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Articles by Alan R. Godwin in JoVE
JoVE General
En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola
1Department of Biological Sciences, Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Departments of Anatomy and Cell Biology and Ophthalmology, Wayne State University School of Medicine
Se describe un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína diana durante la regeneración de la aleta del pez cebra adulto. Esta técnica implica la inyección de micro y electroporación morfolinos antisentido de oligonucleótidos en el tejido de la aleta, que permite probar el papel de la proteína en varias etapas de regeneración de la aleta, incluyendo la curación de heridas, la formación blastema, y consecuencia regenerativa.
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Las Diferencias En El Patrón De Expresión Y La Función Entre Pez Cebra Hoxc13 Orthologs: Reclutamiento De Hoxc13b En Un Papel Embrionario Temprano
Vertebrados genes Hox se cree generalmente para iniciar la expresión en la línea primitiva o de las primeras etapas de la placa neural. El tiempo y las restricciones espaciales de los patrones de expresión de Hox durante estas etapas se correlacionan bien con su papel demostrado en el patrón axial. Aquí demostramos que un pez cebra hoxc13 ortholog, hoxc13a, tiene un patrón de expresión en el brote de la cola en desarrollo que sea coherente con el gen juega un papel en el patrón axial. Sin embargo, el segundo ortholog hoxc13, hoxc13b, es la madre expresa y es detectable en todas las células de embriones tempranos a través de su desdoblamiento gastrulae. Además, tanto la transcripción y las proteínas son detectables en estas etapas. A los 19 h post fertilización (HPF), la expresión hoxc13b está regulado en el brote de la cola, llegando a ser restringido a la yema de cola por 24 HPF. Es importante destacar que un 24 por HPF, morphants hoxc13b muestran un retraso de desarrollo específico, que puede ser rescatado por la co-inyección sintética con tapa hoxc13a o mensaje hoxc13b. Estos datos sugieren una divergencia funcional debido a los patrones de expresión alterados de la orthologs dos hoxc13 después de la duplicación. Además de la caracterización de la demora hoxc13b morphant revela que es bifásica en la naturaleza, con la primera fase de la demora que ocurre antes de la gastrulación, lo que sugiere un nuevo papel para los genes Hox vertebrados antes de que su función conservada en el patrón axial. La medida del retardo no cambia a través de 20 HPF, sin embargo, un retraso adicional surge en este momento. Cabe destacar que esta segunda fase de la demora se correlaciona con el patrón de expresión hoxc13b ser restringido al brote de la cola.
Una Paralog Familia De Prolactina Regula Reproductivas Adaptaciones a Un Factor Estresante Fisiológico
Especies exitosas estrategias para optimizar su desempeño reproductivo. Esta optimización probablemente incluye la evolución de los genes que permiten específicamente reproducción fisiológicamente desafiar las condiciones. El cluster de genes familiares de prolactina (PRL) es uno de los 25 grupos de genes específicos de ratón, la mayoría de los cuales está asociada con la reproducción. Un tema predominante que caracterizan a la familia PRL es su conexión con el embarazo y los mecanismos que controlan la Viviparidad. PRL-como la proteína A (PLP-A) es uno de los 26 genes situados en el centro familiar de PRL. Es miembro de la familia PRL nonclassical (p.e., PLP-A no usar el receptor PRL) producida por las células del trofoblasto de la placenta corioalantoideas y actúa sobre las células de asesino naturales uterinas. En este informe, la biología del PLP-A ha sido investigada por la generación de ratones con una mutación nula PLP-A. Condiciones estandarizadas de cría de animales, PLP-A posee efectos modestos sobre comportamiento reproductivo. Sin embargo, este mismo gen es fundamental para la reproducción cuando ratones están expuestos a un factor estresante fisiológico. Salvaje-tipo ratones expuestos a hipoxia hipobárica durante la gestación fácilmente adaptan y mantienen sus embarazos, mientras que los ratones mutantes nulos PLP-A no adaptar, dando por resultado falta de embarazo. PLP-A contribuye a adaptaciones inducida por hipoxia críticas hemochorial placentación y el flujo así nutriente a los tejidos embrionarios y extraembrionarias. Los resultados proporcionan penetraciones en adaptaciones reproductivas propios de cada especie.
