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Articles by Alan R. Godwin in JoVE
JoVE General
In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin
1Department of Biological Sciences, Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Departments of Anatomy and Cell Biology and Ophthalmology, Wayne State University School of Medicine
Noi descriviamo un metodo per abbattere condizionale l'espressione di una proteina bersaglio durante la rigenerazione adulto pinna zebrafish. Questa tecnica comporta micro-iniezione e electroporating Morpholinos oligonucleotide antisenso nel tessuto pinna, che consente di testare il ruolo della proteina in varie fasi di rigenerazione pinna, tra la guarigione della ferita, la formazione blastema, e escrescenza rigenerativa.
Other articles by Alan R. Godwin on PubMed
Differenze Nel Pattern Di Espressione E La Funzione Orthologs Di Hoxc13 Di Zebrafish: Assunzione Di Hoxc13b in Un Ruolo Embrionale Precoce
I geni Hox vertebrati sono generalmente creduti di avviare espressione presso la linea primitiva o prime fasi piastra neurale. Le restrizioni di tempi e spaziale dei modelli di espressione Hox durante queste fasi correlano bene con loro ruolo dimostrata nel patterning assiale. Qui dimostriamo che uno zebrafish hoxc13 ortholog, hoxc13a, ha un pattern di espressione nel germoglio coda in via di sviluppo che sia coerenza con il gene un ruolo nel patterning assiale. Tuttavia, il secondo ortholog hoxc13, hoxc13b, maternamente è espressa ed è rilevabile in ogni cellula embrioni scissione attraverso gastrulae di. Inoltre, sia il transcript e proteine sono rilevabili in queste fasi. A fecondazione post 19 h (hpf) hoxc13b espressione è up-regolato in boccio la coda, diventando limitato al germoglio coda da 24 hpf. Importante, da 24 hpf, hoxc13b morphants mostrano un ritardo dello sviluppo specifico, che può essere salvato da co-injecting hoxc13a tappo sintetico o hoxc13b messaggio. Questi dati suggeriscono qualche divergenza funzionale a causa di modelli di espressione alterata della due orthologs hoxc13 dopo la duplicazione. Ulteriore caratterizzazione del ritardo morphant hoxc13b rivela che è bifasica in natura, con la prima fase del ritardo che si verificano prima di gastrulazione, suggerendo un ruolo nuovo per i geni Hox vertebrati prima loro ruolo conservato nel patterning assiale. L'entità del ritardo non cambia attraverso 20 hpf; Tuttavia, un ritardo aggiuntivo emerge in questo momento. In particolare, questa seconda fase di ritardo correla con pattern di espressione hoxc13b diventando limitato al germoglio coda.
Un Paralog Famiglia Prolattina Regola Adattamenti Riproduttivi Per Un Fattore Di Stress Fisiologico
Successo specie sviluppare strategie per ottimizzare la loro performance riproduttiva. Questa ottimizzazione probabilmente include l'evoluzione dei geni che permettono la riproduzione in fisiologicamente sfidando condizioni specificamente. Il cluster di famiglia genica di prolattina (PRL) è uno dei 25 ammassi di gene specifico del mouse, la maggior parte dei quali è associata con la riproduzione. Un tema prevalente che caratterizza la famiglia PRL è la sua connessione con la gravidanza e meccanismi di controllo viviparità. PRL-come proteina (PLP-A) è uno dei 26 geni localizzati all'interno del locus famiglia PRL. È un membro della famiglia PRL nonclassical (ad es., PLP-A non utilizzare il recettore PRL) prodotte dalle cellule del trofoblasto della placenta chorioallantoic e atti su uterine le cellule natural killer. In questa relazione, la biologia di PLP-A è stata studiata mediante la generazione di topi con una mutazione di PLP-A null. In condizioni di allevamento standardizzato, PLP-A possiede modesti effetti sulla performance riproduttiva. Tuttavia, questo stesso gene è fondamentale per la riproduzione quando i topi sono esposti a un fattore di stress fisiologico. Selvaggio-tipo topi esposti all'ipossia ipobarica durante la gestazione prontamente adeguare e mantengono loro gravidanze, mentre topi mutanti null PLP-A non riuscire ad adattarsi, con conseguente insufficienza di gravidanza. PLP-A contribuisce all'ipossia indotta adattamenti critici al flusso così nutriente ai tessuti extraembryonic ed embrionali e placentazione hemochorial. I risultati forniscono approfondimenti specifici adattamenti riproduttivi.
