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Articles by Adolfo Saiardi in JoVE
JoVE General
品質イノシトールピロリン酸塩の調製
イノシトールピロリン酸は人間の病態、例えば癌、糖尿病や肥満の重要な役割を果たしているが、作用の正確なメカニズムは、紛争の問題です。市販のイノシトールピロリン酸の不足は、詳細な研究が問題とレンダリング。ここでは、イノシトールピロリン酸のミリグラムを生成し、分離するために単純なプロトコルを記述する。
Other articles by Adolfo Saiardi on PubMed
イノシトールピロリン酸はプロテインキナーゼC1変異酵母のDNA高頻度組み換えに必要な、
Diphosphoinositol pentakisphosphate（INSP（7））とビスdiphosphoinositol四リン酸塩は（INSP（8））エネルギッシュなピロリン酸基を含む、動物と植物界全体で発生し、イノシトール六リン酸キナーゼの最近クローン化された家族（INSP（6）KS）によって合成される。我々は、これらのイノシトールピロリン酸塩、酵母S. cerevisae相同DNA組換えを媒介することを報告している。変更されたプロテインキナーゼC1（PKC1）によって引き起こされる高頻度組み換えは、酵母INSP（6）K（yInsP（6）K）の欠失を有する酵母で失われ、触媒活性酵母または哺乳動物INSP（6）KSによって選択的に復元することができます。イノシトールピロリン酸は、組換えのイノシトールピロリン酸の行動のためのいくつかの一般性を示唆して、メカニズムが異なる高頻度組み換えの2つのフォームが必要になります。
コカイン自己投与のドーパミンD2様受容体の役割：D2受容体変異マウスと新D2受容体拮抗薬を用いた研究
ドーパミン受容体のサブタイプは、D1のような（例えば、D1、D5）または（D2、D3、D4）D2のように一般に分類され、証拠を収束すると、そのD2様受容体は、虐待に関連した影響を媒介に特に重要であることを示唆しているコカインの。しかし、それがためにD2、D3、およびin vivoにおいてD4受容体の薬の比較的低い選択性のコカインの行動への影響でD2様受容体サブタイプの役割を区別することは困難であった。研究の現在の一連の目標は、新しい遺伝的および薬理学的ツールを使用して、コカインの補強効果にD2様受容体サブタイプの寄与を検討した。まず、コカイン自己投与の動作、およびD2受容体が急行D3およびD4受容体を欠いている変異マウスの非選択的D2のような薬の関連の影響を評価した。コカイン投与効果関数の下行脚におけるコカインの高用量が使用可能になったとき、D2変異マウスは、ヘテロ接合体または野生型同腹子よりも高いレートでの自己投与が、コカイン投与効果関数の行脚はしませんでした遺伝子型間で異なります。食物中濃度の範囲の提示によって維持され、応答速度が野生型マウスに比べてD2変異マウスで有意に低かったため、薬物摂取の上昇率は、応答速度の非特異的な増加に起因しませんでした。野生型マウスでは、D2のような拮抗eticloprideによる前処理は、コカインの高用量の自己投与の速度を増加し、D2のようなアゴニストquineloraneは、コカインの代わりに正の強化子を務めていました。しかし、eticloprideとquineloraneこれらの効果は、D2受容体を欠いたマウスで観察されていませんでした。次に、我々は、近交系ラットにおけるコカイン自己投与行動に関する別のD2受容体サブタイプに対する選択的小説アンタゴニストの効果を比較した。 D3/D4拮抗薬が効果がなかったのに対し、ラットでは、D2選択的拮抗薬は、高用量のコカインもコカインとD2のようなアゴニストquineloraneの組み合わせの自己投与の速度を増加させた。総称して、これらの知見は、D2受容体がコカイン自己投与の必要はありませんことを示唆しているが、この受容体サブタイプは、高用量のコカイン自己投与の速度を制限するメカニズムに関与している。我々の結果はまた、D3およびD4受容体はD2のような薬剤によるコカイン自己投与の調節に大きな役割を果たしていないことを示唆している。
イノシトールピロリン酸は、エンドサイトーシスの人身売買を規制
そのようなdiphosphoinositol-pentakisphosphateおよびビス - diphosphoinositol - 四リン酸塩として最近発見されたイノシトールピロリン酸塩の高エネルギーの可能性と急速な売上高は、動的な細胞の役割を示唆しているが、特定の機能はまだ確立されていない。イノシトールリン酸代謝の欠陥をいくつかの酵母変異株を用いて、選択的にイノシトールピロリン酸塩の欠損の形成に関連付けられた劇的な膜の欠陥を識別します。我々は、この表現型は、特定のエンドサイトーシス経路の異常ではなく、膜輸送の他のコンポーネントを反映していることを示しています。したがって、イノシトールピロリン酸は、エンドサイトーシスの主要調節因子である。
