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Articles by Alberto Bartesaghi in JoVE
JoVE Immunology and Infection
使用低温电子断层扫描和自动子断层扫描平均HIV包膜糖蛋白分子结构的测定
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
协议描述了高通量的方法，以确定使用低温电子断层扫描和三维图像处理的膜蛋白的结构。它涵盖了样品制备的详细信息，数据采集，数据处理和解释，最后一个有代表性的目标的方法，HIV - 1包膜糖蛋白的生产。这些计算程序设计的方式，使研究人员和学生远程工作和作出贡献的数据处理和结构分析。
Other articles by Alberto Bartesaghi on PubMed
电子 Tomograms 的定量解释一个基于能量三维分割方法。
电子断层扫描允许这是可能与光学显微镜的细胞和组织决议大大高于在三维结构测定。电子 tomograms 原则，包含大量的亚细胞程序集和细胞器的结构和大量的关于位置的信息。Tomograms 中的功能分析可靠定量方法的发展是一个重要的问题和具有挑战性的前景，由于所固有的生物电子显微图像低信号的信噪比。部分，这是生物标本的巨大复杂性的一个后果。我们报告的艾滋病毒颗粒自动分割的新方法，并且在电子 tomograms 记录从固定、 塑料嵌入部分来自感染艾滋病毒的人巨噬细胞中选择蜂窝车厢。断层扫描中的个别功能是用一种新的鲁棒算法由图像特征定义度量空间中找到它们的边界为全局极小曲面细分的。中心内点的兴趣，提供快速、 准确的分割能源最小化的正确设置的粒子具有转化球形域中进行优化。此方法为半自动的检测和艾滋病毒颗粒细胞中的程序集的不同阶段的统计评价提供了工具和与艾滋病毒感染的生化标志物的相关性机会。在这里开发的分割算法电子 tomograms 的自动分析的基础，并将尤其有用鉴于数据采集的速度快速增加。它还可以使更大的数据集，如那些可能获得艾滋病毒感染细胞研究大量的人口从层析成像分析研究。
电子断层扫描的 T 细胞和 SIV/艾滋病毒-1 之间的接触： 对病毒性条目的影响。
慢的灵长类动物，包括人类和猴免疫缺陷病毒 （艾滋病毒和 SIV），包膜糖蛋白是 heterodimers 的跨膜糖蛋白 (通常 gp41) 和表面糖蛋白 (gp120) 对目标细胞 CD4 着手病毒性条目有约束力。我们用电子断层扫描以确定纯净 SIV virions 隔离和 CD4 + 靶细胞接触的三维体系结构。在三联病毒信封糖蛋白表面峰值是异构的外观和通常大约 120 长和大约 120 A 宽处远端。通过颈形的接触区域，大约 400 A 广阔，一贯由组成的五至七杆形功能，每个大约 100 A 密群集的长时间和大约 100 A T 细胞表面的 SIV 或艾滋病毒 1 对接发生范围。这一独特结构不观察到病毒时与 T 淋巴细胞面前抗 CD4 抗体、 TAK779、 CCR5 拮抗剂或肽进入抑制剂 SIVmac251 C34 孵化。为绑定到单元格的 virions，几个三聚体离此群集在病毒颗粒细胞接口，即使在显示多达 70 信封糖蛋白三聚体每个病毒颗粒的病毒制剂被使用的情况下观察到。此联系人的区域，我们称之为"入口爪"，提供了空间范围，了解病毒性条目的分子机制。测定分子的组成和结构的条目爪将有助于改进药物抑制艾滋病毒 1 条目的识别。
电子断层扫描病毒。
理解的封装和复杂病毒分子体系结构在结构生物学中是具有挑战性的前沿。这些病毒，从一个病毒粒子为另一种的结构和成分变化一般排除结晶或图像平均高度对称病毒过去已成功执行的程序的使用。虽然家人清清白白标本低温电子层析成像研究进展提供鉴定和分子平均纯化病毒表面的糖蛋白刺等个别子组件的新机会，电子断层扫描的染色和暴跌冻结单元格被用于可视化细胞内病毒入境和复制。在这里，我们检讨最近的事态发展，在这两个领域，因为他们关系到我们理解生物学的异构和 pleiomorphic 病毒。
