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Articles by Adrian W. Briggs in JoVE
JoVE General
プライマー伸長キャプチャ：重縮退DNAソースからターゲットシーケンスの取得
Max-Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Leipzig
我々は、我々は5つのネアンデルタール人の完全なミトコンドリアゲノムを再構築するために使用されるターゲット古代のDNA配列の検索、の方法を提示する。現代の人間とのこれらの配列の比較は、ネアンデルタール人は、長期の低効果的な人口の大きさを持っていたことを示唆している。
Other articles by Adrian W. Briggs on PubMed
100 万の塩基対のネアンデル タール人の DNA の分析。
ネアンデル タール人ゲノム解剖学的完全に現代人間に特定の遺伝子の変化を識別するユニークな機会を提供していますので最も密接に関連して現代の人間に絶滅した人類のグループです。現代の人間の DNA からの汚染の非常に無料で 38,000 年前ネアンデル タール化石を識別しています。この化石からの DNA 抽出物の直接の高スループット シーケンスはこれまで以上 100 万の塩基対のヒト上科の核 DNA 配列をもたらした。比較現代の人間とネアンデル タール人の DNA シーケンス ヒトとチンパンジーのゲノムのリビールを平均で約 50万年前分岐しました。既存の技術と化石資源今ネアンデル タール人のゲノム配列決定努力を開始するのに十分です。
パターンのゲノム損傷 DNA からネアンデル タール人シーケンスします。
高スループットのダイレクト シーケンス技術最近、更新世の生物からシーケンスのゲノムに可能性を開いています。ここでは、ネアンデル タール人、マンモスと洞窟ベアから決定 DNA シーケンスを分析します。私達はプリンの古代 DNA 改に隣接する位置で収監されているその depurination その劣化に貢献している示唆して示します。我々 はさらにチトジンの残余の miscoding から結果の置換が DNA シーケンスを大幅に収監されていることを示す、その他の置換は稀であるに対し大幅にその分子の両端でクラスター化します。観測された置換パターン用いてチトジンの残余 DNA 一本鎖端の長さ、ニックスの周波数の単一および二重鎖の部分での脱アミノ化率を推定するモデルを提案します。信頼性の高いゲノム シーケンス更新世の生物から得られることが示唆されました。
タンパク マイクログラムから: 量的な PCR は高スループット シーケンスの材料の要求を減らします。
ネアンデル タール人とマンモスのゲノム DNA シークエンシング 454 を回復する現在の努力は、この技術の感度をデモンストレーションします。ただし、アプリケーションのシーケンス処理ルーチン 454 まだ初期素材マイクログラム量が必要です。これは、ライブラリをシーケンシング、高価で、労働集約型の手順は、古代 DNA および他の貧しい人々 の DNA のサンプルをシーケンスするとき necessitating 定量化 454 の効果的な方法の不足のためです。ここで効果的にこれらの制限を排除定量的 PCR に基づくライブラリ定量化法の 454 シーケンスを報告します。我々 は、分子番号と由来ネアンデル タール人の DNA エキス、セージ ditags とすべての滴定の実行を実行せず最適順序利回りを取得 bonobo ゲノム DNA シーケンシング ライブラリにおけるフラグメント サイズ分布推定。このメソッドを使用して、454 シーケンスは日常的に、それによって大幅にサンプル スループットおよびプロトコル開発 454 プラットフォーム上の範囲を増加させながら、コストを削減として少し 50 pg 初期素材滴定の実行がなくから実行できます。メソッドは、イルミナ/Solexa と配列する ABI/固体にも適用する必要があります、したがって、すべての 3 つのプラットフォームのアクセシビリティを広げるに役立つはず。
爆発的な放散の絶滅と現存するクマ中新-鮮新統境界付近のミトコンドリアのゲノムを明らかに。