Integración De Células Madre Embrionarias En Cultivo Metanephric Riñón
Muchas etapas de nephrogenesis pueden ser estudiadas usando los riñones embrionarios cultivados, pero no hay técnica eficiente disponible para fácilmente caída o sobrexpresan transgenes para evaluación rápida de fenotipos resultantes. Las células madre embrionarias (ES) tienen potencial de desarrollo ilimitado y puede ser manipulado a nivel genético molecular por una variedad de métodos. El objetivo de este estudio fue determinar si células madre embrionarias podrían responder a señales del desarrollo dentro del día embrionarias de ratón 12 a microambiente de riñón de (E12 a E13) 13 día embrionario e incorporar estructuras del riñón. ROSA26 ES las células fueron demostradas para expresar la beta-galactosidasa ubicuo cuando cultivadas en presencia de factor inhibidor de leucemia para suprimir la diferenciación. Cuando estas células fueron microinyectadas en E12 a metanephroi E13 y colocan en cultura de órgano transwell, células madre embrionarias derivadas de células, beta-galactosidasa-positivos fueron identificadas en estructuras epiteliales que se asemejan a los túbulos. En raras ocasiones, se observaron células madre embrionarias individuales en estructuras que se asemejan a penachos glomerulares. La microscopia electrónica demostró que los túbulos de célula-derivados ES fueron rodeados por la membrana basal y apicales microvellosidades y complejos junctional. Marcador análisis reveló que un subconjunto de estos túbulos epiteliales había obligado tetragonolobus Lotus y expresó alfa ATPasa de Na(+)/K(+). Células madre embrionarias fueron infectados antes de la inyección con un adenovirus de proteína (GFP) fluorescencia promotor de citomegalovirus y expresión de GFP se encontró tan pronto como 18 h, persistiendo por hasta 48 h en riñones cultivados. Esta tecnología de célula ES puede alcanzar el objetivo de obtener un sistema de cultivo celular versátil que intervenciones moleculares pueden utilizarse in vitro y se pueden estudiar las consecuencias de estas perturbaciones en el programa de desarrollo normal del riñón en vivo.
Matrix Metaloproteinasa Expresión Y La Función Durante La Regeneración De Aleta De Pez Cebra: Análisis De MT1-MMP, MMP2 Y TIMP2
Metaloproteinasas de matriz (MMP) juegan un papel clave en la rotación de la matriz extracelular (MEC) y, por tanto, funcionan como reguladores clave de las interacciones célula-ECM durante el desarrollo. A pesar de su importancia en los procesos de desarrollo, relativamente poco se ha informado sobre el papel de las metaloproteinasas de estos durante el desarrollo de las extremidades y la regeneración. Para abordar el problema de las interacciones célula-ECM durante la extremidad (fin) la regeneración, hemos utilizado el pez cebra como modelo experimental. Sobre la base de estudios previos de MMP clonación de nuestro laboratorio, el estudio actual se ha centrado en la expresión de una membrana de tipo metaloproteinasa (MT1-MMP), gelatinasa A (MMP-2) y tejido inhibidor endógeno de dos de las metaloproteinasas (TIMP-2) durante el aleta de la regeneración en el pez cebra adulto. En el análisis in situ indican co-expresión de MMP-zmt1, zmmp-2, y ztimp-2 transcripciones de ARNm en la regeneración de las aletas caudales. En situ gelatina-zimografía confirmó la presencia de las metaloproteinasas activos en las aletas de regeneración. zmt1-MMP, zmmp-2, y ztimp-2 transcripciones de ARNm se expresaron en el blastema durante la regeneración del epitelio basal de la aleta caudal, mientras que la expresión de colágeno tipo IV [zcol-IV (A5)] transcripciones (un componente de la lámina basal) se limitó a el epitelio basal. Fin consecuencia se redujo considerablemente en presencia de GM6001 (un inhibidor de la actividad de MMP) que indica la importancia de estas enzimas durante la regeneración de la aleta. Estudios previos realizados por Itoh (EMBO, 2001) indica que la expresión de un vertebrado MT1-MMP construcción que contiene sólo los dominios transmembrana hemopexina-citoplasma (MT1HPX) dio como resultado el bloqueo de la formación de MT1-MMP homophilic complejo y posterior inhibición de la pro-MMP-2 activación. La interferencia con la formación de complejos homophilic se atribuyó a la expresión del dominio hemopexina en la superficie celular. Basándose en estos hallazgos anteriores, el presente estudio encontró que la expresión ectópica de MT1HPX regenera en las aletas inhibe el proceso de regeneración y dio lugar a una reducción en la proliferación celular en el blastema. En conjunto, estos resultados indican que las MMPs tienen un papel importante durante la regeneración de la aleta de pez cebra.
