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- Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion
- Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen
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Articles by Alexander F. Palazzo in JoVE
JoVE General
Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion
Department of Biochemistry, University of Toronto
Hier beschreiben wir einen Test, dass die Macht der Mikroinjektion mit fluoreszierenden gekoppelt beschäftigt
JoVE General
Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen
Department of Biochemistry, University of Toronto
Hier beschreiben wir ein Verfahren zum endoplasmatischen Retikulum-assoziierte Säugetier-mRNAs in Gewebekulturzellen zu visualisieren. Diese Technik umfasst die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin zur cytoplasmatischen Inhalt durch fluoreszierende entfernen, gefolgt
Other articles by Alexander F. Palazzo on PubMed
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Die Signal-Sequenz, Die Kodierung Der Region Fördert Nukleare Export Von MRNA
In eukaryotischen Zellen sind die meisten mRNAs vom Kern mit dem Transkription-Export (TREX) komplexe, exportiert, die nach ihrer Spleißen und Begrenzung auf mRNAs geladen wird. Wir haben in den Säugetier-Zellen dem nuklearen Export von mRNAs Code für sekretorische Proteine, untersucht die an der Membran des endoplasmatischen Retikulum von hydrophoben Signal Sequenzen gezielt werden. Die mRNAs in den Zellkern injiziert oder von eingefügten oder transfizierte DNA synthetisiert wurden, und deren Export folgten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. Wir haben die überraschende Beobachtung, die die Kodierung der Region (SSCR) Signal-Sequenz als nukleare Export Signal von einer mRNA dienen kann, die ein Intron oder funktionelles Cap fehlt. Auch der Export von ein Intron-haltigen natürliche mRNA wurde durch seine SSCR gefördert. Wie konventionelle Export der SSCR-abhängigen Stoffwechselweg benötigt des Faktors Hahn, Erschöpfung der TREX-Komponenten hatte aber nur moderate Auswirkungen. Das SSCR-Export-Signal wird bei Wirbeltieren durch einen niedrigen Gehalt an Adenines, gekennzeichnet, wie von genomweiten Sequenzanalyse und durch die hemmende Wirkung des stillen Adenin Mutationen im SSCRs gezeigt. Die Entdeckung von einem SSCR-vermittelte Weg erklärt der zuvor notierten Aminosäure-Bias in Signal Sequenzen und schlägt eine Verbindung zwischen atomaren Export und Membran targeting mRNAs.
Mechanismen, Die Bestimmung Der Morphologie Der Peripheren ER
Dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) besteht aus der Kernhülle und einem peripheren Netzwerk der Tubuli und Membran Blätter. Tubuli sind geprägt durch die Krümmung zu stabilisieren Proteine Reticulons und DP1/Yop1p, aber es ist unklar, wie die Blätter gebildet werden. Hier erkennen wir mehrere Blatt angereicherten Membranproteine in der Säugetier-Notaufnahme, einschließlich Proteinen, die akkumulieren und eben synthetisierten Polypeptide zu ändern, sowie die aufgerollte Spule Membranproteine, die höchst herraufreguliert in Zellen mit gewucherten ER Blättern, sind die durch Membrane-springen Polysomes lokalisiert sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass Blätter und Tubuli grobe und glatte ER, bzw. entsprechen. Eines der aufgerollte Spule Proteine, Climp63, dient als ein "luminalen ER Spacer" und bildet Blätter beim Pleuramesotheliom. Universell, scheint jedoch Blattbildung der Reticulons und DP1/Yop1p, die auf Blatt Ränder zu lokalisieren und deren Fülle bestimmt das Verhältnis der zu Tubuli Blätter zu bringen. Diese Proteine können Blätter generieren, indem die hohe Krümmung der Kanten zu stabilisieren.
Genomanalyse Zeigt Zusammenspiel Von 5'UTR Introns Und Nukleare MRNA Export Für Sekretorische Und Mitochondriale Gene
In den höheren Eukaryotes werden Zytoplasma über Faktoren, die am 5'-Ende der Niederschrift während Spleißen hinterlegt Messenger-RNAs (mRNAs) vom Kern exportiert. Die Signal-Sequenz, die Kodierung der Region (SSCR) kann ein alternatives mRNA Export (ALREX) Weg unterstützen, die keine Spleißen erfordert. Allerdings haben die meisten SSCR-haltigen Gene auch Introns, also das Zusammenspiel zwischen diesen export Mechanismen bleibt unklar. Hier unterstützen wir ein Modell, in dem das am weitesten upstream-Element in einer bestimmten Abschrift, sei es, ein Intron oder eine Förderung von ALREX SSCR, Diktat der mRNA-Export-Pfad verwendet. Wir zeigen auch experimentell, dass nukleare-codierte mitochondriale Gene der ALREX-Stoffwechselweg verwenden können. ALREX kann somit auch von Nukleotid-Signale innerhalb mitochondrische Zielversionen Sequenz Codierung Regionen (MSCRs) unterstützt werden. Schließlich haben wir erkannt und experimentell überprüft Roman Motive, verbunden mit der ALREX-Weg, die von SSCRs und MSCRs geteilt werden. Unsere Ergebnisse zeigen starke Korrelation zwischen 5' Untranslatierter Bereich (5'UTR) Intron Anwesenheit/Abwesenheit und Sequenz Features zu Beginn die kodierende Region. Sie suggerieren, dass Gene Kodierung sekretorischen und mitochondriale Proteine einen gemeinsamen regulatorischen Mechanismus auf der Ebene der mRNA Export freigeben.