Integrazione Delle Cellule Staminali Embrionali Nella Cultura Organo Rene Metanefritico
Molte fasi di nephrogenesis possono essere studiati utilizzando reni embrionali coltivati, ma non esiste nessuna tecnica efficiente di transgeni prontamente atterramento o overexpress per la valutazione rapida di fenotipi risultanti. Le cellule staminali embrionali (ES) hanno potenziale dello sviluppo illimitato e può essere manipolato a livello genetico molecolare di una varietà di metodi. Lo scopo di questo studio era di determinare se le cellule ES potrebbero rispondere ai segnali dello sviluppo entro il giorno embrionali del mouse 12 al microambiente di rene 13 (E12 a E13) del giorno embrionale e incorporare nelle strutture renali. Le cellule ES ROSA26 sono state mostrate per esprimere la beta-galattosidasi ubiquitously Quando coltivate in presenza di fattore inibitorio di leucemia a sopprimere la differenziazione. Quando queste cellule sono state microinjected in E12 a E13 metanephroi e poi collocate nella cultura organo transwell, cellule ES cellule derivate, beta-galattosidasi-positivi sono state identificate nelle strutture epiteliali simile a tubuli. In rare occasioni, singole cellule ES sono state osservate in strutture simili a ciuffi glomerulare. Microscopia elettronica hanno dimostrato che i tubuli derivati da cellule ES sono circondati da una membrana basale e avevano microvilli apicali e complessi giunzionali. Marcatore analisi hanno rivelato che un sottoinsieme di questi tubuli epiteliali associato Lotus tetragonolobus ed espresso alpha(1) Na(+)/K(+) ATPasi. Le cellule ES sono state infettate prima iniezione con un adenovirus di citomegalovirus fluorescenza verde-promotore protein (GFP) ed espressione di GFP è stato trovato più presto 18 h, persistendo per 48 h in reni colti. Questa tecnologia di cellule ES possa conseguire l'obiettivo di ottenere un sistema di coltura cellulare versatile in cui gli interventi molecolari possono essere impiegati in vitro e le conseguenze di queste perturbazioni sul programma di sviluppo renale normale in vivo possono essere studiate.
Matrix Metalloproteinase Espressione E Funzione Durante Fin Rigenerazione Nello Zebrafish: Analisi Di MT1-MMP, MMP2 E TIMP2
Metalloproteinasi della matrice (MMP) giocano un ruolo chiave nel fatturato di matrice extracellulare (ECM) e, quindi, fungono da regolatori chiave delle interazioni cellula-ECM durante lo sviluppo. Nonostante la loro importanza nel corso di processi di sviluppo, relativamente poco è stato segnalato circa il ruolo di questi metalloproteinases durante la rigenerazione e lo sviluppo degli arti. Per affrontare il problema delle interazioni cellula-ECM durante la rigenerazione degli arti (fin), abbiamo utilizzato zebrafish come modello sperimentale. Basato sul precedente MMP clonazione studi dal nostro laboratorio, lo studio attuale è concentrata sull'espressione di membrana-tipo 1 metalloproteinase (MT1-MMP), gelatinasi A (MMP-2) e inibitore endogeno tessuto 2 di metalloproteinasi (TIMP-2) durante la rigenerazione di pinna in zebrafish adulto. L'analisi in situ indicato co-expression del zmt1-mmp, zmmp-2 e 2 ztimp trascritti di mRNA in rigenerante pinne caudali. Gelatina in situ-zimogramma ha confermato la presenza di metalloproteinasi attivo in pinne di rigenerazione. zmt1-mmp, zmmp-2 e ztimp-2 mRNA trascrizioni sono state espresse nel blastema e basale dell'epitelio durante la rigenerazione di pinna caudale mentre espressione delle trascrizioni [zcol-IV(a5)] di collagene di tipo IV (un componente di lamina basale) è stata limitata a epitelio basale. Escrescenza pinna è stato notevolmente ridotto in presenza di GM6001 (un inibitore dell'attività MMP) che indica l'importanza di questi enzimi durante la rigenerazione di pinna. Precedenti studi di Itoh (EMBO, 2001) indicarono che espressione di un vertebrato MT1-MMP costrutto contenente che solo i domini Emopessina-transmembrana-citoplasmatici (MT1HPX) ha portati nel blocco della formazione di complessi omofilo MT1-MMP e conseguente inibizione dell'attivazione pro-MMP-2. Interferenza con la formazione dei complessi omofilo è stata attribuita all'espressione del dominio Emopessina alla superficie delle cellule. Basandosi su questi risultati precedenti, lo studio corrente ha trovato che espressione ectopica di MT1HPX nella pinna rigenera inibito il processo di rigenerazione e portato ad una riduzione della proliferazione cellulare nel blastema. Presi insieme, questi risultati indicano che MMP hanno un ruolo importante durante la rigenerazione di pinna in zebrafish.