イノシトールピロリン酸は、プレクストリン相同ドメインPtdIns（3,4,5）P3の相互作用を介して細胞性粘菌の走化性を仲介する
イノシトールリン酸がよく知られているシグナル伝達分子である、そのようなdiphosphoinositol pentakisphosphate（InsP7/IP7）及びビス - diphosphoinositol四リン酸塩（InsP8/IP8）などのイノシトールピロリン酸塩、一方で、あまり特徴があります。我々は結合プレクストリン相同（PH）ドメイン含有タンパク質のPtdIns（3,4,5）P3との競争によってInsP7媒介による細胞性粘菌走化性の生理学的な規制を示しています。走化性刺激はInsP7/InsP8レベルの迅速かつ持続的な上昇をトリガします。 、InsP7にイノシトール六リン酸（InsP6/IP6）を変換する変異細胞の急速な凝集を引き起こすとcAMPに対する感受性を増加させInsP6キナーゼ（InsP6K/IP6K）の遺伝子を削除してInsP7とInsP8の枯渇。走化性は、特定のPHドメイン含有PtdIns（3,4,5）P3への特異的結合を介したタンパク質の膜輸送によって媒介される。 InsP7は、in vitroおよびin vivoの両方PtdIns（3,4,5）P3との結合PHドメインに対して競合している。 InsP7枯渇はPHドメインの膜移行および補強下流の走化性シグナル伝達活性を向上させます。
ドーパミンD1およびD2受容体を介したシグナル伝達の同時不在は、マウスにおける致死的である
ドーパミン（DA）は中枢神経系のほか、神経や消化器系の生理機能のさまざまな制御します。 DAシグナリングはD1-D5という名前の5つのクローン化受容体によって媒介される。 5受容体のノックアウトマウスモデルは、いくつかの重要なDA-介在の機能に障害はあるが、生成された、とされているが、彼らは生存可能であり、再現することができます。 D1およびD2受容体が最も豊富で広く発現DA受容体である。これらの受容体によって媒介される協同組合/相乗効果は、モータの動作の制御には、特に、提案されている。そのような相互関係の程度を分析するために、我々は二重D1/D2受容体変異体を生成している。興味深いことに、単一のノックアウトとは対照的に、我々はD1およびD2受容体の同時切除は出生後の第二または第三週の間に致死であることがわかった。この劇的な表現型は、主要な解剖学的変化が脳内で確認されなかったので、特に、変更された摂食行動と消化器系の機能不全に関連する可能性があります。同様に、機能のD1、D2ヘテロ変異体の存在下で（D1R（ - / - ）、D2Rは、（+ / - ））重度の発育遅延を示し、それらの離乳後の期間を存続させなかった。 D1r/D2r化合物の変異体における運動行動の分析では、D2-媒介機能の喪失を示した運動にD1Rアブレーションの効果が強く使用した実験パラダイムに依存するのに対し、モータの能力を減らすことができます。これらの研究は単一遺伝子アブレーション研究でとらえどころのないされているD1と運動のD2受容体を介した制御、食物摂取、消化管機能の相互関係を強調表示します。
イノシトールピロリン酸によるタンパク質のリン酸化
イノシトールピロリン酸IP7とIP8は非常にエネルギッシュなピロリン酸結合を含んでいます。さまざまな生物学的機能に関与していますが、それらの作用分子の部位は明らかにされていない。放射性標識IP7を使用して、我々は、複数の真核生物のタンパク質のリン酸化を検出しました。また、酵母の内因性IP7によって内因性のタンパク質のリン酸化を観察した。 IP7によるリン酸化は、非酵素であり、新たな細胞内シグナル伝達機構を表すことができる。
イノシトールピロリン酸は、ホスホイノシチド3 - キナーゼ関連タンパク質キナーゼを介して細胞死とテロメアの長さを調節する
イノシトールピロリン酸塩は、生理学的に小胞エンドサイトーシス、リボソーム処分、直接リン酸化するタンパク質を調節する。ここでは、細胞死とテロメアの長さの調節における役割を示しています。ワートマニンとカフェインの致死アクションは、選択的にイノシトールピロリン酸を合成できない酵母変異体では廃止されています。ワートマニンとカフェインは、ホスホイノシチド3 - キナーゼ関連タンパク質キナーゼTEL1とMEC1、テロメアの長さの既知のレギュレータを介して作用するように見えます。イノシトールピロリン酸塩は、生理学的にそれぞれイノシトールピロリン酸塩の低下または上昇したレベルの酵母変異体は、長いと短いテロメアを表示しているという事実によって証明されるこれらのキナーゼの作用を、拮抗する。
イノシトールポリリン酸のマルチキナーゼは、転写調節活性を持つ核PI3-キナーゼである
ホスファチジルイノシトールは、イノシトール3,4,5 - 三リン酸の主要な細胞内メッセンジャー分子が細胞質でほぼ独占的に形成されていると考えられている、ホスホイノシチド3 - キナーゼファミリーのメンバーは、ワートマニン禁止。イノシトールポリリン酸のマルチキナーゼは、水溶性イノシトールリン酸塩のシリーズを生成する酵素として同定された。我々は今、核に局在し、ワートマニンによる影響を受けている堅牢な、生理学的、および進化的に保存されたホスホイノシチド3 - キナーゼイノシトールポリリン酸のマルチキナーゼの活性を、報告します。酵母では、このイノシトール脂質キナーゼ活性は生理的に転写を調節する。
