biologia, dove il nematode può essere sfruttata per fornire intuizioni meccanicistici e possibili strategie per accelerare il cammino verso l'eventuale intervento terapeutico per PD.
Low-dose Bafilomycin Attenua La Morte Delle Cellule Neuronali Associati a Disfunzione Pathway Autophagy-lisosoma
Abbiamo dimostrato in precedenza che il plecomacrolide antibiotici bafilomycin A1 e B1 attenuare significativamente granello cerebellare neurone morte derivanti da agenti che interrompono la funzione lisosoma. Per caratterizzare ulteriormente le cytoprotection bafilomycin-mediata, abbiamo esaminato la sua capacità di attenuare la morte di ingenui e differenziato di un neurone delle cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y da agenti che inducono la disfunzione lisosoma in vitro e dalla morte di Neuroni dopaminergici in vivo in c. elegans. Bafilomycin basse dosi significativamente attenuato morte delle cellule SH-SY5Y risultanti dal trattamento con clorochina, idrossiclorochina amodiaquine e staurosporine. Bafilomycin anche attenuato la riduzione clorochina indotta nell'elaborazione della catepsina D, il principale lisosomiale acido aspartico proteasi, alla sua forma 'attiva' maturo. Clorochina indotta accumulo vacuolo autophagic e inibito autophagic flux, effetti che sono stati attenuati dopo trattamento con bafilomycin e sono stati associati con una diminuzione significativa della clorochina indotta accumulo di oligomeri detergente insolubile alfa-sinucleina. Inoltre, bafilomycin in modo significativo e dose-dipendente attenuato morte neurone dopaminergico in c. elegans risultanti dalla sovraespressione in vivo del selvaggio-tipo umano alfa-sinucleina. Insieme, i nostri risultati suggeriscono che bafilomycin basso-dose è citoprotettivo in parte attraverso la manutenzione del percorso autophagy-lisosoma e sottolinea il potenziale terapeutico per il trattamento del morbo di Parkinson e altre malattie neurodegenerative che esibiscono interruzione delle vie di degradazione della proteina e l'accumulo di specie tossiche della proteina.
Caenorhabditis Elegans Come Sistema Di Modello Per L'identificazione Di Effettori Di α-synuclein Misfolding E Dopaminergico Morte Cellulare Associato a Malattia Di Parkinson
Protein misfolding e aggregazione sono caratteristiche chiave patologiche osservate in numerose malattie neurodegenerative, tra cui il misfolding di α-sinucleina (α-syn) nella malattia di Parkinson (MdP) e β-amiloide nella malattia di Alzheimer. Mentre questo fenomeno è ampiamente osservato, l'eziologia e la progressione di queste malattie non è pienamente compresa. Inoltre, c'è una mancanza di trattamenti terapeutici diretto ad arrestare la progressione e la neurodegenerazione associata a queste malattie. Ciò esige una necessità per un poco costoso, facile da manipolare organismo multicellulare per condurre gli schermi genetici e chimici all'interno per identificare i fattori che possono giocare un ruolo cardine nella patologia di queste malattie. Qui, descriviamo la metodologia coinvolto nell'identificazione genetiche modificatori di α-syn misfolding e tossicità nel verme nematode, Caenorhabditis elegans. Nematodi transgenici progettati per esprimere umana α-syn dei muscoli della parete del corpo o dopaminergico (DA) i neuroni risultato nella formazione dei puncta citoplasmatico o DA neurodegenerazione, rispettivamente. Utilizzando questi modelli, descriviamo l'uso di interferenza del RNA (RNAi) ed espressione genica transgenici funzionalmente delucidare potenziali bersagli di gene terapeutico che alterano α-syn misfolding e DA neurotossicità.
Modellazione Degenerazione Neuroni Della Dopamina in Caenorhabditis Elegans
In corso indagini su cause e cure per i disturbi del movimento umano sono importanti verso la delucidazione di malattie come il morbo di Parkinson (PD). L'uso di sistemi modello animale può fornire collegamenti a fattori di suscettibilità, come pure gli interventi terapeutici. A questo proposito, il verme nematode, Caenorhabditis elegans, è ideale per gli studi di malattie neurodegenerative età-dipendente. Esso è geneticamente trattabili, ha una durata di vita breve e un ben definito sistema nervoso. Marcatori fluorescenti, come GFP, prontamente sono visualizzati in c. elegans come è un organismo trasparente; così il sistema nervoso e fattori che alterano la vitalità dei neuroni, possono essere direttamente esaminati in vivo. Attraverso l'espressione della proteina malattia umana, alfa-sinucleina nei neuroni della dopamina worm, neurodegenerazione è osservata in maniera età-dipendente. Inoltre, applicazione di una dopamina neurotossina, 6-idrossi-dopamina, fornisce un altro indipendente modello PD descritto nel presente documento sono tecniche di trasformazione di c. elegans per valutare obiettivi gene neuroprotective di candidati, integrazione delle matrici extracromosomico, incroci genetici e dei metodi per l'analisi del neurone dopamina che sono applicabili a entrambi i tipi di neurotossicità. Queste tecniche possono essere sfruttate per valutare i modificatori chimici e genetici di tossicità, fornendo ulteriori vie per avanzare scoperte PD-correlati.
Analysis of VPS41-Mediated Funzionale Neuroprotezione in Caenorhabditis Elegans E Morbo Di Parkinson Del Modelli Mammiferi
Interruzione del sistema lisosomiale è emersa come una chiave via cellulare la neurotossicità del α-synuclein (α-syn) e la progressione della malattia di Parkinson (MdP). Una schermata di interferenza (RNAi) RNA su larga scala utilizzando Caenorhabditis elegans identificato VPS-41, una proteina multidominio coinvolta nel traffico di una proteina lisosomiale, come un modificatore di α-syn accumulo e dopaminergico degenerazione di neuroni (Hamamichi et al., 2008). Studi precedenti hanno mostrato una funzione neuroprotettiva conservata di VPS41 umano (hVPS41) contro il PD-relative tossine nelle cellule di mammifero e neuroni c. elegans (Ruan et al., 2010). Riportiamo qui, che sia l'AP-3 (proteina dell'adattatore heterotetrameric complessa) interazione dominio e Clatrina catena pesante ripetizione dominio sono necessari per proteggere i neuroni dopaminergici c. elegans da α-syn-induced neurodegenerazione, così da evitare la formazione di α-syn inclusione in un modello di cellula umana neuroglioma H4. Utilizzando mutante c. elegans e RNAi neurone-specifico, abbiamo rivelato che hVPS41 richiede sia un funzionale AP-3 (proteina dell'adattatore heterotetrameric complessa) e luppolo (homotypic fusion e vacuolo proteina ordinamento)-tethering complesso a suscitare neuroprotezione. È interessante notare, due polimorfismi a singolo nucleotide nonsynonymous trovati all'interno del dominio di interazione AP-3 di hVPS41 attenuato la proprietà neuroprotettive, suggestiva di fattori di suscettibilità putativo per il PD. Inoltre, abbiamo osservato una diminuzione nel livello di proteina α-syn quando hVPS41 era overexpressed in cellule umane neuroglioma. Così, la capacità di neuroprotective di hVPS41 può essere una conseguenza di una maggiore clearance delle proteine malpiegate e aggregate, comprese specie tossiche α-syn. Questi dati rivelano l'importanza del traffico lisosomiale nel mantenimento dell'omeostasi cellulare in presenza di α-syn maggiore espressione e tossicità. I nostri risultati supportano hVPS41 come un potenziale romanzo obiettivo terapeutico per il trattamento di synucleinopathies come PD.
