L'identità Di Semplice III

Visual Neuroscience. May-Jun, 2003  |  Pubmed ID: 14570247

Una veloce scansione microspectrophotometer dicroico è stato utilizzato per tracciare prodotti di fotolisi rodopsina (metarhodopsins I/II/III e successive) in anfibio strutturalmente intatto asta esterna segmenti (ROSs) e canne metabolicamente attivi. Lo strumento permette la registrazione di spettri di assorbanza con una risoluzione temporale migliore di 1 s e per discriminare tra prodotti con gli spettri di assorbimento simili che differiscono per quanto riguarda l'orientamento della loro cromoforo nella membrana del fotorecettore. Dimostriamo che essa che III è in un equilibrio di pH-reversibile con essa II e che il cromoforo III essa è orientato rispetto la membrana piano ancora più strettamente l'11-cis-retinale in rodopsina "scuro". Questo indica che tutto-trans retinale in essa che III è ancora attaccato al suo sito di legame nativo su opsin. Lo Schema cinetico di decadimento del metarhodopsins è presentato in cui essa III si trova in un percorso di shunt da essa II a retinica. Formazione di semplice che III è stato rilevato a candeggine basse quanto 3%, contrariamente alle precedenti relazioni che non è formata a inferiore a 10% sbiancanti. Un altro prodotto che è spettralmente simile al semplice III, chiamato P440, appare nelle fasi successive della fotolisi come risultato del decadimento di semplice II e III di essa. Il gruppo cromofori P440 è orientato preferenzialmente attraverso la membrana del disco. Il prodotto finale in ROS isolato, dove la riduzione di retinale a retinolo è bloccata, consiste di una miscela di un libero retinica e possibilmente collegati a siti di legame differenti nella membrana retinica. In verghe metabolicamente attivi i successivi prodotti sono rapidamente convertiti in retinolo. Possiamo concludere che essa III rappresenta uno stato conformazionale specifico di essa dove il sito di legame cromofori è ancora occupato da tutto-trans retinale. Quindi, la formazione e la decadenza di essa III può limitare per il tasso di rigenerazione della rodopsina e adattamento dark fotorecettore.

Il Dominio DEP Determina Targeting Sottocellulare Della Proteina D'attivazione RGS9 in Vivo Il GTPase

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Nov, 2003  |  Pubmed ID: 14614075

Domini di omologia DEP (per arruffato, EGL-10, settori) sono presenti in numerose proteine di segnalazione, tra cui molti nel sistema nervoso, ma la loro funzione rimane per lo più sfuggente. Segnaliamo che il dominio DEP di una proteina di segnalazione specifici del fotorecettore, RGS9 (per regolatore di G-proteina di segnalazione 9), gioca un ruolo essenziale nel RGS9 consegna al compartimento intracellulare del suo funzionamento, il segmento esterno rod. Abbiamo generato un topo transgenico in cui RGS9 fu sostituito dal suo mutante privo del dominio DEP. Poi abbiamo utilizzato una combinazione della tecnica quantitativa del serial tangenziale sezionamento-Western blotting con registrazioni elettrofisiologiche per dimostrare quello mutante RGS9 è espressa in canne nella quantità normale ma è completamente esclusa dai segmenti esterni. La consegna di RGS9 a segmenti di canna esterna rischia di essere mediato dall'interazione dominio DEP con una proteina transmembrana, R9AP (per RGS9 proteina d'ancoraggio), noto per ancorare RGS9 sulla superficie delle membrane dei fotorecettori e di potenziare l'attività catalitica RGS9. Mostriamo che entrambe queste funzioni sono anche abolite come risultato della cancellazione dominio DEP. Questi risultati indicano che una romanzo funzione del dominio DEP è di indirizzare una proteina di segnalazione di un comparto specifico di un neurone altamente polarizzato. È interessante notare che, analisi di sequenza di R9AP rivelano la presenza di un motivo di R-SNARE (per recettore solubile N-ethylmaleimide-sensitive attaccamento proteina del fattore) conservato e un'omologia previsto nel complesso strutturale con SNARE proteine coinvolte nel traffico vescicolare e fusion. Questo presenta la possibilità che i domini di protezione esecuzione programmi potrebbero servire a varie proteine contenenti DEP ai siti della loro azione intracellulare attraverso le interazioni con i membri della famiglia di proteine SNARE estesa di destinazione.