抗血管新生および抗腫瘍効果におけるイノシトールPentakisphosphate結果によってホスファチジル3-kinase/Akt経路の阻害
本研究の目的は、最近同定されたホスファチジルイノシトール3 - キナーゼ（PI3K）/ Aktの阻害剤イノシトール（1,3,4,5,6）pentakisphosphate [INS（1,3,4、の血管新生およびin vivoでの特性を調査することであった5,6）P5]。 PI3K/Akt経路の活性化が血管新生につながるイベントのいくつかの重要なステップであるため、塩基性線維芽細胞増殖因子上のインの効果は（1,3,4,5,6）P5（FGF-2）に誘起されるAktリン酸化、細胞の生存、運動性、及びin vitro管形成は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）でテストされています。 in vivoでのFGF-2によって誘導される血管新生イン（1,3,4,5,6）P5の効果は、マウスに皮下移植したマトリゲルを用いて評価した。さらに、卵巣癌SKOV-3異種移植片の成長イン（1,3,4,5,6）P5の効果がテストされました。ここでは、HUVECにおけるFGF-2を誘導するAktのリン酸化は、無血清の細胞と細胞の運動性の増加に抗アポトーシス効果が得られることを示している。イン（1,3,4,5,6）P5のブロックFGF-2を介したAktのリン酸化およびHUVECの生存と移行の両方を阻害する。また、イン（1,3,4,5,6）P5はマトリゲル上に播種したHUVECのFGF-2を介した毛細管形成およびBALB / cマウスにおけるFGF-2によって誘導される血管新生反応を阻害する。最後に、イン（1,3,4,5,6）P5のブロックSKOV-3のSC成長はシスプラチンと同じ程度にヌードマウスに異種移植され、それが完全にin vivoでのAktのリン酸化を阻害する。これらのデータは決定的に特定の抗血管新生と腫瘍因子としてのAkt阻害イン（1,3,4,5,6）P5を識別します。 PI3K/Akt経路の不適切な活性化は、この経路は、治療戦略のための魅力的なターゲットながら、がんを含むいくつかの疾患の開発にリンクされています。この点で、イン（1,3,4,5,6）P5、特定のアポトーシスと抗血管新生特性を持つ水溶性天然化合物は、成功した抗癌治療戦略になる可能性があります。
イノシトール六リン酸キナーゼ2、細胞死の生理学的メディエータ
Diphosphoinositol pentakisphosphate（InsP7）およびビス - diphosphoinositol四リン酸塩は、ピロリン酸結合を含んでいます。 InsP7三イノシトール六リン酸キナーゼ（InsP6K）のファミリーによってイノシトール六リン酸（InsP6）から形成される。本研究では細胞死の生理学的な仲介者として、InsP6Ks、InsP6K2のいずれかを確立します。多様な細胞株で複数の細胞のストレスの細胞傷害性の行動、野生型InsP6K2増強の過剰発現は、ドミナントネガティブInsP6K2トランスフェクションは、細胞死を減少させる一方。細胞死の間に、InsP6キナーゼ活性が強化され、細胞内InsP7レベルが強化されています。 InsP6KのInsP6K2ではなく、他のフォームの削除はInsP6K2が細胞死に関与する主要なInsP6キナーゼであることを示唆し、細胞死を減少させる。酵素の他のアイソフォームの細胞内局在が変化しない一方、細胞毒性は、ミトコンドリアの核からInsP6K2の転座に関連付けられています。本研究では、内因性InsP6K2説得力のある証拠を提供し、InsP7を生成することによって、アポトーシス過程の生理学的なレギュレーションを提供します。
酵母から可溶性イノシトールポリリン酸の抽出と分析
水溶性のイノシトールポリリン酸は、多くの重要な細胞機能の調節に関与している。酵母の標識、水溶性のイノシトールポリリン酸の抽出とクロマトグラフィーによる分離：サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からイノシトールポリリン酸を抽出し、分離するには、このプロトコルは、次の3つのステップに分かれています。酵母細胞を取り上げ、異なるリン酸化された形に代謝されるトリチウムイノシトールと共にインキュベートされています。水溶性のイノシトールポリリン酸は、酸抽出と高速液体クロマトグラフィーにより分画しています。各画分の放射能はシンチレーション計数により決定されます。この高感度と再現性のある方法はイノシトールポリリン酸プロファイルの微妙な変化の正確な検出を可能にし、48時間未満になります。それは簡単に他のシステムに適用することができると我々は2つのプロトコルの適応は、哺乳動物細胞用に最適化され1とシロイヌナズナの他が含まれている。
イノシトールピロリン酸は、VIP1治療を受ける
