Una Risorsa Di Reagente Per Identificare Le Proteine E Peptidi Di Interesse Per La Comunità Di Cancro: Una Relazione Di Laboratorio

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Oct, 2006  |  Pubmed ID: 16867976

Sulla base delle discussioni con i rappresentanti di tutti i settori della Comunità di ricerca del cancro, il National Cancer Institute (NCI) riconosce l'immensa opportunità applicare tecnologie proteomica per ulteriore ricerca sul cancro. Reagenti di cattura affinità convalidato e ben caratterizzati (ad esempio, aptameri, affibodies e anticorpi) giocherà un ruolo chiave in proteomics piattaforme di ricerca per la prevenzione, diagnosi precoce, trattamento e il monitoraggio del cancro. Per discutere i modi per sviluppare nuove risorse e ottimizzare le attuali opportunità in questo settore, il NCI ha convocato "Proteomic tecnologie reagenti Resource Workshop" in Chicago, IL 12-13 dicembre 2005. Il workshop ha riunito scienziati leader nella ricerca proteomica per discutere di modelli di sistemi di valutazione e fornire risorse per reagenti sostenere piattaforme di acquisizione MS e affinità. Altoparlanti discusso questioni e azione individuati elementi relativi a una visione globale per e modelli proposti per la risorsa condivisa proteomics reagenti, applicazioni di affinità acquisire metodi nella ricerca sul cancro, controllo qualità e convalida di affinità cattura reagenti, considerazioni per la scelta di destinazione e la costruzione di un database di reagenti. L'incontro comprendeva anche presentazioni e discussione da investigatori privati leader dello stato-of-the-art tecnologie e le capacità per soddisfare le esigenze della Comunità degli utenti. Questo workshop è stato sviluppato come componente del proteomica clinica tecnologie iniziativa del NSC per il cancro, un'iniziativa coordinata che include la creazione di risorse di reagente per la comunità scientifica. Questa relazione di laboratorio Esplora vari approcci per sviluppare un quadro che sarà più efficacemente soddisfare le esigenze del NSC e la comunità di ricerca del cancro.

Normalizzazione Per Quanto Riguarda I Valori Mancanti Non Casuali Nei Dati Di Spettrometria Di Massa Ad Alta Velocità

Pacific Symposium on Biocomputing. Pacific Symposium on Biocomputing. 2006  |  Pubmed ID: 17094249

Proponiamo una procedura di normalizzazione in due fasi per dati high-throughput di spettrometria di massa (MS), che è un passo necessario in biomarker clustering o classificazione. In primo luogo, una fase di normalizzazione globale viene utilizzata per rimuovere fonti di variazione sistematica tra profili MS dovuto, ad esempio, variando la quantità di degradazione del campione nel corso del tempo. Un modello di probabilità viene quindi utilizzato per indagare gli eventi mancanti di intensità-dipendente e fornisce sostituzioni possibili per i valori mancanti. Illustriamo le prestazioni del metodo con un set di dati di LC-MS di miscele sintetiche della proteina.

Arricchimento Basato Su Anticorpo Di Peptidi Su Perle Magnetiche Per Quantificazione Basati Su Spettrometria Di Massa Di Biomarcatori Sierici

Analytical Biochemistry. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17241609

Un collo di bottiglia più importante per la validazione di nuovi strumenti diagnostici clinici è lo sviluppo di saggi altamente sensibile e specifici per quantificare le proteine. Abbiamo precedentemente descritto un metodo standard di isotopo stabile con la cattura di anticorpi antipeptide, in cui un specifico peptide triptico è selezionato come rappresentante stechiometrico della proteina da cui viene scisso, è arricchito da campioni biologici usando gli anticorpi immobilizzati ed è quantificato mediante spettrometria di massa contro uno standard interno a spillo per produrre una misura della concentrazione di proteine. In questo studio, abbiamo ottimizzato una piattaforma basata su tallone magnetici suscettibile di acquisizione ad alta velocità del peptide e dimostrato che cattura anticorpo seguita dalla spettrometria di massa può raggiungere miglioramenti segnale dello ione dell'ordine di 10, paragrafo 3, con precisione (CVs < 10%) e precisione (errore relativo approssimativamente 20%) sufficienti per quantificare i biomarcatori nella gamma fisiologicamente rilevanti ng/mL. Questi metodi sono generalmente applicabili a qualsiasi fluido della proteina o biologiche di interesse e tengono grandi potenzialità per fornire una tecnologia ponte disperatamente necessaria tra biomarker discovery e applicazione clinica.