最も研究の家族、食肉内の 1 つであるにもかかわらず、クマ家族 （クマ） のメンバー間の系統関係は、長い不明のままにしています。広く発散のトポロジは、さまざまなデータ セットと方法に基づいて提案されています。
高スループット シーケンスによってミトコンドリアのゲノム配列が決定する完全なネアンデル タール人。
完全なミトコンドリア (mt) のゲノム シーケンスは 38,000 歳 Neandertal から個別 8341 mtDNA シーケンス間で 4.8 Gb 骨の約 0.3 g から生成される DNA の識別と再建されました。組み立てられたシーケンスの解析にははっきりとネアンデル タール人のミトコンドリア Dna が現存する人間の Mtdna の変異の外に該当し、発散日付 2 のミトコンドリア Dna 系統 660,000 ± 14万年の間の推定できることを確立します。ミトコンドリア Dna にエンコードされた 13 の蛋白質のミトコンドリアの電子伝達鎖シトクロム c 酸化酵素のサブユニット 2 ネアンデルから分離以来人間の祖先のアミノ酸置換の最大数を経験しています。ミトコンドリア Dna 減少したネアンデル タール人の選択の浄化ネアンデルの効果的な人口サイズが小さかったことを示唆その他霊長類の系統と比較という証拠です。
ターゲットを絞った検索と 5 つのネアンデル タール人のミトコンドリア Dna のゲノムの解析。
ネアンデル タール人の DNA の分析のホミニン、このグループの人口の歴史を調査するための大きな可能性を保持しているが、進行はサンプルおよび DNA の破損した状態の希少性により制限されています。サンプル破壊および要求シーケンスを大幅にターゲットを絞ったの古代 DNA シーケンス検索の手法を提案し、このメソッドを使用して 5 つネアンデルからの完全なミトコンドリア DNA (mtDNA) ゲノムを越えて地理的範囲を再構築します。ミトコンドリア Dna の遺伝的多様性が 70,000 に 38,000 年前住んでいたネアンデル現代的な現代の人間の約 1/3 のことだったことを見つけます。MtDNA 蛋白質進化の分析とともに、これらのデータ ネアンデルの長期の効果的な人口サイズは現代の人間と現生類人猿よりも少ないと考えられた.
ネアンデル タール人ゲノムと古代 DNA の信憑性。
高スループット DNA シーケンシングの最近の進歩の絶滅生物のゲノムのゲノム スケール解析が可能である.これらの新しい機会を取得 DNA シーケンスの信憑性を評価する新しい難しさを来る。我々 はどのようにこれらの難しさ、ネアンデル タール人ゲノムの分析に関して特に対処できるについて説明します。我々 は、のみ直接試金ネアンデルすべての現代的な人間から異なる DNA シーケンスの位置の人間の汚染を推定する信頼性の高い手段として役立つことができることを主張します。DNA の断片化、ヌクレオチド misincorporations または異なるフラグメント サイズ クラス中の派生アレル頻度の比較の範囲などの間接手段が信頼性の高いです。幸いにも、mtDNA ネアンデル、現在ヒト Y 染色体シーケンスを通じて男性汚染の検出の違いに基づく、常染色体優性の汚染を検出するために、同じ化石からシーケンスを繰り返す中間アプローチ ネアンデル タール人ゲノムの初期大規模シーケンシングを許可します。これはネアンデルと将来の直接試金の汚染として役立つことができる現在の人間の核ゲノムの固定の違いの発見になります。将来可能になるかもしれない、その他化石のホミニンの解析より決定的な直接試金のための十分なデータを取得するまでの暫定的アプローチの適用と同様 'ブート ストラップ' アプローチをお勧めします。
Deaminated シトシンと古代 DNA における生体内でメチル化の検出の除去。