Purificazione Del Batteriofago Filamentosa Per La Visualizzazione Dei Fagi Mediante Cromatografia Di Esclusione Di Formato

BioTechniques. Feb, 2005  |  Pubmed ID: 15727124

Ciclo Visivo: Dipendenza Della Produzione Di Retinolo E Rimozione Sulla Morfologia Delle Cellule E Decadimento Photoproduct

The Journal of General Physiology. Aug, 2006  |  Pubmed ID: 16847097

Il ciclo di visual è una catena di reazioni biochimiche che rigenerare pigmento visivo dopo l'esposizione alla luce. Primi passi, la liberazione di tutto-trans retinale e sua riduzione a deidrogenasi di retinolo da retinolo tutto-trans (RDH), si svolgono in fotorecettori. Abbiamo effettuato misurazioni comparative microspectrophotometric e microfluorometric su una varietà di fotorecettori rod e cono isolato da retinae salamandra per correlare i tassi di decadimento e retinolo la produzione di photoproduct. Tasso di decadimento del Metapigment era spazialmente uniforme all'interno di segmenti esterni e 50 - 70 volte più veloce nelle cellule contenenti pigmenti cono-tipo (SWS2 e M/LWS) rispetto alle cellule con pigmento asta-tipo (RH1). Tasso di produzione di retinolo era fortemente dipendente, posizione più veloce alla base dei segmenti esterni. Tasso di produzione di retinolo era 10 - 40 volte più veloce in coni con pigmenti cono (SWS2 e M/LWS) più in OS basale di canne contenente pigmento rod (RH1). Tasso di produzione era approssimativamente cinque volte più veloce nelle barre contenenti pigmenti cono (SWS2) rispetto al tasso in OS basale delle barre che contengono il pigmento rod (RH1). Mostriamo che produzione di retinolo è definito da metapigment tasso di decadimento o tasso di reazione RDH, a seconda del tipo di cellula o regione del segmento esterno, considerando che la rimozione di retinolo è definito dal rapporto superficie / volume del segmento esterno e la disponibilità di retinoidi binding protein (IRBP). Le tariffe più rapide della produzione di retinolo in coni rispetto alle canne sono coerenti con l'operazione più rapida del ciclo visivo in queste cellule.

Anticorpo Anti-idiotypic Imita Funzione Proteolitica Dell'antigene Del Padre

Biochemistry. Dec, 2007  |  Pubmed ID: 18020454

Imaging funzionale di subtilisina Carlsberg attivo centro dalla rete idiotypic ceduto un anticorpo anti-idiotypic catalitico con attività endopeptidasi, amidase ed esterasi. Un anticorpo monoclonale inibitorio a subtilisina (Ab1 5-H4) fu impiegato come modello per la rete idiotypic di guida per produrre la catalitica anti-idiotypic Ab2 6B8-E12. Attività proteolitica di 6B8-E12 è stata dimostrata da zimogramma utilizzando coniugato BSA-fluoresceina self-quenched e in un dosaggio accoppiato rilevazione inattivazione Ab2-dipendente RNasi A. Scissione di substrati peptidici da 6B8-E12 rivelato modelli distinti di idrolisi con alta preferenza per residui aromatici prima o dopo il legame scissile. Attività catalitica di Ab2 è stato inibito da fluoruro di phenylmethylsulfonyl, un inibitore della serina idrolasi basata sul meccanismo. 5-H4 6B8-E12 sono stati clonati, prodotta in Escherichia coli come catena singola variabile frammenti (scFvs) e purificato. Parametri cinetici per attività amidolytic ed esterolytic erano simili Ab2 e suoi derivati scFv. Anche se la porzione di antigene-specifiche di 6B8-E12 non possiede alcuna somiglianza di struttura primaria con subtilisina, imita proteolitici e amidolytic le funzioni dell'antigene parentale, anche se con 4 ordini di grandezza più lento tasso di accelerazione. La mancanza di attività rilevabile endopeptidasi di scFv 6B8-E12 solleva interessanti questioni riguardanti l'evoluzione generale dell'attività catalitica. La in silico modelli 3D di Ab1 e Ab2 rivelato forte somiglianza strutturale di anticorpi noti anti-protease e abzymes, rispettivamente. Questi risultati indicano che la rete idiotypic è in grado, in misura significativa, di riproduzione catalitica della proteasi della serina e convalidare ulteriormente l'uso dell'imaging di centri attivi enzima dal sistema immunitario per l'induzione del abzymes accelerando idrolisi di legame dell'ammide intensivo di energia.