Cre Mediada Por Recombinación Específica De Sitio En Embriones De Pez Cebra
Cre mediada por recombinación específica de sitio se ha convertido en una valiosa herramienta para la manipulación del genoma murino. La capacidad de activar la expresión génica de forma condicional o para generar alteraciones cromosómicas con esta misma herramienta mejoraría en gran medida la genética del pez cebra. Este estudio demuestra que el promotor HSP70 puede ser utilizado para controlar la expresión inducible de una mayor proteína verde fluorescente (EGFP) proteína de fusión-Cre. La proteína de fusión EGFP-Cre es capaz de promover la recombinación entre los sitios lox en plásmidos inyectados o en los transgenes establemente heredados tan pronto como la inducción 2 horas después de choque térmico. Por último, los niveles de expresión de Cre logrado en una línea de peces transgénicos que lleva el transgén EGFP-HSP70-creación son compatibles con la viabilidad y los peces transgénicos tanto hombres como mujeres fértiles son posteriores a la inducción de la expresión de Cre-EGFP. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que Cre mediada por recombinación es un medio viable de manipular la expresión génica en el pez cebra.
La Inhibición De La Regeneración De Aleta De Pez Cebra Empleando Electroporación in Vivo De La Morpholinos Contra FGFR1 Y Msxb
El creciente interés en el uso de pez cebra como modelo ha dado lugar a un resurgimiento de los estudios de regeneración de las aletas. Esto ha permitido la identificación de un gran número de familias de genes, incluyendo moléculas de señalización y factores de transcripción, que se expresan durante la regeneración. Sin embargo, en casos en que no inhibidor específico está disponible para el producto del gen de interés, la determinación de un papel funcional de estos genes ha sido difícil. Aquí demostramos que la electroporación in vivo de los oligonucleótidos morfolino es un enfoque viable para la proteína de knock-down durante la regeneración de la aleta. Oligonucleótidos Morpholino contra FGFR1 y msxb fueron utilizados y knock-down de ambas proteínas dio lugar a consecuencia de la aleta reducida. Es importante destacar que FGFR1 derribo consecuencia la inhibición phenocopied obtenido con un inhibidor de FGFR1. Además, este método proporciona una evidencia directa de un papel funcional para msxb en la regeneración de la aleta caudal. Por último, knock-down de FGFR1, pero Msxb, no afectó la expresión de la blastémicas msxc, lo que sugiere que esta técnica puede ser utilizada para determinar la epistasis en las vías genéticas que afectan a la regeneración. Por lo tanto, este práctico enfoque genético inversa permite a los investigadores de forma rápida (1) evaluar la función de genes conocidos que se manifiesten durante la regeneración de la aleta, (2) genes en busca de relevancia funcional durante la regeneración de la aleta, y (3) asignar a los genes de las vías moleculares que subyacen a aleta regeneración.