古代生物から決定される DNA シーケンスは主にウラシル塩基のシトシン脱アミノ化によって作成されたため、高い誤り率があります。ウラシル DNA グリコシラーゼとエンドヌクレアーゼ VIII 治療は古代 DNA のウラシル残基を削除し、無傷を残し、結果として得られる脱塩基部位のサイトのほとんどの修理を表示する部品 DNA のフラグメントのまま、我々 合成オリゴヌクレオチドとしてマンモスやネアンデル タール人の遺体から抽出した DNA を使用します。このプロトコルで決定のネアンデル タール人の DNA シーケンスは、精度大幅増加しています。さらに、我々 の結果は、ネアンデル タール人の DNA が潜在的遺伝子不活性化の将来の研究を許可して古代生物の刷り込みに CpG のメチル化の in vivo でのパターンを保持を示しています。
Kostenki、ロシアから、早い現代の人間の完全な MtDNA ゲノム。
DNA シーケンスの早い現代の人間 （EMHs） からの回復はネアンデルなどの古風なグループとの相互作用と人間の現在の人口の関係に光を当てることができます。しかし、現代の人間の DNA は頻繁に骨 [1, 2] を汚染するのでそのような実験は非常に問題があります。たとえば、最近のミトコンドリア (mt の) DNA 新石器時代の欧州のスケルトン、バリアントのみ不在だったか他のものする必要があるに対し、現在の人口では珍しい、可能な限り汚染 [3, 4] 割引として本格的な撮影されたシーケンスから研究します。これはまれなシーケンスを運ぶ EMH 個人に分析を制限、したがって偏見を古代の遺伝子プールとなります。DNA を汚染するのに来ているすべての個人に連絡のサンプル、ジェノタイピングなどを識別する他のアプローチはこれが可能な標本に分析を制限する [5, 6] と汚染のすべての可能なソースを除外しないでください。ネアンデル タール人のまま、どこで汚染と内因性 DNA シーケンスによってを区別できる、mtDNA 勉強して断片化のパターンとヌクレオチドの misincorporations は、古代の DNA シーケンスの信憑性を判断する使用できることを示します。これらの機能を完全な mtDNA シーケンスから約 30,000 年前 EMH ロシアで Kostenki 14 サイトからを決定します。
ネアンデルタール人のゲノムのドラフト配列
ネアンデルタール人、現代の人間の進化の最も近い親戚は、消えて万年前に前に、ヨーロッパや西アジアの大部分に住んでいました。私たちは3人から40億個のヌクレオチドから成るネアンデルタール人のゲノムのドラフト配列を提示します。世界のさまざまな部分から5現代の人間のゲノムにネアンデルタール人のゲノムの比較では、代謝と認知と骨格の発達に関与する遺伝子を含む祖先の現代人、正の選択によって影響されている可能性があり、ゲノム領域の番号を識別。私たちは、ネアンデルタール人は、非アフリカ人の祖先にネアンデルタール人からの遺伝子流動を示唆し、サハラ以南のアフリカでは現代の人間よりもユーラシアにおける現代の人間と多くの遺伝的変異を共有し互いにユーラシア·グループの分岐前に発生したことを示している。
ネアンデル タール人のゲノム配列に基づいてシーケンス キャプチャによって目標とされた調査。
絶滅した生物の全ゲノムのショットガン ・ シークエンシング法として特定のゲノム領域のキャプチャを行うことが可能になりました。ただし、ターゲットを絞った核ゲノムの大部分のリシークエンシングまだ古代 DNA の示されていません。ここでのマイクロ アレイの交配のキャプチャが正常にターゲットの領域からネアンデル タール人の DNA でも約 99.8% 微生物 DNA の存在下での結果より回復できることを示します。このアプローチを使用して、ひと系統のチンパンジーと共有の最終共通祖先の変わっていると推測される約 14,000 蛋白質のコーディング ポジションをシーケンスしました。1 つのネアンデル タール人と 50 の現代の人間の位置にこれらのシーケンスを生成することにより、人間で私たちの発散以来からネアンデル固定となっている 88 のアミノ酸置換を識別しています。
Paleogenomes--上の道路ブロック ポリメラーゼ拡張子プロファイリング古代 DNA における病変のブロックの頻度を明らかにします。