Confronto Testa a Testa Tra Tecniche Di Frazionamento Del Siero

Journal of Proteome Research. Feb, 2007  |  Pubmed ID: 17269739

Molteplici approcci per semplificare il proteoma di siero sono stati descritti. Queste tecniche sono generalmente sviluppate attraverso laboratori diversi, campioni, piattaforme di spettrometria di massa e strumenti di analisi. Quindi, confrontando gli schemi disponibili è impossibile dalla letteratura esistente a causa di variabili confondenti. Ci descrivono un confronto testa a testa tra diversi schemi di frazionamento del siero, compresi N-linked glicopeptide arricchimento, arricchimento cisteinici-peptide, separazione magnetica tallone (C3, C8 e WCX), dimensioni deplezione colonna immunoaffinity frazionamento e proteina A/G deplezione di proteine del siero abbondante. Ogni tecnica è stato confrontato con i risultati ottenuti dal siero umano non frazionata. I risultati mostrano immunoaffinity sottrazione è il mezzo più efficace per semplificare il proteoma siero mantenendo la velocità effettiva del campione ragionevole. Il dataset riferito è pubblicamente disponibile e fornisce uno standard contro cui emergent technologies possono essere confrontati e valutati per il loro contributo alla scoperta del biomarker basato su siero.

Pipeline Integrata Per La Spettrometria Di Massa Base Scoperta E Conferma Di Biomarcatori Ha Dimostrato in Un Modello Murino Di Cancro Al Seno

Journal of Proteome Research. Oct, 2007  |  Pubmed ID: 17711321

Nonostante la loro potenziale impatto di diagnosi e trattamento del cancro, alcuni marcatori biologici della proteina sono in uso clinico. Scoperta del biomarker è afflitto con difficoltà che vanno dal tecnologica (incapacità di interrogare globalmente ai proteomi) al biologico (differenze genetiche ed ambientali tra i pazienti e i loro tumori). Abbiamo bisogno urgentemente di paradigmi per la scoperta del biomarker. Per ridurre al minimo la variazione biologica e facilitare la sperimentazione di approcci di proteomica, abbiamo impiegato un modello murino di cancro al seno. In particolare, abbiamo eseguito LC-MS/MS di tumore e tessuto mammario normale da un condizionale HER2/Neu-driven modello murino di cancro al seno, identificando 6758 peptidi che rappresenta &gt; 700 proteine. Abbiamo sviluppato un nuovo approccio statistico (SASPECT) per priorità proteine differenzialmente rappresentate in LC-MS/MS DataSet e identificate le proteine sopra - o sotto-rappresentate in tumori. Utilizzando una combinazione di approcci basati su anticorpi e spettrometria di massa di monitoraggio più reazione (MRM-MS), abbiamo confermato la sovrapproduzione di proteine multiple a livello dei tessuti, identificati contengono il fibulin proteina-2 come un biomarker di plasma e ampiamente caratterizzata osteopontina come un biomarker di plasma capace di diagnosi precoce di malattia nel topo. I nostri risultati mostrano che una pipeline in scena che impiegano fucile base comparativa proteomica per la scoperta di biomarcatori e più reazione di monitoraggio per la conferma dei candidati biomarcatore è in grado di trovare nuovi biomarcatori plasma e tessuto in un modello murino di cancro al seno. Inoltre, l'approccio può essere esteso per trovare biomarcatori rilevanti per la malattia umana.

L'interfaccia Tra Biomarker Discovery E Validazione Clinica: Il Pozzo Di Catrame Della Pipeline Biomarcatore Della Proteina

Proteomics. Clinical Applications. Oct, 2008  |  Pubmed ID: 20976028

L'applicazione di tecnologie "omiche" per campioni biologici genera centinaia di migliaia di biomarker candidati; Tuttavia, un numero spaventosamente piccolo rendono attraverso la pipeline per uso clinico. Questo è in gran parte a causa dell'incredibile mancata corrispondenza tra il gran numero di candidati di biomarker e la scarsità di analisi affidabile e metodi per studi di convalida. Abbiamo disperatamente bisogno di una pipeline che allevia questo collo di bottiglia tra biomarker discovery e convalida. Questa carta cliente i requisiti per le tecnologie di credenziali adeguatamente i candidati biomarker per la validazione clinica costose e propone metodi e sistemi per verificare i candidati biomarcatore. Modelli che coinvolgono pool di campioni clinici, ove opportuno, sono discussi. Concludiamo che le attuali tecnologie proteomiche sono sulla cuspide di pregiudicare significativamente traduzione di diagnostica molecolare in clinica.