Una Citoquina Uterina Celular Decidual Asegura Adaptaciones De Embarazo-dependiente a Un Factor Estresante Fisiológico
En el ratón, células decidual diferencian en células del estroma uterinas en respuesta a las hormonas esteroides y señales derivadas del embrión. Células decidual crucial participan en crear el ambiente intrauterino conducente al desarrollo embrionario. Entre sus muchas funciones es la producción de citocinas relacionadas con la prolactina (PRL), incluyendo la proteína relacionada con la prolactina decidual (DPRP). DPRP es una citoquina de heparina, que se expresa abundantemente en la decidua uterina. En esta investigación, hemos aislado el gen de ratón Dprp, caracteriza su estructura y evaluó su función biológica. DPRP nulo ratones se hicieron mediante la sustitución de los exones 2 a 6 del gen Dprp con un gen de la proteína fluorescente verde mejorada en-marco (EGFP) y una cinta de resistencia de neomicina (neo). Cría intercross heterozigótica de los ratones mutantes rindió la proporción mendeliana esperada. Las hembras embarazadas heterocigoto expresan EGFP dentro de tejido decidual en lugares idénticos a endógena Dprp expresión de mRNA y proteína. Homocigóticos Dprp nulo masculinos y femeninos ratones mutantes fueron las tasas de crecimiento postnatal normal viable, expuestas, tamaños de camada normales fértiles y producido. Un fenotipo prominente observó cuando embarazadas ratones Dprp nulo fueron expuestos a un factor estresante fisiológico. Deficiencia DPRP interfirió con adaptaciones de embarazo-dependiente a la hipoxia, dando por resultado falta de embarazo. La interrupción del embarazo se asoció con aberraciones en células decidual mesometrial, integridad vascular mesometrial y perturbaciones en la morfogénesis de placenta corioalantoideas. Las observaciones sugieren que DPRP participa en adaptaciones de embarazo-dependiente a un factor estresante fisiológico.
Tanto Hoxc13 Orthologs Son Funcionalmente Importantes Para El Pez Cebra Aleta De Cola De Regeneración
Los genes Hox se re-expresadas durante la regeneración de muchas especies. Dado su importante papel en el desarrollo del cuerpo del plan, se ha asumido, pero no se muestra directamente, que desempeñan un papel funcional en la regeneración. En este trabajo se muestra que morpholino mediada por caída de cualquiera de las Hoxc13a Hoxc13b o durante el proceso de regeneración de la cola de pez cebra resultados de aleta en una reducción significativa de la consecuencia regenerativa. Por otra parte, la proliferación celular en el blastema se ve directamente afectado tanto en caídas. Por lo tanto, similar a la demostración de las funciones únicas de múltiples genes Hox durante la formación de las extremidades, tanto Hoxc13 orthologs tienen funciones distintas en la regeneración.
El Gen Mutado Desnudo Foxn1 Es Un Objetivo Regulatorio De HOXC13 Durante El Folículo Del Pelo Y Uñas Diferenciación
Entre los genes Hox, homeobox C13 (Hoxc13) ha demostrado ser esencial para la diferenciación de eje de pelo adecuado, ya Hoxc13 gene-dirigidas (Hoxc13(tm1Mrc)) ratones completamente carecen de pelo externo. Debido a los notables abiertos fenotípicos paralelos a los ratones mutantes (desnudos) Foxn1(nu), intentamos determinar si Hoxc13 y forkhead box N1 (Foxn1) puede actuar en un camino común de diferenciación del folículo piloso (HF). Mostramos que el exhibido por los ratones de la Hoxc13(tm1Mrc) y la Foxn1(nu) de la alopecia es debido a defectos sorprendentemente similares en la diferenciación de eje de pelo y que ambos mutantes sufren una distrofia severa del clavo. Estas similitudes fenotípicas son consistentes con la extensa superposición entre Hoxc13 y Foxn1 patrones de expresión en el HF y la matriz ungueal. Además, el análisis de microarrays de ADN de la piel de ratones Hoxc13(tm1Mrc) había identificado Foxn1 como significativamente o junto con numerosos genes de la queratina del pelo. Este Foxn1 downregulation aparentemente refleja la pérdida de control transcripcional directo por HOXC13 según lo indicado por los resultados obtenidos a través de ensayos de co-transfection y cromatina (ChIP) de inmunoprecipitación. Tal como se presenta en la discusión, estos datos apoyan un modelo normativo de la diferenciación de queratinocitos en que HOXC13-dependiente activación de Foxn1 es parte de una cascada de regulación control de la expresión de marcadores de diferenciación terminal.