最後の数年化石標本からの DNA シーケンスの取得における大きな進歩を見てきましたが、古代 DNA の特性のいくつかよく理解されていないまま。これは DNA ポリメラーゼによってバイパスできないし、こうして増幅および後続のシーケンスの影響を受ける分子を防ぐすなわち化学変化ブロッキング病変は特にそうです。いくつかの研究を除去、修復、または病変のブロッキング バイパス劇的に時間の深さと古代 DNA 分析に使用できる標本の地理的範囲高めるかもしれないことを示唆、ブロッキング病変古代 DNA 分子の大半を運ぶことを締結しています。ただし、以前の研究は内因性古代 DNA における病変のブロックの頻度に決定的な見積もりを提供しなかった非常に間接的な検出方法を使用しました。我々 が開発した新しいメソッド、プロファイリング （PEP） ポリメラーゼ拡張子は直接ポリメラーゼが DNA のテンプレートの失速の出現を明らかにします。PEP の方法論を使用して単一のプライマー拡張製品の何千もを配列することによって、古代 DNA 1 分子レベルの最初の直接識別時にブロッキング病変のあります。私たち 4 人のうち 3 つの古代のサンプルの病変をブロックするための明確な証拠を発見したが、分子の 40% はそのような変更が以前思っていたよりも古代 DNA ではるかに頻繁にであることを示す、サンプルのいずれかの影響を受けた。
シベリアのデニソワ洞窟から古風なひと族グループの遺伝子の歴史。
南シベリアのデニソワ洞窟で見つけた指骨から抽出した DNA を使用して、我々 は古風なひと族は約 1.9-fold 報道のゲノム シーケンスしました。この個人は、ネアンデル タール人と共通の起源を共有グループからです。この人口推定遺伝子流動ネアンデル タール人からユーラシアに関わっていたない;ただし、データはその現代メラネシア人のゲノムの遺伝物質の 4-6 ％ を寄与していることをお勧めします。我々 は、この人類の居住人口 'Denisovans' を指定してそれ中後期更新世アジアで広まっている可能性が示唆されました。デニソワ洞窟で発見された歯ミトコンドリアゲノム指骨に非常に似た運ぶ。この歯のネアンデル タール人やさらに Denisovans、ネアンデル タール人と現生人類から別個の進化の歴史があることを示す、現代の人間と株式派生形態機能なし。
プライマー拡張でターゲット Dna の迅速な検索をキャプチャします。
高スループット シーケンスの前に興味のシーケンスの DNA サンプルを豊かにし、散弾銃のアプローチと関連付けられているコストを削減する方法の広範囲にわたる必要があります。結果サイズの領域にいくつかのサンプルを対象化する有用な間、交配キャプチャ アプローチなど現在のマイクロ アレイを使用してそれらはかさばる処理の手順、長いインキュベーション時間、サンプルあたりのコストが高を含みます。対照的に、プライマー拡張キャプチャ (PEC) メソッドに対して並列のサンプルで使用する低コストの 2 h 内 DNA ソースから小さなゲノム領域を直接選択できます。PEC など古代 DNA 法医学シーケンシング、測量メタゲノム サンプル、または genomic マップ反復的な要素の分類学的研究に有用なアプリケーションをお約束します。
次世代シーケンシング ライブラリ損傷 DNA からの準備。
次世代シーケンシング (NGS) 古代 DNA の研究、特に高スループット目標の濃縮方法を組み合わせるときにもたらしました。ただし、高シーケンスの深さと精度のサンプルからはしばしば古代 DNA の損傷を受けた状態のために問題を残して達成、特に古代 DNA の非常に低コピー数とウラシル残基の豊かさエラーを miscoding につながるシトシン脱アミノから派生。したがって、重要な変換は、アダプターが組み合わされて配列ライブラリに raw DNA 抽出のため非常に効率的なプロシージャを使用して同様にウラシル残基からエラーを減らすために重要です。アダプターが組み合わされてフォームの DNA のフラグメントの高効率変換できます NGS ライブラリの準備のためのプロトコルを提示します。プロトコル ウラシル病変ライブラリの準備プロセスの一部として miscoding の大部分を削除するためのオプションが組み込まれています。プロシージャには、2 つだけ列の精製ステップをスピンし、ないゲルの浄化やビーズの処理が必要です。ウラシルの除去が必要でない場合、DNA エキスの因数から始めて、図書の完成, 高い増幅 5 h または 3 h 未満生成できます。
