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Articles by Aih Cheun Lee in JoVE
JoVE General
Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento
Department of Biological Sciences, Purdue University
Aplysia californica neuronas desarrollan un gran crecimiento en los conos de la cultura que son excelentes para imágenes de alta resolución de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. Aquí, se presenta un protocolo para la disección y de las planchas de las neuronas de células Aplysia bolsa, así como para la creación de una cámara de imágenes de células vivas.
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Análisis De Alta Resolución De La Morfología Neuronal Cono De Crecimiento Por La Fuerza Comparativa Atómica Y Microscopía Óptica
Conos de crecimiento neuronales son móviles estructuras sensoriales en la punta de los axones, transducir información de guía en movimientos direccionales hacia las células diana. La morfología y la dinámica de los conos de crecimiento neuronal han sido bien caracterizadas con técnicas ópticas, sin embargo, muy poca información cuantitativa está disponible en la estructura tridimensional y las propiedades mecánicas de las subregiones distintas. En el presente estudio, hemos fotografiado los conos Aplysia un gran crecimiento después de la fijación química con el microscopio de fuerza atómica (AFM) y comparar directamente los datos con imágenes obtenidas por métodos de microscopía de luz. Imagen de fuerza constante en el modo de contacto, en combinación con la fuerza distantes mediciones revelaron una altura promedio de 200 nm para el periférico (P) de dominio, a 800 nm para la transición (T), y zona de 1200 nm para la central (C) de dominio, respectivamente . Las imágenes de AFM muestran que los filopodial F-actina paquetes son más rígidos que rodea la F-actina redes. Agrandamiento de consejos filopodios son de 60 nm más altos que los ejes correspondientes. Las mediciones de las propiedades mecánicas de las regiones específicas del cono de crecimiento con el AFM reveló que la zona T es más rígido que el P y el dominio C. La comparación directa de la AFM y los datos ópticos adquiridos por contraste de interferencia diferencial y microscopía de fluorescencia reveló una buena correlación entre estos métodos de imagen. Sin embargo, el AFM proporciona información sobre la altura y el volumen en una resolución más alta que los métodos de fluorescencia con frecuencia utilizados para estimar el volumen de los compartimentos celulares. Estos hallazgos sugieren que las mediciones de AFM en los conos de crecimiento en directo proporcionará una comprensión cuantitativa de cómo las proteínas se pueden mover entre las diferentes regiones del cono de crecimiento.
Análisis Cuantitativo De La Dinámica De Los Microtúbulos Durante La Guía De Adherencia Mediada Por El Crecimiento Del Cono
Durante la adhesión mediada neuronales crecimiento microtúbulos orientación de cono experimentar reordenamientos importantes. Sin embargo, se desconoce si los microtúbulos se extienden a sitios de adhesión debido a cambios en más de fin de polimerización y / o la dinámica de la translocación, debido a los cambios en las interacciones de los microtúbulos-actina, o porque siguen la reorganización del citoesqueleto de actina. En este caso, se utilizó la microscopía fluorescente de speckle para cuantificar directamente la dinámica de los microtúbulos y la actina en los conos de crecimiento Aplysia que se vuelven hacia perlas recubiertas con el APCAM molécula de adhesión celular. Durante la fase inicial de la formación de adherencias, los microtúbulos dinámicos en el dominio periférica preferentemente explorar APCAM-bolas antes de cambios en la morfología de crecimiento cono y el flujo retrógrado de actina. Curiosamente, estos microtúbulos primeros tienen las tasas sin cambios de polimerización, pero que pasan menos tiempo en la translocación retrógrada debido a la disociación del flujo de actina. Por otra parte, los microtúbulos explorar el sitio de adherencia pasar menos tiempo en la despolimerización. Durante la fase posterior de generación de fuerza de tracción, los avances de dominio centrales y más microtúbulos en el ámbito periférico se extienden debido a la atenuación del flujo de la actina y la limpieza de las estructuras de F-actina. Los microtúbulos en la zona de transición y el dominio central, sin embargo, trasladar hacia el sitio de adherencia en concierto con arcos y haces de actina, respectivamente. Llegamos a la conclusión de que las moléculas de adhesión guiar a los conos de crecimiento neuronal y reorganización de microtúbulos subyacentes en gran parte por la regulación diferencial de actina microtúbulos movimientos de acoplamiento de la actina y la función de la región cono de crecimiento y no por el control de más de gama velocidades de polimerización.
