Translate this page to:
Korean
In JoVE (1)
Other Publications (15)
- Nature
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
- Nucleic Acids Research
- BMC Evolutionary Biology
- Cell
- Science (New York, N.Y.)
- The EMBO Journal
- Nucleic Acids Research
- Current Biology : CB
- Science (New York, N.Y.)
- Science (New York, N.Y.)
- Nucleic Acids Research
- Nature
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
Automatic Translation
This translation into Korean was automatically generated.
English Version | Other Languages
Articles by Adrian W. Briggs in JoVE
JoVE General
프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 DNA 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기
Max-Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Leipzig
우리는 우리가 5 Neandertal 개인의 전체 mitochondrial genomes을 재구성하는 데 사용되는 타겟으로 고대 DNA 시퀀스 검색의 방법을 제시한다. 현재 일 인간과 함께 이러한 시퀀스 비교 Neandertals가 장기 낮은 효과적인 인구의 크기 있다고 제안합니다.
Other articles by Adrian W. Briggs on PubMed
100만 기본 쌍 네안데르탈인 DNA의 분석
원시인 멸종 hominid 그룹 그래서 특정 해부학 적인 몸의 완벽 하 게 현대 인간 유전자 변화를 식별 하는 독특한 기회를 제공 하는 그들의 게놈 현대 인 간에 게 가장 밀접 하 게 관련 됩니다. 우리는 현대 인간의 DNA에서 오염의 예외적으로 무료 38000 세 네안데르탈인 화석을 발견 했다. 이 화석에서 DNA 추출의 직접 높은 처리량 연속 지금까지 100만 이상의 자료 쌍 hominoid 핵 DNA 시퀀스의를 얻지 못했다. 인간과 침팬지 유전자와 비교 현대 인간과 네안데르탈인 DNA 시퀀스 갈라 오 십만 년 전 평균을 보여준다. 기존 기술 및 화석 자원 네안데르탈인 게놈 시퀀싱 노력을 시작 하기에 충분 한 있다.
게놈에 손상의 패턴을 Neandertal에서 DNA 시퀀스를
높은 처리량 직접 시퀀싱 기법 최근에 연 가능성 순서 게놈에 훙 적 세 유기 체에서. 여기에서 우리는 Neandertal는 맘모스 동굴 곰에서 결정 하는 DNA 시퀀스 분석. 우리는 고 대 DNA에서 휴식에 인접 한 위치에 purines overrepresented는 제안 하는 depurination의 저하에 기여 하고있다 보여준다. 우리 또한 대체 miscoding 시 잔류물에서 그 결과 광대 하 게 DNA 시퀀스에서 overrepresented을 표시 하 고 다른 대체는 드문 반면, 분자의 끝에 과감 하 게 클러스터 된. 선물이 모델 관찰된 대체 패턴 DNA 단일 가닥 끝의 길이 닉스의 주파수의 단일 및 이중 가닥 부분에서 시 잔류물의 탈의 속도 추정 사용 됩니다. 결과 믿을 수 있는 게놈 시퀀스 훙 적 세 유기 체에서 얻을 수 있습니다 것이 좋습니다.