Riconoscimento Del Substrato Del Fattore Letale Di Antrace Esaminato Da Approcci Cinetici Combinatoriali E Pre-steady-state

The Journal of Biological Chemistry. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19359249

Fattore letale (LF), una proteasi zinco-dipendente di alta specificità, prodotto da Bacillus anthracis, è il componente effettrice della tossina binario che provoca la morte di antrace. Nuove terapie la tossina di targeting sono necessari per ridurre i decessi correlati all'antrace sistemiche. In particolare, sarà utile per lo sviluppo di inibitori LF nuove intuizioni nel meccanismo catalitico LF. Abbiamo valutato la lunghezza minima necessaria per la formazione di bona fide substrati LF con substrato phage display. La selezione basata su fagi ha reso un substrato che è fenduto sette volte più efficientemente da LF rispetto il peptide mirato nella chinasi di proteina MKK6. Mutagenesi luogo-diretta all'interno del sito di metal-binding nel centro attivo della LF e all'interno di substrati selezionati dei fagi ha rivelato un modello complesso di interazioni LF-substrato. Le operazioni elementari di proteolisi mediata da LF sono state risolte con la tecnica del flusso interrotto. Pre-steady-state cinetica della proteolisi LF seguito un meccanismo di quattro fasi come segue: substrato iniziale associazione, riarrangiamento del complesso enzima-substrato, una limitazione della velocità passo clivaggio e prodotto di rilascio. Esame delle interazioni LF con gli ioni del metallo ha rivelato un'inaspettata attivazione di proteasi di Ca(2+) e Mn(2+). Basato su dati cinetici e strutturali disponibili, proponiamo un modello di interazione LF-substrato. Risoluzione dei parametri cinetici e strutturali che disciplinano attività LF può essere sfruttata per la progettazione di nuovi inibitori di LF.

Il Gruppo 9-metil Retinica è Essenziale Per Rapido Decadimento Meta II E Phototransduction Tempra in Coni Rossi

The Journal of General Physiology. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19635855

Fotorecettori cono della retina Vertebrata terminano la loro risposta alla luce molto più veloce di fotorecettori rod. Tuttavia, i meccanismi molecolari sottostanti questa terminazione di risposta rapida in coni sono capiti male. Gli esperimenti presentati qui testato due ipotesi correlate: primo, che il rapido decadimento tasso di essa (Meta) II in coni sensibili al rosso dipende da interazioni tra il gruppo 9-metil della retina e la parte di opsin della molecola del pigmento, e in secondo luogo, quello rapido decadimento Meta II è fondamentale per il rapido recupero dalla saturazione dei coni sensibili al rosso dopo l'esposizione alla luce intensa. Microspectrophotometric misure di fotolisi di pigmento, microfluorometric le misurazioni di produzione di retinolo e cella singola registrazioni elettrofisiologiche delle risposte flash di coni Salamandra sono state effettuate per verificare queste ipotesi. In tutti i casi, sono stati sbiancati coni e loro pigmento visivo è stato rigenerato con entrambi 11-cis retinale o con 9 11-cis-demethyl retinica, un analogo della retina manca il gruppo 9-metil. Decadimento meta II era quattro o cinque volte più lento e produzione di retinolo successivi tre o quattro volte più lento in coni sensibili al rosso privo del gruppo 9-metil retinica. Questo è stato accompagnato da un significativo rallentamento del recupero dalla saturazione in coni manca il gruppo metile 9 dopo l'esposizione al luminoso (> 0.1% pigmento visivo photoactivated), ma non dim light. Un modello matematico del processo bivio di phototransduction ha rivelato che il recupero più lento di fotorisposta può essere spiegato dal più lento decadimento Meta di 9-demethyl pigmento visivo. Questi risultati dimostrano che il gruppo 9-metil della retina è richiesto per le interazioni sterico cromoforo-opsin che favoriscono il rapido deperimento del Meta II sia il recupero di una risposta rapida dopo l'esposizione alla luce brillante in coni sensibili al rosso.