Cortactin Colocalizes Con La Actina Filopodial Y Se Acumula En Sitios De Adhesión IgCAM En Los Conos De Crecimiento Aplysia
Ambos IgCAMs y el citoesqueleto de actina desempeñan un papel crítico en la motilidad cono de crecimiento neuronal y la orientación. Sin embargo, no está claro cómo los receptores IgCAM transducción de señales desde la membrana plasmática para inducir la remodelación de la actina. Estudios anteriores han demostrado que la agrupación local y la inmovilización de APCAM, el homólogo de NCAM Aplysia, induce la actividad de quinasa Src y polimerización F-actina en el dominio periférica de conos cultivadas bolsa Aplysia crecimiento de las células. Por lo tanto, quisimos comprobar si el sustrato de quinasa Src y cortactin regulador de la actina podría ser un vínculo molecular entre la actividad de Src y montaje de actina durante APCAM mediada por la orientación cono de crecimiento. En este caso, hemos clonado Aplysia cortactin y demostró que es abundante en el sistema nervioso. La inmunotinción de los conos de crecimiento mostró una fuerte colocalización de cortactin con F-actina en haces filopodial y en el borde de ataque de lamellipodia. La perturbación del citoesqueleto indica que la distribución de cortactin depende en gran medida los filamentos de actina. Además, activa Src colocalized con cortactin en las regiones de reunión, incluyendo la actina borde de ataque y consejos filopodios. Por último, se observó que cortactin, al igual que la F-actina, se localiza en APCAM sitios de adhesión que median orientación cono de crecimiento. En conjunto, estos datos sugieren que cortactin es un mediador de IgCAM activada por la Asamblea de actina participan en la motilidad cono de crecimiento y orientación.
La Topografía Y La Nanomecánica De Los Conos De Crecimiento Neuronal En Vivo Analizada Por Microscopía De Fuerza Atómica
Los conos de crecimiento neuronales son estructuras móviles situadas en el extremo de los axones que se traducen en información de guía extracelular en los movimientos direccionales. A pesar de la importante función de los conos de crecimiento en el desarrollo neuronal y la regeneración, se sabe relativamente poco sobre la topografía y las propiedades mecánicas de las distintas regiones subcelulares cono de crecimiento en estado activo. En este estudio, hemos utilizado el AFM para estudiar el dominio de P, la zona T, y el dominio C de los conos de crecimiento vivo Aplysia. La altura media de estas regiones se calculó a partir de contacto de modo imágenes de AFM a ser 183 + / - 33, 690 + / - 274, y 1322 + / - 164 nm, respectivamente. Estos hallazgos son consistentes con los datos derivados de las imágenes en modo dinámico de vivir y ponerse en contacto con las imágenes en modo de los conos de crecimiento fijos. Indentación nano-mediciones indican que los módulos de elasticidad del dominio C y T región zona fruncido varió entre 3-7 y 7-23 kPa, respectivamente. La gama de los módulo medido elásticas del dominio P fue 10-40 kPa. Imágenes de alta resolución del dominio P sugieren que sus resultados elástico relativamente alto módulo de una densa malla de filamentos de actina en lamellipodia y de haces de actina en la filopodios. El aumento de la rigidez mecánica de los dominios de P y T es probable importante para apoyar y transducción de la tensión que se desarrolla durante la dirección del crecimiento del cono.
Rescate De Partículas Infecciosas De Alfavirus Premontado Nucleocápside Núcleos
Alfavirus son pequeños, esféricos, envuelto, de sentido positivo, de una sola hebra de ARN, los virus responsables de la humana considerable y enfermedades de los animales. Uso de la microinyección de núcleos prefabricados como una herramienta, el sistema ha sido creado para estudiar el montaje y proceso de gemación del virus Sindbis, el miembro del tipo de los alfavirus. Se demuestra la liberación de virus infecciosos como partículas de células que expresan Sindbis glicoproteínas de la envoltura del virus después de la microinyección de nucleocápsidas virus de Sindbis purificados desde el citoplasma de las células infectadas. Además, se muestra que nucleocápsidas ensamblados in vitro son similares a los aislados en el citoplasma de las células infectadas con respecto a su capacidad para ser incorporados en viriones envueltos después de microinyección. Este sistema permite el estudio del proceso en ciernes alfavirus independiente de una infección auténtica y proporciona una plataforma para estudiar las necesidades virales y del huésped para ciernes.