Picograms 하 ㎍에서: 정량 PCR 높은 처리량 시퀀싱의 소재 수요 감소
454 DNA 시퀀싱 하 여 Neandertal 및 거 대 한 유전자를 복구 하려면 현재 노력이 기술의 감도 보여줍니다. 그러나, 루틴 454 시퀀싱 응용 프로그램에는 여전히 그램 양의 초기 자료 필요. 이것은 라이브러리 시퀀싱, 고 대 DNA 및 다른 불 쌍 한 DNA 샘플을 시퀀싱 할 때 비싸고 노동 집약적인 절차를 필요로 하는 측량 454 위한 효과적인 방법의 부족 때문. 여기 우리가 이러한 한계를 효과적으로 제거할 수 있는 정량 PCR 기반 454 시퀀싱 라이브러리 정량화 방법 보고. 우리 분자 숫자와 시퀀싱 라이브러리 Neandertal DNA 추출 물, 세이 지 ditags 및 모든 적정 실행 하지 않고 최적 시퀀싱 수율을 얻는 보노보 genomic DNA에서 파생 된 조각 크기 분포 추정. 이 메서드를 사용 하 여, 454 시퀀싱 수 454 플랫폼에 샘플 처리량 및 프로토콜 개발의 범위를 증가 하는 동안 비용을 절감 함으로써 과감 하 게 적정 실행 없이 초기 자료의 작은 50 세에서 일상적으로 수행할 수 있다. 메서드와 Illumina/Solexa와 ABI 단단한 시퀀싱에도 적용 해야 따라서 세 플랫폼 모두의 접근성을 확대 하는 데 도움이 해야 합니다.
미토 콘 드리 아 게놈 공개 멸종 하 고 현존 곰 Miocene 플리오세 경계 근처의 폭발적인 방사선
하나는 식육목 내에서 가장 공부 가족 임에도 불구 하 고 곰 가족 (Ursidae) 구성원 간의 phylogenetic 관계 오래 불분명 남아 있다. 광범위 하 게 분기 토폴로지 기반 다양 한 데이터 세트와 방법으로 제안 되었습니다.
완전 한 Neandertal 미토 콘 드리 아 게놈 시퀀스 높은 처리량 시퀀싱에 의해 결정 됩니다
완전 한 미토 콘 드리 아 (산) 게놈 시퀀스는 개별 38000 세 Neandertal에서 약 0.3 g의 뼈에서 생성 된 DNA의 4.8 g b 중 식별 8341 mtDNA 시퀀스에 재건 됩니다. 조립 순서의 분석을 명백 하 게 Neandertal mtDNA 현존 인간 Mtdnas의 편차를 벗어나는 고 140000 년 + 660,000의 두 mtDNA 계보 사이 분기 날짜 견적을 수 있도록 설정 합니다. Mtdna에 인코딩된 13 단백질의 소 단위 2 미토 콘 드리 아 전자 수송 체인의 시 토 크롬 c 산화 효소 Neandertals에서 분리 이후 인간의 조상에 아미노를 함유한 산 성 대체의 가장 큰 수를 경험 했다. 증거는 Neandertals의 효과적인 인구 크기는 작은 제안 다른 영장류 계보에 비해 정화 mtDNA 감소 했다 Neandertal의 선택 이다.
대상된 검색 및 5 개의 Neandertal MtDNA 유전자의 분석
Neandertal DNA의 분석 조사 hominins,이 그룹의 인구 역사를 위한 중대 한 잠재력을 보유 하 고 있지만 진행 샘플 및 DNA의 손상된 상태의 희귀 한 때문에 제한 되었습니다. 우리 대상된 고 대 DNA 시퀀스 검색 샘플 파괴 및 시퀀싱 요구 사항을 크게 감소 시키는 방법을 제시 하 고이 메서드를 사용 하 여 그들의 지리적 범위에 걸쳐 완전 한 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 게놈에서 5 Neandertals의 재구성. 우리는 mtDNA 유전자 다양성 38000 70000 년 전에 살았던 Neandertals에는 약 1 / 3는 현대 현대 인간에서 찾을. MtDNA 단백질 진화의 분석, 함께 이러한 데이터 Neandertals의 장기 효과적인 인구 크기는 현대 인간과 현존 유인원의 그것 보다 더 작은 것이 좋습니다.