本机艾滋病毒 1 Gp120 三聚体的分子体系结构。
人和猴免疫缺陷病毒包膜糖蛋白 (Env) (艾滋病毒和 SIV，分别） 调解受病毒细胞表面体结合 CD4 靶细胞上的进行感染。Env 是膜的黑腹的跨膜糖蛋白 (gp41) 和表面的糖蛋白 (gp120) 和病毒性表面形式三聚体。我们使用低温电子断层扫描三维图像分类和平均结合起来，报告对本机艾滋病毒-1 unliganded 状态、 复杂与广泛中和抗体 b12 和三元复数与 CD4 和 17b 抗体显示三联 Env 的三维结构。由管接头中的 b12 和 CD4 17b 时限构象到电子断层派生的密度地图单体 gp120 核心的已知的晶体结构，我们推导出在 unliganded 和 CD4 束缚态的本机艾滋病毒 1 gp120 三聚分子模型。我们证明 CD4 绑定在一次重大改组的 Env 三聚体，结果造成向外旋转和位移的每个 gp120 单体。这似乎会加上重排 gp41 地区沿着中轴线的三聚体，导致病毒性与目标细胞细胞膜之间的密切联系。我们的研究结果阐明的结构和有关的中和抗体与靶细胞的附件三联艾滋病毒 1 gp120 构象变化。
使用低温电子断层扫描及三维图像显示平均膜蛋白质结构测定。
不能净化的同质性，或从生理相关的上下文不会丢失功能中删除绝大多数的膜蛋白复合体的生物感兴趣。因此不能很容易地确定使用 x 射线晶体学或常规低温电镜技术这些蛋白复合物的三维结构。新新出现的低温电子断层扫描结合 3D 图像分类的方法和平均，然而，开始提供独一无二的机会，原位测定结构的膜蛋白完整细胞和非对称病毒中的程序集。在这里我们检讨最近取得的进展，在这场和评估这些方法的潜力来描述它们的本机环境中的膜蛋白的构象。
三联 SIV 和艾滋病毒 1 包膜糖蛋白对完整病毒的分子体系结构： 在第四纪的结构依赖于应变的变化。
目标单元格和感染的人，密切相关的猴免疫缺陷病毒的第一步 （艾滋病毒和 SIV，分别） 与 heterodimers 的病毒跨膜糖蛋白 (gp41） 和到目标 T 细胞表面的糖蛋白 (gp120) 组成的三联包膜糖蛋白 (Env) 绑定时发生。三联 Env 分子完整的病毒知识是结构的理解基本病毒细胞相互作用的分子机制和有效的基于免疫原的疫苗的设计，以防治艾滋病毒/艾滋病的重要。三联 Env 在 unliganded 结构中已经导致以前的完整艾滋病毒 1 BaL virions 的分析和 CD4 liganded ~ 20 ① 分辨率。在这里，我们表明的三联 Env SIVmneE11S，从体系结构的分子 SIVmac239 和艾滋病毒 1 R3A 株是密切相媲美，先前确定的艾滋病毒 1 BaL，V1 和 V2 变量循环位于图文场中，接近病毒与单元格之间的接触区域的顶点。在三联 Env V1/V2 循环的位置明确证实了艾滋病毒 1 R3A virions 删除这些循环与快递 Env 基因修饰的结构分析。引人注目的是，在 CD4 独立应变，SIV CP MAC 三联 Env 处于一"开放"的构象有 gp120 眼珠类似于见 Hiv-1 BaL 与 sCD4 和 CD4i 抗体 17b 络合时构象中的三聚体。我们的研究结果表明 CD4 独立病毒性条目的分子机制结构解释和进一步建立该低温电子断层扫描可以用于发现独特、 功能上相关的第四纪结构的 Env 显示完整的病毒。
三联艾滋病毒 1 糖蛋白 Gp140 抗原和本机艾滋病毒 1 包膜糖蛋白显示相同的关闭和打开第四纪分子体系结构。