イノシトールピロリン酸は、多様な細胞過程の調節に関与するユニークなシグナル伝達分子である。 Muluguらによる二つの新しい研究。 （2007）とLeeら。 （2007年）は、分子のこのクラスの生物学的および代謝の多様性を拡張します。彼らは、新しいイノシトールピロリン酸合成酵素として酵母VIP1を識別し、VIP1活動の製品はサイクリン/サイクリン依存性キナーゼ複合体を調節することを示している。
イノシトールピロリン酸によるタンパク質のピロリン酸化は翻訳後のイベントです。
以前の研究では、イノシトールピロリン酸diphosphoinositol pentakisphosphate（IPは、（7））生理的に哺乳類と酵母のタンパク質をリン酸化することを示した。我々は今、このリン酸塩の転送がピロリン酸化を反映していることを報告します。したがって、タンパク質は、IP（7）リン酸化のためにそれらを準備するためにATPによってprephosphorylatedする必要があります。 IP（7）合成リン酸化ペプチドをリン酸化することなく、それらのリン酸塩は、メチル化またはピロリン酸化によってマスクされている場合。また、IP（7）リン酸化ペプチドは、リン酸結合の異なるタイプを示す、より多くの酸に不安定なとATPリン酸化ペプチドよりホスファターゼに対してより耐性があります。ピロリン酸化は、タンパク質へのシグナリングの新規モードを表すことができる。
膵臓のβ細胞での完全なエキソサイトーシスの容量のためにイノシトールピロリン酸の要件
イノシトールピロリン酸は、小胞輸送、テロメアの長さ、およびアポトーシスを調節する細胞プロセスのコンポーネントを認識されています。我々は、膵臓のβ細胞は、ピロリン酸diphosphoinositol pentakisphosphate（InsP7またはIP7）の高い基礎的濃度を維持し観察した。 IP7を生成することができイノシトール六リン酸キナーゼ（IP6Ks）が過剰発現していた。この過剰発現は、インスリンのエキソサイトーシスを含む容易に放出可能プールからの顆粒を刺激した。外因性は、生理的濃度でIP7用量依存的に強化されたエキソサイトーシスを適用した。我々はIP6K1とIP6K2は、ベータ細胞内に存在していたことが判明しました。 RNA IP6K1のサイレンではなく、IP6K2は、IP6K1が重要な内因性キナーゼであることを示唆してエキソサイトーシスを抑制した。膵β細胞におけるIP7の高濃度の維持は、即時のエキソサイトーシス能力を向上させ、その結果、需要の増加に応答してインスリン分泌の急激な調整を可能にすることができる。
多価不飽和脂肪酸はシナプス小胞のリサイクルを規制するSynaptojaninのローカライズに影響を与える
脂質多価不飽和脂肪酸は非常にシナプス小胞を含むシナプス膜で濃縮し、しかしそこにそれらの正確な機能は不明である。彼らは、セロトニンとアセチルコリンの異常に低いレベルを解放し、シナプス小胞の枯渇しているが、これらの欠陥の基本メカニズムは不明である。線虫Caenorhabditis elegans脂肪-3変異体は、長鎖多価不飽和脂肪酸（LC-PUFAを）欠いている。シナプス小胞タンパク質シナプトブレビンが効率的にシナプス前膜とシナプス小胞のヒューズの後に取得され、シナプス前端末が異常に大きいエンドソームのようなコンパートメントとシナプス小胞を含んでいます：ここで我々は、シナプス小胞のエンドサイトーシスは、変異体では損なわれているを示しています。さらに、変異体は、リリースサイトでホスホイノシチドホスファターゼsynaptojaninの異常に低いレベルを持っており、これらのサイトでメインsynaptojanin基板ホスファチジルイノシトール4,5 - ビスリン酸を蓄積します。シナプトブレビンとsynaptojaninのmislocalization両方がエンドサイトーシスの欠陥は、LC-PUFAの枯渇によって引き起こされることを示唆し、外因性アラキドン酸、LC-PUFAを提供することによって救出することができます。シナプスで同じエンドサイトーシス経路の遺伝子脂肪-3とsynaptojanin行為を示すことによって、我々の調査結果は、おそらくシナプスにおける変調synaptojaninローカリゼーションにより、効率的なシナプス小胞のリサイクルに必要とされるLC-PUFAを示唆している。
人間ITPK1：Ca2 +の活性化クロライドチャネルへのリンク受容体に依存するホスホリパーゼCそのリバーシブルイノシトールリン酸キナーゼ/ホスファターゼ