Nukleare Export Als Eine Wichtige Schiedsrichter "mRNA Identität" in Den Eukaryotes
In den letzten zehn Jahren verschiedene Untersuchungen haben ergeben, dass die meisten der eukaryotischen Genom ist zu einem gewissen Grad transkribiert. Die Allgegenwart der Transkription mag überraschen, wenn man bedenkt, dass nur ein Viertel des menschlichen Genoms Gene (einschließlich Exons und Introns) und weniger als 2 %-Codes für Protein umfasst. Dieses Rätsel wird teilweise durch die einzigartige evolutionäre Zwänge, die auferlegt werden erklärt, auf Arten mit kleinen Bevölkerung Größen, z. B. Eukaryoten. Diese Bedingungen fördern, die Ausweitung der Introns und nicht-funktionale intergenetischer DNA und die Anhäufung von kryptischen transkriptionelle Start-Seiten. Infolgedessen muss die eukaryotischen Gen-Ausdruck-Maschinen effektiv ausgewertet werden, ob eine Niederschrift alle Anzeichen einer Protein-kodierenden mRNA hat. Wenn eine Abschrift dieser Features enthält, werden positive Feedback-Schleifen aktiviert, um die Transkription, Verarbeitung, nukleare Export und letztlich die Übersetzung weiter zu stimulieren. Jedoch wenn ein Transkript Funktionen zugeordnet "mRNA Identität" fehlt, dann die RNA ist abgebaut bzw. verwendet, um die weitere Transkription und Übersetzung des Gens hemmen. Hier besprechen wir, wie mRNA Identität der nuklearen Export-Maschine beurteilt wird, um aussagekräftige Informationen aus eukaryotischen Genom zu extrahieren. Dabei bieten wir eine Erklärung, warum bestimmte Sequenzen, die in Protein-kodierenden Gene, z. B. die Signal-Sequenz, die Kodierung der Region, angereichert sind nukleare mRNA Export bei Wirbeltieren fördern. Dieser Artikel ist Teil einer Spezial-Ausgabe mit dem Titel: nukleare Transport und Verarbeitung von RNA.
Positionelle Anforderungen Zur Stimulation Von MRNA Nukleare Exportieren Durch Förderung Der ALREX Elemente
Die meisten Wirbeltiere mRNAs, die sezernierte, Membrane-springen oder mitochondriale Proteine codieren enthalten Elemente am 5'-Ende des ORF, die eine alternative mRNA-nukleare Export (ALREX)-Signalweg aktivieren. Hier zeigen wir, dass diese Elemente fördern effiziente Export und ordnungsgemäße zytoplasmatischen Lokalisierung nur dann, wenn sie am 5'-Ende der Niederschrift gefunden werden.
P180 Fördert Die Ribosom-unabhängige-Sprachunterstützung Für Eine Teilmenge Der MRNA Zu Dem Endoplasmatischen Retikulum
Im Metazoen werden die meisten mRNAs Codieren für sezernierte und membrangebundener Proteine auf der Oberfläche von dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) übersetzt. Obwohl die Angriffe auf diese Abschriften an die Oberfläche, von der ER durch die Übersetzung einer Signal-Sequenz vermittelt werden kann und deren Instandhaltung von Interaktionen zwischen dem Ribosom und die Translokon vermittelt ist, wird es immer deutlicher, dass zusätzliche ER-Lokalisierung-Wege vorhanden sind. Hier zeigen wir, dass viele diese mRNAs zu ausgerichtet werden können, und verbunden, das ER unabhängig von Ribosomen und Übersetzung bleiben. Verwenden einer Massenspektrometrie-Analyse von Proteinen, die ER gebundene Polysomes zuordnen, wurden vermeintliche mRNA-Rezeptoren, die diese alternative Verfahren-einschließlich p180, ein reichhaltiges, positiv aufgeladen membrangebundener Proteine vermitteln können. Wir zeigen, dass p180-Überexpression der Verband der generischen mRNAs mit dem ER verbessern kann. Dann zeigen wir, dass das p180 eine Lysin-reichen Region enthält, die direkt mit in-vitro RNA interagieren können. Schließlich zeigen wir, dass p180 für die effiziente ER-Verankerung lose poly(A) und bestimmte Abschriften, wie Plazenta alkalische Phosphatase und Calreticulin, auf die ER benötigt. Zusammenfassend bieten wir unseres Wissens die ersten mechanistischen Details für einen alternativen Weg zu Ziel und pflegen mRNA an das ER. Es ist wahrscheinlich, dass diese alternative Weg nicht nur die Treue verbessert des Proteins zu sortieren, aber auch mRNAs zu verschiedenen Subdomains von ER lokalisiert und somit zur zelluläre Organisation trägt.