Età-correlate Deterioramento Della Visione Di Verga Nei Topi

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Aug, 2010  |  Pubmed ID: 20720130

Anche in individui sani, invecchiamento porta al deterioramento dell'acuità visiva, sensibilità al contrasto, campo visivo e l'adattamento di buio. Poco è conosciuto circa i meccanismi neurali che guidano i cambiamenti legati all'età della retina e, più specificamente, fotorecettori. Secondo un'ipotesi, il deterioramento relativo all'età in funzione di rod è a causa della disponibilità limitata di 11-cis-retinale per formazione di pigmento rod. Per determinare come invecchiamento colpisce fotorecettori rod e per testare l'ipotesi di deficit di retinoidi, abbiamo confrontato le proprietà morfologiche e funzionali delle canne di adulto e invecchiato topi B6D2F1/J. Abbiamo trovato che il numero di canne e la lunghezza dei loro segmenti esterni sono sensibilmente ridotti nei topi 2.5-anno-vecchio rispetto ad animali di 4 mesi. Invecchiamento provocato anche una duplice riduzione del livello complessivo di opsin nella retina. Test comportamentali ha rivelato che scotopica acuità visiva e la sensibilità al contrasto sono diminuiti da duplice nei topi anziani, e registrazioni di ERG rod dimostrato ridotta ampiezza di entrambi a - e b-onde. Sensibilità di canne all'età determinata dalla cella singola registrazioni era anche diminuito di 1.5-fold, corrispondente a non più di 1% gratis opsin in questi fotorecettori, e non sono stati modificati parametri cinetici della risposta flash dim. In particolare, il tasso di adattamento dark rod era influenzato dall'età. Così, i nostri risultati sostengono contro deficit legati all'età di 11-cis-retinale nel ciclo visivo rod di mouse B6D2F1/J. Sorprendentemente, il livello di rumore scuro cellulare è stato aumentato in verghe invecchiati, fornendo un meccanismo alternativo per loro desensibilizzazione.

Ancoraggio Subunità Membrana Specifica Regolazione Selettiva Della RGS9·Gbeta5 GAP Complessi Nei Neuroni Del Fotorecettore

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Oct, 2010  |  Pubmed ID: 20943919

Il RGS9·Complesso Gβ5 è il regolatore chiave della G-proteina di segnalazione neuronale e dimostra notevole selettività della composizione di subunità. In fotorecettori retinici, RGS9·Gβ5 è associato per l'ancoraggio della membrana R9AP e il complesso regola la segnalazione visiva. Nei neuroni dei gangli basali, RGS9·Gβ5 invece è associato a una proteina omologa, R7BP e regola il circuito della ricompensa. Questa composizione selettiva subunità del complesso di commutazione in fotorecettori rod ci ha permesso di studiare la base molecolare della segnalazione specificità in diversi percorsi di G-proteina. Abbiamo trovato che entrambe le subunità ancoraggio membrana svolgono un ruolo conservato nel regolare i livelli della proteina di RGS9·Gβ5 e rafforzare la capacità di RGS·Gβ5 complessi per stimolare attività GTPasi proteine G. Tuttavia, notevoli differenze esistono nel targeting sottocellulare di complessi in alternativa configurati. A differenza di R9AP, che si basa su meccanismi passivi targeting per la consegna ai segmenti esterni dei fotorecettori, R7BP è escluso da questa posizione e invece è specificamente mirate alla membrana del plasma. R7BP contenenti complessi potrebbero essere ridiretto ai segmenti esterni, dove sono in grado di regolare la cascata phototransduction dai segnali targeting attivi derivati dalla rodopsina. Questi risultati illustrano la diversità del regolamento G-proteina di segnalazione di RGS·Gβ5 complessi raggiunti dal reclutamento differenziale della membrana ancore.

Il Ciclo Visivo Dei Mammiferi Cono Promuove La Rapida Rigenerazione Del Pigmento M/L-cono Indipendentemente Il Retinoide-binding Protein Interphotoreceptor

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. May, 2011  |  Pubmed ID: 21613504