イノシトール3,4,5,6 - 四リン酸塩[INS（3,4,5,6）P4]はCaのコンダクタンス（2 +）活性化細胞膜における塩素イオンチャネルの阻害剤である。これらのイオンチャネルは、細胞容積の恒常性、および神経細胞や平滑筋の電気的興奮性のために、上皮細胞から塩および液体分泌に必要とされる。酵素ITPK1（イノシトール1,3,4 - 三リン酸5月6日キナーゼ）は、アドイン（3,4,5,6）P4のソースです。それは1の位置で5または6の位置およびIns（3,4,5,6）P4で両方のアドイン（1,3,4）P3をリン酸化することができ、また、（1,3,4,5,6インを脱リン酸化することができます）P5へイン（3,4,5,6）P4。研究では、現在ITPK1によって明らかにこれらの様々な酵素の活動は受容体活性化ホスホリパーゼC活性の変化およびInsの濃度（1,3,4）P3の結果増加はインの豊かさを（調整することができます分子機構を提供することを示しています3,4,5,6）P4。 ITPK1封鎖しっかりからリン酸を受け入れるか、またはバルク培地にリリースされたヌクレオチドせずにイノシトールポリリン酸、リン酸塩に直接寄付をすることができヌクレオチド結合した。 "intersubstrate"転送のこの現象は、アドインの増加、細胞濃度を促進するためにP3イン（1,3,4）を使用することができ、人間の酵素、（3,4,5,6）P4に含まれています。
ムードスタビライザーバルプロ酸は、線虫（Caenorhabditis Elegans）の両方のイノシトールとジアシルグリセロールを主成分とするシグナル伝達経路を阻害する
疾患で、その作用機序は不明であるものの、抗てんかん薬バルプロ酸（VPA）が広く、双極性障害の治療に使用されています。我々は、VPAはイノシトールリン酸と線虫（Caenorhabditis elegans）におけるシグナリングジアシルグリセロール（DAG）の両方を阻害することをここに表示されます。排便と排卵：VPAは、イノシトール-1,4,5 - 三リン酸（IP 3）によって規制の2つの動作が中断されます。アセチルコリン放出と産卵：VPAはまた、DAGのシグナリングによって調節2つの活動を阻害する。 DAGのシグナル伝達におけるVPAの効果は、VPAは、DAGの産生を阻害する作用が示唆さ、ホルボールエステル、DAGアナログで解放されます。 VPAは、DAGとイノシトール-1 - リン酸のレベルが低下しますが、ホスファチジルイノシトール-4,5 - ビスリン酸（PIP（2））をわずかにDAGおよびIP（3）を形成するPIPのホスホリパーゼC-媒介加水分解（2）ことを示唆し、増加させるVPAの存在下で欠陥があります。
イノシトール六リン酸キナーゼの製品は、二リン酸と三リン酸基を含んで
真核細胞は、ピロリン酸結合を含む多様なイノシトールポリリン酸（IPS）の家族を生成します。イノシトールピロリン酸は、細胞機能の広い範囲にリンクされている、彼らがセカンドメッセンジャーとして作用するという証拠が高まっている。イノシトール六リン酸キナーゼ（IP6K）がリン酸化された無水物結合の増加で、いくつかの製品には天然の基質イノシトールpentakisphosphate（IP 3）とイノシトール六リン酸（IP 6）を変換することができます。本研究では、構造的に5 IPとIP 6からIP6Kの3哺乳類のアイソフォームによって合成されたIPアドレスを分析した。 NMRおよび質量分析では、IP6Kの活性部位のアーキテクチャによって定義され、多様な、まだ特定の立体化学を持つ製品の数を示した。我々は今IP6Kがイノシトール環上にピロリン酸（二リン酸）と同様にtriphosphoグループの両方を合成することを報告している。すべての3つのIP6Kアイソフォームは、in vitroおよびin vivoの両方で同じ活動を共有しています。
イノシトールポリリン酸のマルチキナーゼ：核Inositidesの代謝·アーキテクト
inositidesは、細胞表面受容体の活性化によって開始されたシグナル伝達経路に十分に確立され役割を持つ重要な細胞のセカンドメッセンジャーである。高いイノシトールポリリン酸のための進化的に保存され、核シグナル伝達経路の最近の識別は、生合成と調節性inositideキナーゼファミリーの最古の祖先の一部であるかによって媒介される分子のこの多様なクラスのための新しいシグナル伝達パラダイムを定義しています。イノシトールポリリン酸のマルチキナーゼ（IPMK）は、mRNAの輸出、転写調節、およびクロマチンなどの核機能において重要な役割を持つこの家族の中で最も触媒多様なメンバーを表します。
イノシトールピロリン酸は、分子シグナリングていますか？
小さく、細胞質分子のイノシトールポリリン酸ファミリーは、細胞シグナル伝達の分野で著名な場所があり、イノシトールピロリン酸は、この大家族への最も最近の付加である。 1993年に初めて同定され、それらはその後の研究のすべての真核生物で発見されている。イノシトールピロリン酸の決定的な特徴は、直ちに可能なシグナル伝達分子としての関心を集めて特徴的な "高エネルギー"ピロリン酸基、の存在である。独自の "高エネルギー"ピロリン酸結合に加えて、セル内のそれらの濃度は厳密には非常に急速な売上高で規制されています。これは、一緒に他のイノシトールポリリン酸の歴史を持つ、彼らはいくつかの基本的な細胞プロセスに関係する細胞内シグナル伝達において重要な役割を持っている可能性が高くなります。この仮説は、イノシトールピロリン酸が関与しているように見える細胞機能の驚くほど広い範囲でサポートされています。精液所見は、イノシトールピロリン酸が直接プリリン酸化タンパク質をリン酸化することができるということでしたことにより、すなわち、全く新しい翻訳後タンパク質修飾、セリン - ピロリン酸化を識別します。急速な進歩は、彼らの最初の同定以来、15年間でこれらの分子の代謝を特徴付けるで行われています。ただし、特定の細胞プロセスと関連する生理的手がかりのコンテキスト内でその詳細なシグナル伝達の役割は、特に哺乳類のシステムでは、よりゆっくりと開発しました。我々はシグナル伝達のこの小説の形式の生理的影響と共に、彼らの行動の可能性の分子機構は何か、その細胞内濃度が変調されているか分析し、細胞シグナル伝達の観点からイノシトールピロリン酸について説明します。