Ricombinazione Mediata Cre Site-specific in Embrioni Di Zebrafish
Ricombinazione sito-specifica cre-mediata è diventato uno strumento prezioso per la manipolazione del genoma murino. La capacità di attivare in modo condizionale espressione genica o per generare alterazioni cromosomiche con questo stesso strumento rafforzerebbe notevolmente zebrafish genetica. Questo studio dimostra che il promotore HSP70 può essere utilizzato per controllare inducibly espressione di una proteina di fusione avanzata proteina fluorescente verde (EGFP) - Cre. La proteina di fusione EGFP-Cre è in grado di promuovere la ricombinazione tra i siti lox in plasmidi iniettati o stabile ereditato transgeni già come induzione post-heat shock 2 hr. Infine, i livelli di espressione di Cre raggiunto in una linea di pesci transgenici che trasportano il transgene HSP70-EGFP-cre sono compatibili con la redditività e pesce transgenico sia maschio che femmina sono fertile dopo induzione dell'espressione di EGFP-Cre. Quindi, i nostri dati suggeriscono che quello ricombinazione mediata Cre è uno strumento efficace di manipolazione di espressione genica in zebrafish.
Inibizione Della Rigenerazione Di Pinna Zebrafish Usando Elettroporazione in Vivo Di Morpholinos Contro Fgfr1 E Msxb
Maggiore interesse utilizzando zebrafish come organismo modello ha portato a una rinascita degli studi di rigenerazione di pinna. Questo ha permesso l'identificazione di un gran numero di famiglie di gene, compresa la segnalazione di molecole e fattori di trascrizione, che sono espressi durante la rigenerazione. Tuttavia, nei casi in cui nessun inibitore specifico è disponibile per il prodotto del gene di interesse, determinazione di un ruolo funzionale per questi geni è stata difficile. Qui dimostriamo che in vivo elettroporazione dei oligonucleotides oligonucleotidi è un approccio fattibile per proteina knock-down durante la rigenerazione di pinna. Oligonucleotidi oligonucleotides contro fgfr1 e msxb furono utilizzati e knock-down di entrambe le proteine ha portato escrescenza pinna ridotta. Soprattutto, Fgfr1 knock-down phenocopied escrescenza inibizione ottenuto con un inibitore Fgfr1. Inoltre, questo metodo ha fornito prove dirette per un ruolo funzionale per msxb nella rigenerazione della pinna caudale. Infine, knock-down del Fgfr1, ma non Msxb, influenzato l'espressione blastemal di msxc, suggerendo che questa tecnica può essere utilizzata per determinare l'epistasi in percorsi genetici che interessano la rigenerazione. Così, questo approccio di genetico inverso conveniente permettono ai ricercatori di (1) valutare rapidamente la funzione dei geni noti per essere espresso durante la rigenerazione di pinna, (2) geni schermo per rilevanza funzionale durante la rigenerazione di pinna, e (3) assegnare geni per le vie molecolari sottostanti fin rigenerazione.