Rapida rigenerazione del pigmento visivo seguendo il photoactivation è critico per la funzione dei fotorecettori cono tutto il giorno. Anche se le reazioni del ciclo visivo nell'epitelio pigmentato retinico (RPE) che riciclano cromoforo per la rigenerazione del pigmento rod sono ben caratterizzate, i corrispondenti meccanismi che consentono la rapida rigenerazione del pigmento cono sono mal capiti. Una domanda chiave rimanente è il contributo relativo della retina recentemente scoperto cono specifico ciclo visivo e il classico RPE-dipendente visual ciclo di rigenerazione del pigmento mammifero cono. Inoltre, non è chiaro quale ruolo, se del caso, l'abbondante interphotoreceptor retinoid-binding protein (IRBP) si presume per facilitare il traffico del cromoforo, gioca nell'accelerare la rigenerazione del pigmento cono dei mammiferi. Per risolvere questi problemi, abbiamo usato transretinal registrazioni per valutare la rigenerazione pigmento M/L-cono in retine isolate e paraocchi da controllo e mouse IRBP-carenti. Notevolmente, la retina di topo promosso M/L-cono oscuro adattamento otto volte più velocemente che l'EPR. Tuttavia, cono completo recupero necessari entrambi i cicli di visual. Possiamo concludere che il ciclo visivo retina è critico per la rapida rigenerazione iniziale del mouse pigmento M/L-cono durante l'adattamento dark, considerando che il ciclo più lento di visual RPE è necessario per completare il processo. Mentre l'eliminazione dei IRBP ridotta ampiezza e rallentato la cinetica del mouse M/L-cono photoresponses, adattamento del cono di luce costante e la cinetica del cono oscuro adattamento non sono stati influenzati nella retina isolato o nell'oculare intatto. Così, IRBP non accelerare la rigenerazione del pigmento cono e non è critico per la funzione del mouse M/L-coni in piena luce.

G-proteina Betagamma-complesso è Cruciale Per L'amplificazione Del Segnale Efficiente in Visione

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Jun, 2011  |  Pubmed ID: 21632928

Una questione fondamentale della cellula biologia è come deboli segnali esterni di segnalazione produrre risposte fisiologiche robuste. Un meccanismo universale si basa sull'amplificazione del segnale via cascate intracellulari mediata da eterotrimerica G-proteine. Questo sistema di amplificazione ad alta permette di fotorecettori della retina asta rilevare i singoli fotoni di luce. Anche se ora molto è conosciuto circa il ruolo della α-subunità dell'asta specifica G-proteina transducina in phototransduction, la funzione fisiologica del βγ-complesso ausiliario in questo processo rimane un mistero. Qui, ci mostra che eliminare la subunità γ transducin riduce drasticamente l'amplificazione del segnale nelle barre del mouse intatto. La conseguenza è un calo impressionante sensibilità visiva rod e grave deterioramento della visione notturna. I nostri risultati dimostrano che transducina complesso βγ controlli di amplificazione del segnale della cascata phototransduction rod ed è fondamentale per la capacità dei fotorecettori asta di funzionare in condizioni di scarsa illuminazione.

Segnalazione Degli Stati Di Rodopsina in Asta Disco Membrane Manca Transducin Complesso βγ

Investigative Ophthalmology & Visual Science. Jan, 2012  |  Pubmed ID: 22266510

Scopo. A caratterizzare il possibile ruolo della transducina Gtβγ-complesso nel modulare le proprietà di segnalazione della rodopsina photoactivated e la sua durata in asta disco membrane e canne intatti. Metodi. Fotolisi di rodopsina è stata studiata tramite spettroscopia UV-visibile e spettroscopia scansione rapida in presenza di idrossilammina in membrane di disco asta altamente purificati del mouse wild-type e Gtγ-carenti. Formazione di complessi tra photoactivated rodopsina e transducina è stata misurata mediante saggio II extra-semplice (meta). Recupero della sensibilità attuale e flash scura in canne singole intatto wild-type e Gtγ-carenti del mouse è stata misurata dalla cella singola aspirazione recordings. Risultati. Photoconversion della rodopsina a meta mi / equilibrio II meta procede normalmente dopo l'eliminazione del Gtβγ-complesso. La meta mi / meta II rapporto, il tasso di decadimento di meta II, la reattività del meta II verso idrossilammina e il tasso di formazione III meta nelle membrane di Gtγ-deficient asta disco erano identici a quelli osservati in campioni di wild-type. Sotto illuminazione di bassa intensità, la quantità di extra-meta II in dischi di Gtγ-deficient era significativamente ridotta. Il tasso iniziale di recupero corrente scura dopo candeggina 12% rodopsina era tre volte più veloce nelle barre di Gtγ-deficient, considerando che il tasso di recupero corrente tardo era in gran parte invariato. Mutante canne esposte anche più veloce postbleach recupero di sensibilità flash. Conclusioni. Photoactivation e decomposizione termica della rodopsina procedere analogamente nel wild-type e canne del mouse Gtγ-carenti, ma la formazione di complessa tra photoactivated rodopsina e transducina è gravemente compromessa in assenza di Gtβγ. L'attivazione di trasduzione risultante inferiore contribuisce a fotorisposta recupero più veloce dopo un moderato pigmento candeggina nelle barre di Gtγ-deficient.