Neandertal 게놈과 고 대 DNA 신뢰성입니다
높은 thoughput DNA 시퀀싱의 최근 발전 가능한 멸종 생물의 유전자의 게놈 규모 분석을 만들었습니다. 이러한 새로운 기회와 새로운 어려움 DNA 시퀀스 검색의 신뢰성을 평가 서. 우리는 어떻게 이러한 문제가 해결 될 수 있는, Neandertal 게놈 분석에 관해서는 특히 논의. 우리는 모든 현대 인간 으로부터 Neandertals 다 DNA 시퀀스 위치의 직접 분석 실험 인간의 오염 예측을 신뢰할 수 있는 수단으로 사용할 수 있습니다 주장 한다. DNA 분열, 뉴클레오티드 misincorporations, 또는 다른 조각 크기 클래스에서 파생 된 대립 유전자 빈도의 비교의 정도 등의 간접 조치 신뢰할 수 있습니다. 다행히도, Neandertals와 현재 인간, Y 염색체 시퀀스를 통해 남성 오염 탐지 mtDNA 차이점에 기반 하 고 autosomal 오염 감지를 같은 화석에서 시퀀싱 반복 중간 접근 Neandertal 유전자의 초기 대규모 시퀀싱 허용. 따라서 Neandertals와 오염에 대 한 미래의 직접 분석 실험으로 사용할 수 있는 현재 인간 사이의 핵 게놈에서 고정된 차이의 발견. 가능한 미래에 될 수 있습니다, 다른 화석 hominins의 분석은 더 확실 한 직접 분석 실험에 대 한 충분 한 데이터를 인수 하는 때까지 임시 접근 적용 되는 유사한 ' 부트 스트랩 ' 접근 방식을 사용 하는 것이 좋습니다.
Deaminated Cytosines 그리고 Vivo에서 메 틸 화 고 대 Dna에서의 검출의 제거
DNA 시퀀스 고대의 유기 체에서 결정 시 탈에 의해 만들어진 uracil 기지 때문에 주로 높은 오류 비율이 있다. 우리 맘모스 및 Neandertal에서 추출한 DNA로 서 합성 oligonucleotides 사용, 표시 uracil DNA glycosylase와 endonuclease 8 세 치료 고 대 DNA에서 uracil 잔류물을 제거 하 고 손상 되지 않은 떠나는 결과 abasic 사이트의 대부분을 복구 하는 DNA의 부분 조각 그대로. 이 프로토콜을 결정 하는 Neandertal DNA 시퀀스 크게 정확도 증가. 또한, 우리의 결과 잠재적 유전자 비활성화의 미래 연구를 허용 하 고 고 대 생물에 각 인 Neandertal DNA vivo에서 CpG 메 틸 화 패턴을 유지 하는 보여 줍니다.
Kostenki, 러시아에서 이른 현대 인간의 완전 한 MtDNA 게놈
초기 현대 인간 (EMHs)에서 DNA 시퀀스를 복구 Neandertals 같은 고리 타 분 한 그룹으로 그들의 상호 작용 및 현재 인간의 인구에 게 그들의 관계에 주실 수 있습니다. 그러나, 이러한 실험 현재의 인간의 DNA는 자주 뼈 [1, 2] 오염 때문에 매우 문제가 있습니다. 예를 들어, 최근 연구 미토 콘 드리 아 (산) DNA의 신석기 시대 유럽 해골, 시퀀스 변종만 찍은 정통 그들이 결 석 하거나 현재 인구에서 드문 반면 다른 했다 할인 가능한 오염 [3, 4]에서. 이 드문 시퀀스를 들고 EMH 개인 분석을 제한 하 고 따라서 수익률은 고 대 유전자 풀의 한쪽으로 치우친된 보기. DNA, 모든 개인에 게로 서 샘플을 접촉 하는 유전형 등 오염 식별의 다른 접근 제한 분석 표본 이것이 가능 [5, 6] 오염에 대 한 모든 가능한 소스를 제외 하 고. Neandertal 남아, 어디로 오염 및 생 DNA 시퀀스에 의해 구분할 수 있습니다에 Mtdna를 공부 함으로써 우리는 조각화 패턴 및 뉴클레오티드 misincorporations 고 대 DNA 시퀀스의 신뢰성을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리는 러시아에서 Kostenki 14 사이트에서 약 30000 세 EMH에서 완전 한 mtDNA 시퀀스를 확인 하려면 이러한 기능을 사용.