Una Citochina Delle Cellule Deciduali Uterine Garantisce Adattamenti Dipendente Dalla Gravidanza Per Un Fattore Di Stress Fisiologico
Nel topo, le cellule deciduali differenziano da cellule stromali uterine in risposta a segnali derivanti dall'embrione e ormoni steroidei. Cellule deciduali sono fondamentalmente coinvolti nella creazione dell'ambiente intrauterino favorevole allo sviluppo embrionale. Tra le molte funzioni è la produzione di citochine correlate alla prolattina (PRL), tra cui deciduali prolattina-related protein (DPRP). DPRP è una citochina eparina-associazione, che è abbondantemente espresso nella decidua uterina. In questa indagine, abbiamo isolato il gene Dprp mouse, caratterizza la sua struttura e valutato il suo ruolo biologico. Null Dprp topi sono state fatte da esoni 2 a 6 del gene Dprp la sostituzione con un gene in telaio migliorato green fluorescent protein (EGFP) e una cassetta di resistenza neomicina (neo). Eterozigote intercross allevamento dei topi mutanti ha reso l'atteso rapporto mendeliana. Femmine eterozigoti incinta espresso EGFP all'interno di tessuti deciduali in località identica all'espressione di mRNA e proteina Dprp endogeno. Omozigoti Dprp null mutanti topi maschi e femmine erano tassi di crescita postnatale normale vitali, esposte, dimensioni lettiera normale fertile e prodotto. Un fenotipo prominente è stato osservato quando incinti topi Dprp-null sono stati esposti a un fattore di stress fisiologico. Deficit di DPRP interferito con la gravidanza-dipendente adattamenti all'ipossia con conseguente insufficienza di gravidanza. Interruzione della gravidanza è stato associato con aberrazioni in cellule deciduali mesometrial, mesometrial l'integrità vascolare e interruzioni nella morfogenesi chorioallantoic placenta. Le osservazioni suggeriscono che DPRP partecipa adattamenti dipendente dalla gravidanza per un fattore di stress fisiologico.
Entrambi Orthologs Hoxc13 Sono Funzionalmente Importanti Per La Rigenerazione Di Zebrafish Pinna Caudale
I geni Hox sono riespresse durante la rigenerazione in molte specie. Dato il loro importante ruolo nel piano di sviluppo di corpo, è stato assunto, ma non direttamente indicato, che svolgono un ruolo funzionale nella rigenerazione. In questo articolo mostriamo quello mediato oligonucleotides atterramento di Hoxc13a o di Hoxc13b durante il processo di zebrafish pinna caudale risultati di rigenerazione in una significativa riduzione di escrescenza rigenerativa. Inoltre, proliferazione cellulare entro il blastema è direttamente influenzata in entrambe atterramento. Quindi, simile alla dimostrazione delle funzioni uniche di molteplici geni Hox durante la formazione degli arti, entrambi orthologs Hoxc13 hanno funzioni distinte in rigenerazione.
Il Gene Mutante Nudo Foxn1 è Un Target Normativo HOXC13 Durante Il Follicolo Pilifero E La Differenziazione Del Chiodo
Tra i geni Hox, homeobox C13 (Hoxc13) ha dimostrato di essere essenziale per la differenziazione dell'albero dei capelli adeguato, come Hoxc13 gene targeting (Hoxc13(tm1Mrc)) topi completamente privi di capelli esterni. A causa della notevole parallels palese fenotipica di topi mutanti (nudi) Foxn1(nu), abbiamo cercato di determinare se Hoxc13 e forkhead box N1 (Foxn1) potrebbe agire in un percorso comune di differenziazione del follicolo pilifero (HF). Mostriamo che la alopecia esposta dai topi la Hoxc13(tm1Mrc) e la Foxn1(nu) è a causa di difetti straordinariamente simili nella differenziazione dell'albero dei capelli e che entrambi mutanti soffrono di una distrofia ungueale grave. Queste somiglianze fenotipiche sono coerenti con l'ampia sovrapposizione tra Hoxc13 e Foxn1 pattern di espressione in HF e la matrice dell'unghia. Inoltre, analisi microarray del DNA della pelle da topi Hoxc13(tm1Mrc) identificato Foxn1 come significativamente downregolata insieme a numerosi geni di cheratina dei capelli. Questa downregulation Foxn1 apparentemente riflette la perdita di controllo trascrizionale diretto da HOXC13 come indicato dai nostri risultati ottenuti attraverso analisi di immunoprecipitazione (ChIP) di co-transfection e della cromatina. Come presentato nella discussione, questi dati supportano un modello normativo di differenziazione dei cheratinociti, nel cui HOXC13-dipendente attivazione di Foxn1 è parte di una cascata di regolamentare l'espressione di marcatori di differenziazione terminale di controllo.