イノシトールピロリン酸と独自の代謝の複雑さ：ゲル電気泳動による解析
イノシトールピロリン酸は、タンパク質基質のピロリン酸化の責任最近特徴付けられる細胞内シグナル伝達分子である。可能性が細胞機能の広い範囲に関与していますが、イノシトールピロリン酸塩の研究は彼らの分析のために容易に利用可能な方法の欠如に苦しんできた。
イノシトールピロリン酸は過酸化水素シグナリングを変調
イノシトールピロリン酸は、細胞のさまざまな機能に関与しているが、特定の経路および/または下流のターゲットは、十分に特徴付けされたままになります。本研究では、ROS（活性酸素種）によって引き起こされる細胞の損傷への応答におけるイノシトールピロリン酸塩の潜在的役割を調べるために、サッカロミセス·セレビシエの変異体を使用しています。 DNA修復の持続的活性化と一致kcs1を欠く酵母[S.セレビシエIP6K（イノシトール六リン酸キナーゼ）]が大幅にIP7が低下している（diphosphoinositol pentakisphosphate）とIP8（bisdiphosphoinositol四リン酸塩）濃度、およびH2O2によって引き起こされる細胞死に抵抗の増加を表示するには、メカニズムは、Rad53経路によって制御されます。このようなアクチン重合のような他のRad53制御関数は、イノシトールピロリン酸塩の影響を受けませんが表示されます。 VIP1を欠く酵母[S. cerevisiaeのPP-IP5K（またIP7K、IP7キナーゼとして知られている）]イノシトールピロリン酸IP7を大量に蓄積するが、検出可能なIP8を持っていませんが、この酵素は生理的なIP7キナーゼを表していることを示す。 kcs1Delta酵母と同様に、vip1Delta細胞は、それはおそらくIP8のダブルpyrophosphorylatedフォーム[（PP）2-IP4] H2O2応答を仲介するであることを示す、過酸化水素によって引き起こされる細胞死に増加した抵抗性を示した。 kcs1Delta細胞はフレオマイシンによって引き起こされるDNA損傷への応答がしかし、これらのイノシトールピロリン酸は、直接DNA損傷を感知に関与していない。我々は、in vivoでのH2O2への暴露に続いて、携帯イノシトールピロリン酸レベルの急激な減少は、in vitroでのKcs1の酵素活性にH2O2の抑制効果を観察します。さらに、哺乳類IP6K1上で実行並列システイン突然変異誘発研究では、ROSのシグナルが酵素のこの進化的に保存されたクラスの直接の改変によって導入される可能性があることを示唆している。
AP3B1のイノシトールピロリン酸を介したピロリン酸化は、HIV-1のGagリリースを調節する
IPなど（7）（diphosphoinositol pentakisphosphate）などの高エネルギーイノシトールピロリン酸は、直接pyrophosphorylatedタンパク質を生成するprephosphorylatedセリン残基にβ-リン酸を寄付することができます。ここでは、AP-3、HIV-1のリリースに必要なクラスリン関連タンパク質複合体のβサブユニットは、IPのターゲット（7）媒介ピロリン酸化であることを示している。我々はAP3B1結合パートナーとしてKif3A、キネシンスーパーファミリーのモータータンパク質を同定し、Kif3Aは、AP-3複合体と同様に、HIV-1のGagリリースに必要な細胞内プロセスに関与していることを実証しています。重要なのは、IP（7）媒介AP3B1のピロリン酸化は、結果として、Kif3Aとの相互作用を調節すると、HIV-1ウイルス様粒子の放出に影響を与えます。本研究では、IP（7）媒介ピロリン酸化によって調節される細胞のプロセスを識別します。
NGF応答エレメントは交感神経ニューロンの軸索にミオイノシトールMonophosphatase-1 MRNAをターゲット
mRNAの局在は、細胞極性と特殊な細胞機能の確立の基礎となる進化の保存されたメカニズムです。開発ニューロンの細胞内コンパートメントに局在するmRNAを同定するために、我々は、ラットの交感神経ニューロンと遺伝子発現の連続分析（SAGE）の区分の文化を組み合わせた独創的なアプローチを取った。予期せず、軸索の中で最も豊富な転写産物は、ミオイノシトールmonophosphatase-1（Impa1）、イノシトールサイクルとニューロンにおけるリチウムのメインターゲットを調節する鍵となる酵素のmRNAであった。 Impa1 mRNAの3 '非翻訳領域内の小説のローカライズ要素は、特に神経成長因子（NGF）に応答して、交感神経ニューロンの軸索と規制ローカルIMPA1翻訳にImpa1転写産物を対象とした。軸索のIMPA1合成の選択的サイレンシングは、核のCREBの活性化と誘導軸索変性を減少させた。これらの結果は、軸索のmRNAの輸送への洞察を提供し、軸索の転写の標的と局所的翻訳を指示する新しいNGF応答ローカライズ要素を明らかにした。