Neandertal 게놈의 초안 시퀀스입니다
Neandertals, 현재의 인간의 진화 가까운 친척 30000 년 전에 사라져 전에 유럽과 서 부 아시아의 많은 부분에서 살 았습니다. 우리는 게놈에서 3 개인이 4 억 개 이상의 뉴클레오티드로 구성 하는 Neandertal의 초안 순서 현재. 세계의 다른 부분에서 5 현대 인간의 게놈을 Neandertal 게놈 비교 조상 현대 인간, 신진 대사에 관련 된 유전자를 등 인지 및 골격 발달에 긍정적인 선택에 의해 영향을 수 있는 게놈 영역 수를 식별 합니다. 우리는 Neandertals 사하라 사막 이남의 아프리카에서 현재의 인간 보다는 유라시아에서 현재의 인간은 더 많은 유전자 변형 공유 비 아프리카 조상에 Neandertals에서 유전자 흐름 발생 유라시아 그룹의 발산 하기 전에 서로 제안 보여줍니다.
배열 기반 시퀀스 캡처에 의해 Neandertal 게놈의 타겟된 조사
이제 멸종 생물에 대 한 특정 게놈 영역 캡처로 전체 게놈 샷건 시퀀싱을 수행 하는 것이 가능 합니다. 그러나, 핵 유전자의 큰 부분의 타겟 resequencing 아직 고 대 DNA에 대 한 증명 해야 한다. 여기 우리가 microarrays에 교 잡 캡처의 약 99.8% 미생물 DNA의 존재도 DNA Neandertal에서에서 대상 영역 megabase 보다 더 복구 성공적으로 수 있습니다 보여줍니다. 이 방법을 사용 하면 약 14000 단백질 코딩 위치 침팬지와 함께 공유 하는 마지막 공통 조상 이후 인간의 혈통에 변경으로 유추 시퀀스 한 우리. 한 Neandertal와 50 현재의 인간이이 위치에서의 시퀀스를 생성 하 여 우리 인간에서를 Neandertals에서 우리의 분기 이후 고정 되는 88 아미노를 함유한 산 성 대체를 확인 했습니다.
Paleogenomes-에로 블록 고 대 DNA에 병 변 차단 주파수를 밝혀 효소 확장 프로 파일링
지난 몇 년 동안 화석 표본에서 DNA 시퀀스 검색에 큰 진전을 보았다, 비록 고 대 DNA의 특성의 일부 저조한 이해 남아 있다. 이것은 차단 병 변, 즉 화학 변경 DNA 폴에 의해 무시 될 수 없는 및 따라서 증폭 및 영향을 받는 분자의 후속 시퀀싱을 방지 하기 위해 특히 진실 하다. 일부 연구에 따르면 고 대 DNA 분자의 대부분 차단 장애 시간 깊이 표본의 고 대 DNA 분석에 사용할 수 있는 지리적 범위 제거, 복구 또는 병 변 차단 우회 증가 극적으로 수도 제안 수행 결론. 그러나, 이전 연구 생 고 대 DNA에 병 변 차단 주파수에 결정적인 견적을 제공 하지 않은 매우 간접 검출 방법을 사용 합니다. 우리는 새로운 방법, 효소 확장 프로 파일링 (PEP) 개발을 직접 효소 DNA 템플릿에 연기의 발생을 보여준다. PEP 방법론을 사용 하 여 단일 뇌관 확장 제품의 수천을 시퀀싱 하 여 우리는 고 대 DNA 단일 분자 수준에서 처음 직접 확인 하는 시간 차단 병 변에 대 한 있다. 우리가 3 4 고 대 샘플에서 병 변 차단에 대 한 분명 한 증거 발견, 분자의 40% 해당 변경은 이전에 생각 했던 것 보다 고 대 DNA에 훨씬 덜 자주 나타내는 샘플에 영향을 받았다.