Un Progetto Di Rilevazione E Quantificazione Proteoma Umano

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. May, 2009  |  Pubmed ID: 19131327

La mancanza di saggi canalizzabile, sensibile e specifici per le proteine più umane è il grave ostacolo tecnico impedendo lo sviluppo di biomarcatori candidato in test clinicamente utili. Recenti progressi in dosaggi base di spettrometria di massa per i peptidi proteotypic, particolarmente quelli con arricchimento del peptide affinità specifica, offrono un percorso sistematico ed economico a copertura completa quantitativa del proteoma umano. Una suite completa di saggi, per esempio due peptidi dal prodotto della proteina di ognuno dei geni umani circa 20.500 (qui chiamati il progetto human Proteome individuazione e quantificazione), vuoi abilitare la verifica rapida e sistematica dei biomarcatori candidato e posare una base quantitativa per successivi sforzi definire l'universo più grande di varianti di splicing, traslazionali, interazioni della proteina-proteina e localizzazione di tessuto.

Una Firma Di Espressione Del Gene Derivato Da Radiazioni Predice L'esito Clinico Per Pazienti Affetti Da Cancro Al Seno

Radiation Research. Feb, 2009  |  Pubmed ID: 19267539

Attivazione del percorso di risposta di danni del DNA è un segno distintivo per la tumorigenesi precoce, mentre la perdita di attività del percorso è associato con la progressione della malattia. Così abbiamo ipotizzato che una firma di espressione del gene associata alla risposta di danno del DNA può servire come una firma prognostica per esito in pazienti affetti da cancro. Abbiamo individuato le trascrizioni radiazioni ionizzanti-reattive in lymphoblast umano cellule derivano da 12 esemplari e usato questa firma a schermo un pannello di insiemi di dati di cancro per la capacità di predire la sopravvivenza a lungo termine dei pazienti affetti da cancro. Dimostriamo set gene indotta o repressa da radiazioni ionizzanti in grado di prevedere esito clinico in due insiemi di dati del cancro di seno indipendente, che si confronta la firma di radiazione di predittori di esito basato sull'espressione gene precedentemente descritte. Mentre geni repressi in risposta alle radiazioni probabilmente rappresentano la firma di ben caratterizzati proliferazione predittiva dell'esito di cancro al seno, indotti dalle radiazioni probabile che i geni codificano per informazioni aggiuntive che rappresentano altri deregolamentato proprietà biologiche dei tumori come risposte checkpoint o apoptotic.

Il Ruolo Evolutivo Della Spettrometria Di Massa Nella Scoperta Di Biomarcatori Del Cancro

Cancer Biology & Therapy. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19502776

Anche se il campo della proteomica di base di spettrometria di massa è ancora nella sua infanzia, recenti sviluppi nelle tecniche di proteomica mirati hanno lasciato il campo in bilico per l'impatto della pipeline di biomarker clinico della proteina ora più che in qualsiasi altro momento della storia. per proteomica incontrare il suo potenziale per la ricerca di biomarcatori, medici, statistici, epidemiologi e chimici devono lavorare insieme in un approccio interdisciplinare. Questi sforzi interdisciplinari avrà le maggiori possibilità di successo se i partecipanti da ogni disciplina hanno una conoscenza base di altre discipline. A tal fine, lo scopo di questa revisione è quello di fornire una panoramica non tecniche dei ruoli emergenti in continua evoluzione che la massa spettrometria (soprattutto mirata modalità di spettrometria di massa) può giocare nella pipeline di biomarker, nella speranza di rendere la tecnologia più accessibile alla comunità più ampia per gli sforzi di biomarker discovery. Inoltre, le tecnologie discussione sono ampiamente applicabili agli studi di proteomica e non sono limitate alla scoperta del biomarker.