イノシトール六リン酸キナーゼ1（IP6K1）によるInsP7の合成
水溶性のイノシトールポリリン酸は、多種多様な細胞プロセスの機能に不可欠なシグナル伝達分子の多様化するクラスを表しています。最近では、フィチン酸はイノシトールピロリン酸誘導体、INSP（7）（PP-IP（5）またはIP（7））キナーゼに依存しない方法でのpyro-リン酸化タンパク質に示されている。この新たなリン酸化機構の機能的重要性を理解するために開始するには、寒さと放射性標識INSP（7）のソースが不可欠である。しかし、冷たいINSP（7）を購入するために高価であり、標識したINSP（7）は市販されていないです。ここでは、in vivoおよびin vitroの実験で必要な純度のレベルにINSP（7）を合成すると、精製するためのプロトコルを提供しています。我々は、大腸菌から組換えマウスイノシトール六リン酸キナーゼ（IP6K1）を精製することによって開始されます。精製IP6K1で、我々はその後、異なる種からのタンパク質抽出物をリン酸化することがin vitroの実験で使用している[P（32）] INSP（7）冷INSP（7）と5betaを生成します。
イノシトール六リン酸キナーゼは、オートファジー促進
我々と他の著者は、以前は携帯diphosphoinositol pentakisphosphate（INSP（7））のレベルを増加させると細胞死を細胞の感受性を増加させることが報告されています。本研究では、INSP（7）を形成し、オートファジーINSP（6）Ksの過剰発現と破壊システムを使用してイノシトール六リン酸キナーゼ（INSP（6）KS）の関係を明らかにした。オートファゴソームの多くは、LC3のために免疫ブロット法、免疫細胞化学、免疫電子顕微鏡を用いて検討したようなLC3-IIにLC3-Iの変換によって明らかにINSP（6）KS、、でトランスフェクトした細胞で誘導され、結果として、ヨウ化プロピジウム染色を用いて示すように、細胞死の率は、対照ベクターでトランスフェクトした細胞間に比べて、これらの細胞の間で高かった。しかし、RNAiを用いINSP（6）Ksのレベルの減少は、オートファゴソームの形成を抑制した。また、オートファゴソームと細胞死の割合の数が正常な状態にさらさINSP（6）KSでトランスフェクトした細胞間に比べてスタウロスポリン誘発性ストレスにさらさINSP（6）KSでトランスフェクトした細胞間で有意に高かった。 INSP（6）KSによって誘導される細胞死は完全にZ-VAD-FMK、汎カスパーゼ阻害剤によって抑制されなかった。哺乳類のラパマイシン標的タンパク質（mTOR）のリン酸化は、mTOR経路は、INSP（6）KSによって生成されたオートファゴソームを調節することを示唆し、細胞の過剰発現INSP（6）カンザス州で落ち込んでいた。これらの知見は、INSP（6）Ksがオートファジーを促進し、カスパーゼ非依存性細胞死を誘導することを示唆している。この現象は、INSP（6）KS経由してオートファジーの新たな経路を開きます。
イノシトール六リン酸キナーゼのシグナル伝達の役割（IP6Ks）
過去10年間では、イノシトールピロリン酸への関心の含まれている爆発を見てきました。 IP6KsとPP-IP5Ksの最近の識別の初期のクローニングは、イノシトールピロリン酸の生理的役割を調査するために必須の実験ツールの開発を許可しています。しかし、勢いを得るための研究のこのエキサイティングなフィールドに、よりシンプルで信頼性の高い研究·プロトコルは、さらに開発する必要があります。ゲル電気泳動（Lositoら、2009）を使用して、イノシトールピロリン酸を解決し、定量化する能力が飛躍的に研究のための新しい道を開いて、我々は、分子のこのクラスを勉強している方法を変更した。細胞から抽出したイノシトールピロリン酸を解決検出し、特徴付けるために、この技術の使用は確かに1つの望ましい目的を表しています。最も重要な目的は、しかし、生物物理学的方法ではpyrophosphorylatedセリンの生体内での存在を識別することによって、翻訳後修飾の新しいメカニズムの明確な証拠を入手することです。これがうまくいけば特にpyrophosphorylatedセリンを認識する抗体の産生を介して、例えば、この変更を検出する新しい方法の開発を沈殿させます。
イノシトールポリリン酸のマルチキナーゼはAkt / PKBを有効にし生理学的PI3-キナーゼである