Hiv-1 感染的第一步发生与细胞表面的 CD4 向三联艾滋病毒 1 包膜糖蛋白 (Env) 黑腹的跨膜糖蛋白 (gp41) 和表面的糖蛋白 (gp120) 绑定。可溶性版本的三联 Env 上完整病毒显示类似于观察到的结构和功能特性的设计是非常可取的设计可能是有效的防治艾滋病毒/艾滋病疫苗的抗原视角。使用 cryoelectron 层析成像结合子宗卷平均，我们已经分析了结构的 SOSIP gp140 三聚体，其中被分解、 增溶胞外区的三联 Hiv-1 的版本。我们显示 unliganded gp140 三聚体采用类似于由本机 unliganded 三聚体完好无损的艾滋病毒 1 virions 表面上显示的第四纪安排。当与可溶性 CD4，Fab 17b，将绑定到在其趋化因子 hiv 感染抑制绑定站点，或既是可溶性 CD4 gp120 和 17b Fab 络合时，gp140 三聚体显示打开构象，其中有一个向外旋转和位移的每个 gp120 protomer。我们证明在封闭式和开放式构象的可溶性三聚体三聚体相同，观察的封闭与开放的国家，分别上完好的艾滋病毒 1 BaL virions，三联 gp120 的建立可溶性 gp140 三聚体可以为了模仿的第四纪的结构转换的 gp120 的分子安排显示由本机三联 Env。
可溶性 CD4 绑定国家的使用低温电子断层扫描确定的三联猴免疫缺陷病毒包膜糖蛋白的三维结构。
显示在三联的信封糖蛋白 (Env) 峰值猴免疫缺陷病毒 (SIV) 和人类免疫缺陷病毒类型的曲面上 1 （艾滋病毒-1） virions 由组成三个 heterodimers 的病毒糖蛋白 gp120 和 gp41。虽然 gp120 绑定以细胞表面的 CD4 和趋化因子受体已知征求 gp120 和 gp41 的构象变化，只是最近才阐明第四纪的三聚体结构的变化。因为艾滋病毒 1 BaL 隔离，CD4 附件结果惊人重排反应从"封闭"到"开放"构象三聚体。然而，对 SIV，三聚体的 CD4 影响不被描述。使用低温电子断层扫描，我们现在已经确定的可溶性 CD4 分子体系结构 (sCD4)-绑定的 SIV Env 三聚体为三个不同品系 （SIVmneE11S，SIVmac239 和 SIV CP MAC） 的国家。与艾滋病毒 1 博联公司形成了鲜明的对比，SIVmneE11S 和 SIVmac239 Env 表明只有轻微的构象变化后 sCD4 绑定。在 SIV CP-MAC，三联 Env 一"开放"构象类似于见 Hiv-1 BaL sCD4 络合状态的显示位置，我们显示的 sCD4 或 7 3 绑定后构象有没有发生重大的进一步变化抗体。密度图还显示 7 3 和 17b 抗体针对抗原表位在 gp120 对立双方的 hiv 感染抑制绑定站点上。这些结果提供新的见解的 SIV Env 结构的多样性，并显示有绑定到三联 SIV Env sCD4 的方向依赖应变的变化。
使用低温电子断层扫描和 3D 分卷平均构象非均质性的计算分离。
我们以前都用与分卷平均和分类相结合的低温电子断层扫描以获得生物大分子中的程序集的情况下单一的优势物种在场，这些方法适用于各种三联艾滋病毒 1 和 SIV 包膜糖蛋白 (Env) 分析的 3D 结构。在这里，我们扩展自动化、 迭代，这些研究表明缺少楔更正的 3D 图像的对齐方式和分类方法来区分多个构象，都同时存在。我们目前代表不同构象国家的 Env 向量元素的空间分布测量的方法。我们确定数据处理策略允许明确分离以前为特征的关闭和打开构象，以及 unliganded 和 Env 它们时的抗体 liganded 国家目前的混合物。我们表明识别并删除峰值最低信号的信噪比提高总体准确性的个别 Env sub-volumes，之间的对齐方式，该对齐方式的准确性，反过来，确定图像分类评估构象异构混合物中的异质性的成功。我们成功地分离和重构独特的 3D 结构的 unliganded 和抗体 liganded，以及打开和关闭的构象的 Env 目前同时在混合物通过验证这些分离过程的计算。