Valutazione Multi-sito Della Precisione E La Riproducibilità Delle Misurazioni Multiple Con Reazione Basata Sul Monitoraggio Delle Proteine Nel Plasma

Nature Biotechnology. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19561596

Verifica dei biomarcatori candidato si basa su saggi specifici, quantitative ottimizzati per rilevazione selettiva delle proteine bersaglio e sempre più è visto come un passaggio critico nella scoperta della pipeline che scoperta biomarker imparziale ponti di validazione preclinica. Sebbene singoli laboratori hanno dimostrato che più reazione monitoraggio (MRM) accoppiato con spettrometria di massa di diluizione isotopica può quantificare proteina candidato biomarcatori nel plasma, riproducibilità e trasferibilità di tali dosaggi tra i laboratori non sono state dimostrate. Descriviamo un multilaboratory studio per valutare la riproducibilità, recupero, gamma dinamica lineare ed i limiti di rilevazione e quantificazione dei multiplex, MRM-based assays, condotto da NCI-CPTAC. Utilizzando materiali comuni e protocolli standardizzati, dimostreremo che questi dosaggi possono essere altamente riproducibile entro ed attraverso laboratori e piattaforme di strumento e sono sensibili a concentrazioni di proteina bassa mug/ml nel plasma non frazionato. Forniamo dati e parametri di riferimento contro cui laboratori individuali possono confrontare le loro prestazioni e valutare nuove tecnologie per la verifica di biomarker nel plasma.

Schermo Basato Su Anticorpo Per Cambiamenti Di Radiazioni Ionizzanti-dipendenti Nel Proteoma Dei Mammiferi Per L'uso in Biodosimetry

Radiation Research. May, 2009  |  Pubmed ID: 19580490

Nel tentativo di identificare proteomic modifiche che possono essere utili per radiazioni biodosimetry, cellule umane di origine ematologica sono state trattate con radiazioni ionizzanti o mock-irradiate e poi raccolte in tempi diversi dopo il trattamento. Proteina lisati sono stati generati da queste cellule e valutati da Western blotting utilizzando un pannello di anticorpi commercialmente disponibili 301 targeting 161 proteine uniche. Da questa schermata, abbiamo individuato 55 radiazioni ionizzanti-reattive proteine, tra cui 14 proteine precedentemente non segnalate per essere radiazioni-reattiva a livello della proteina. I dati da questa schermata su larga scala sono stati assemblati in un sito Web pubblico (http://labs.fhcrc.org/paulovich/biodose_index.html) che possono essere di valore per la comunità di radiazione sia come fonte di biomarcatori putativi per biodosimetry e anche come fonte di dati di convalida su anticorpi disponibili in commercio che rilevano le radiazioni-reattive proteine. Utilizzando un pannello di biomarcatori radiazione candidato in linee cellulari umane, noi dimostrare la fattibilità di montaggio di un pannello complementare delle proteine radiazione-sensibli a reagire. Inoltre, noi dimostrare la fattibilità dell'utilizzo di sangue cell-based proteomic modifiche per biodosimetry dimostrando il rilevamento delle modifiche di proteine in cellule circolanti dopo irradiazione total-body in un modello canino.

Misurazioni Delle Prestazioni Per Sistemi Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry in Proteomics Analisi

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19837981

Delle principali necessità insoddisfatte nelle analisi proteomica LC-MS/MS-based è un set di strumenti per la valutazione quantitativa delle prestazioni del sistema e valutazione della variabilità tecnica. Qui descriviamo 46 misurazioni delle prestazioni di sistema per il monitoraggio prestazioni cromatografica, stabilità sorgente electrospray, segnali MS1 e MS2, dinamici di campionamento degli ioni per MS/MS e identificazione del peptide. Applicato ai set di dati da replicare analisi LC-MS/MS, queste metriche visualizzato risposte coerenti, ragionevoli a perturbazioni controllate. Le metriche in genere visualizzato variazioni meno del 10% e così possono rivelare anche sottili differenze nelle prestazioni dei componenti del sistema. Analisi dei dati provenienti da studi interlaboratori condotta sotto un comune standard operating procedure identificate outlier dati e fornito indizi di cause specifiche. Inoltre, variazione interlaboratorio riflettuto la metrica di indica quali componenti di sistema variano la maggior parte tra i laboratori. Applicazione di queste metriche consente la valutazione della qualità razionale, quantitativa per la proteomica ed altre applicazioni analitiche di LC-MS/MS.