PI3-キナーゼのP110家族によって形成された第二メッセンジャーホスファチジルイノシトール（3,4,5） - 三リン酸（PIP（3））は、タンパク質キナーゼAkt / PKBを活性化することによって大部分が、細胞の成長、増殖、生存を促進する。我々はイノシトールポリリン酸のマルチキナーゼ（IPMK）が生理的にPIP（3）と同様に水溶性イノシトールリン酸を生成し表示します。 IPMK削除は、成長が減少AktシグナルとそのPI3-キナーゼ活性の損失によって一意に引き起こされる細胞増殖因子-誘発した。ワートマニンによってP110 PI3-キナーゼの阻害はIPMKのリン酸化と活性化を防ぐことができます。従って、Aktシグナルの増殖因子の刺激は、P110 PI3-キナーゼとIPMKのシーケンシャルアクティベーションを通じて、PIP（3）世代が含まれます。イノシトールリン酸塩は、Aktシグナル伝達を阻害するとして、IPMKは、それぞれのイノシトールリン酸キナーゼやPI3-キナーゼ活性を介して阻害または刺激的なAktの、分子スイッチとして機能するように表示されます。 IPMKを調節する薬剤は、細胞増殖に影響を与えるの治療関連があるかもしれません。
タグの検索による植物ゲノムのIP6K遺伝子同定
植物は植物の種子の最初のIP、フィチン酸（IP6）の完全リン酸化イノシトール環を発見したのでイノシトールポリリン酸の中で特別な役割（IP）の研究を果たしている。現在では、フィチン酸は、さらにピロ - リン酸部分を含むIPを生成するためにIP6キナーゼ（IP6Ks）によって代謝されることが知られている。 IP6Kは、いくつかの哺乳動物、菌類、アメーバの種で同定され保存された進化の酵素である。 IP6Kはまだ植物の染色体に同定されていませんが、植物細胞内でその存在感を示唆している多くの手がかりがあります。
イノシトール六リン酸キナーゼは、ハンチントン病の細胞死を誘導する
イノシトールピロリン酸diphosphoinositolのpentakisphosphateは、哺乳動物細胞に普遍的に存在し、非常にエネルギッシュなピロリン酸結合を含んでいます。我々は以前報告しているイノシトールピロリン酸diphosphoinositolのpentakisphosphate、核から細胞質への移行を介して仲介するアポトーシス性細胞死にイノシトール六リン酸に変換するイノシトール六リン酸キナーゼ2型（INSP（6）K2）、。ここでは、この酵素が制御リンパ芽球細胞の核に局在しているのに対し、INSP（6）K2は、ハンチントン病（HD）患者からのリンパ芽球細胞の細胞質に主に局在していると報告している。 HDのリンパ芽球細胞で検出されたオートファゴソームの数が多いINSP（6）K2活性化に応答におけるAktのダウンレギュレーションと一貫性があります。これらの観察結果と一致して、INSP（6）Ksの過剰発現はAktのリン酸化と細胞死の誘導の枯渇につながる。これらの結果は、INSP（6）K2活性化はHDの病因に関連付けられていることを示唆している。
無機ポリリン酸のEndopolyphosphatasesの進化的に保存された家族の識別
無機ポリリン酸（ポリ-P）は高エネルギー結合によって連結されたリン酸基のちょうどチェーンで構成されています。それはすべての生物で発見され、細胞プロセスのさまざまな（例えば、リン酸貯蔵、血液凝固、および病原性）に関与している。真核生物では主に未同定のまま、その代謝は、細菌を中心に検討されている。それが最近、ポリ-P代謝は高度にリン酸化イノシトールの種（イノシトールピロリン酸）のそれに接続されていることが示唆されている。イノシトールピロリン酸はリン酸基は、炭素原子数を上回っている分子である。ポリ-Pのように、彼らは高エネルギー結合を含み、細胞のシグナル伝達において重要な役割を果たす。ここでは、イノシトールピロリン酸を生成することができません出芽酵母変異体は、ポリ-Pの検出不可能なレベルを持っていることを示しています。我々の結果は、これらの2つの高度にリン酸化の分子間の顕著な代謝の平行を示唆している。さらに重要なことは、我々はDDP1は、diadenosineとdiphosphoinositolリン酸ヒドロラーゼをコードし、堅牢なポリ-P endopolyphosphohydrolase活性を有することを示している。さらに、我々は、哺乳類のNudix加水分解酵素ファミリーのメンバーは、ヒト細胞の3 Ddp1ホモログ（DIPP1、DIPP2、とDIPP3）が、また分解するポリ-Pが可能であるので、これは進化的に保存された機能であることを証明している。
細胞エネルギーダイナミクスに関するイノシトールピロリン酸の影響
その高エネルギーリン酸結合で、アデノシン三リン酸（ATP）は、メイン細胞内のエネルギー担体である。また、リン酸供与体または環状アデノシン一リン酸の前駆体として、ほとんどのシグナル伝達経路で機能します。我々はイノシトールピロリン酸は、細胞内ATP濃度の制御に関与することをここに表示されます。イノシトールピロリン酸を欠いている酵母は、ミトコンドリア機能不全があるが、逆説的に、多くのATPなどが増加するため解糖の4回が含まれています。我々はイノシトールピロリン酸が主要な糖転写因子GCR1の活性を制御することを示している。したがって、イノシトールピロリン酸は、ミトコンドリア/糖代謝率を変更することにより、ATP濃度を調節する。イノシトールピロリン酸を介して再プログラミングの代謝にも哺乳類のシステムに保存されて保存された進化のメカニズムです。