시베리아에서 Denisova 동굴에서 고리 타 분 Hominin 그룹의 유전적 인 역사
남부 시베리아에서 Denisova 동굴에서 발견 손가락 뼈에서 추출한 DNA를 사용 하 여, 약 1.9-fold 범위에 고리 타 분 hominin 게놈 시퀀스 한 우리. 이 개인은 원시인으로 일반적인 출처를 공유 하는 그룹에서. 이 인구는 Eurasians;에 원시인에서 상 유전자 흐름에 관여 하지 않습니다. 그러나, 데이터는 현재의 멜라네시아의 유전자에는 유전 물질의 4-6% 기여 것이 좋습니다. 우리 'Denisovans'이 hominin 인구를 지정 하 고 그 되었을 수도 있습니다 아시아에서 광범위 하 게 늦게 훙 적 세 시대 동안는 것이 좋습니다. Denisova 동굴에서 발견 된 치아 운반 미토 콘 드리 아 게놈 손가락 뼈의 매우 비슷합니다. 이 이빨이 원시인 또는 추가 나타내는 Denisovans 원시인과 현대 인간 다를 진화 역사를가지고 현대 인간 아니 파생된 형태소 기능을 공유 합니다.
뇌관 연장 하 여 DNA 대상 시퀀스의 신속한 검색 캡처
관심 높은 처리량 시퀀싱 하기 전에 시퀀스에 대 한 DNA 샘플을 풍부 하 게 하 고 샷건 방식으로 관련 된 비용을 줄일 수 방법에 대 한 광범위 한 필요가 있다. Megabase 크기의 영역에서 몇 가지 샘플을 대상으로 하는 데 유용 하는 동안 부피가 처리 단계, 오래 부 화 시간 및 높은 샘플 당 비용 microarrays를 사용 하 여 현재 등 교 잡 캡처 방법을 포함 한다. 반면, 뇌관 확장 캡처 (PEC) 메서드는 병렬 샘플 사용에 대 한 낮은 비용으로 2 시간 이내 DNA 소스의 작은 게놈 영역의 직접 선택할 수 있습니다. PEC는 고 대 DNA 등 taxonomic metagenomic 샘플 또는 반복적인 요소 게놈 매핑 측량 법의학 시퀀싱 연구에 유용한 응용 프로그램을 약속 드립니다.
차세대 시퀀싱 라이브러리 손상 된 DNA에서 준비 합니다
높은 처리량 대상 농축 방법과 결합 하는 경우에 특히 다음 세대 시퀀싱 (NGS) 고 대 DNA 연구에 혁명을 했다. 그러나, 달성 높은 시퀀싱 깊이 정확성 샘플에서 종종 남아 고 대 DNA의 손상 된 상태로 인해 문제가, 특히 고 대 DNA의 매우 낮은 복사본 수와 uracil 잔류물의 풍부에서에서 파생 된 오류 miscoding 이어질 시 탈. 그것은 따라서 매우 효율적인 절차를 사용 하 여 어댑터 출혈 시퀀싱 라이브러리로 원시 DNA 추출 변환에 대 한 중요 uracil 잔류물에서 오류를 줄이기 위해 똑같이 중요 하다. 선물이 어댑터 출혈 형태로 DNA 단편의 고효율 변환 수 있는 NGS 라이브러리 준비를 위한 프로토콜. 프로토콜 라이브러리 준비 과정의 일환으로 병 변 miscoding uracil의 대부분을 제거 하는 옵션을 통합 합니다. 절차는 2 열 정화 단계 회전 하 고 더 정화 또는 비드 처리 젤 필요로. DNA 추출의 혀에서 시작, 완료, 높은 증폭 라이브러리 또는 생성할 수 있습니다 5 h에서 3 h 미만 uracil 제거 필요 하지 않은 경우.