Un Metodo Automatizzato E Multiplex Per High Throughput Del Peptide Immunoaffinity Arricchimento E Reazione Più Monitoraggio Basato Su Spettrometria Di Massa Di Quantificazione Dei Biomarcatori Della Proteina

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 19843560

C'è un urgente bisogno di analisi quantitative nella verifica e convalida il gran numero di candidati biomarcatore proteina prodotta nel moderno "-omiche" esperimenti. Isotopo stabile standard con cattura di anticorpi anti-peptide (SISCAPA) ha mostrato enorme potenziale per soddisfare questo bisogno combinando arricchimento immunoaffinity peptide con spettrometria di massa quantitativa. In questo studio, descriviamo tre significativi progressi della tecnica di SISCAPA. In primo luogo, possiamo sviluppare un metodo per un magnetico basato su tallone piattaforma automatizzata capace di elaborazione elevato throughput. In secondo luogo, si implementa il metodo automatizzato in un dosaggio SISCAPA multiplex (nove obiettivi in un dosaggio) e valutare le caratteristiche di prestazioni del dosaggio multiplex. Utilizzando la piattaforma automatizzata, multiplex, mostriamo i limiti di rilevamento nella gamma fisiologicamente rilevanti ng/ml (da 10 microl di plasma) con sufficiente precisione (mediano coefficiente di variazione, 12,6%) per quantificare i biomarcatori. In terzo luogo, dimostriamo che arricchimento dei peptidi da grandi volumi di plasma (1 ml) può estendere i limiti di rilevazione per la gamma bassa pg/ml di concentrazione nella proteina. Il metodo è generalmente applicabile a qualsiasi proteina o i campioni biologici di interesse e molto promettente per l'analisi di un gran numero di candidati di biomarker.

Studio Interlaboratorio Che Caratterizza Uno Standard Di Prestazioni Lievito Per L'analisi Comparativa Delle Prestazioni Di Piattaforma Di LC-MS

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19858499

Prestazioni ottimali delle piattaforme di LC-MS/MS sono fondamentale per la generazione di dati di alta qualità proteomics. Sebbene singoli laboratori hanno sviluppato i campioni per il controllo di qualità, non non c'è alcuna norma prestazioni ampiamente disponibile della complessità biologica (e insiemi di dati di riferimento associata) per l'analisi comparativa delle prestazioni della piattaforma per l'analisi di complessi biologici ai proteomi attraverso diversi laboratori nella comunità. Preparazioni individuali del proteoma lievito Saccharomyces cerevisiae sono stati ampiamente utilizzati dai laboratori della Comunità di proteomica per caratterizzare le prestazioni della piattaforma LC-MS. Il proteoma di lievito è univocamente attraente come uno standard di prestazioni perché è il più estesamente caratterizzato proteome biologiche complesse e l'unico associato con vari studi su larga scala, stimare l'abbondanza di tutte le proteine rilevabili. In questo studio, ci descrivono un protocollo operativo standard per la produzione su larga scala delle prestazioni lievito standard e aliquote di offrire alla comunità attraverso il National Institute of Standards e tecnologia dove il proteoma di lievito è in fase di sviluppo come materiale di riferimento certificati per soddisfare le esigenze di lungo termine della Comunità. Utilizzando una serie di parametri che caratterizzano le prestazioni di LC-MS, forniamo un set di dati di riferimento dimostrando le prestazioni tipiche del comunemente usato piattaforme strumento trappola ionica in laboratori specializzati; i risultati forniscono una base per i laboratori di benchmark le proprie prestazioni, a migliorare i metodi attuali e a valutare le nuove tecnologie. Inoltre, dimostriamo come riferimento il lievito, a spillo con proteine umane, può essere utilizzato per comparare la potenza delle piattaforme di proteomica per il rilevamento delle proteine differenzialmente espresse a diversi livelli di concentrazione in una matrice complessa, fornendo in tal modo una metrica per valutare e ridurre al minimo la variazione pre-analitiche e analitiche in esperimenti di proteomica comparativa.

Ripetibilità E Riproducibilità in Proteomic Identificazioni Di Spettrometria Di Massa Tandem Di Cromatografia Liquida

Journal of Proteome Research. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19921851

La complessità della strumentazione proteomic per LC-MS/MS introduce molte possibili fonti di variabilità. Dati dipendenti dal campionamento dei peptidi costituisce un elemento stocastico nel cuore della scoperta proteomics. Anche se questa variazione influisce l'identificazione di peptidi, proteomic identificazioni sono tutt'altro che casuale completamente. In questo studio, abbiamo analizzato interlaboratori insiemi di dati NCI clinico Proteomic Technology Assessment per cancro a esaminare la ripetibilità e la riproducibilità in identificazioni di peptidi e proteine. Dati inclusi con spanning 144 LC-MS/MS esperimenti su quattro Thermo LTQ e quattro strumenti Orbitrap. Campioni inclusi lisato di lievito, NCI-20 definito miscela di proteine gamma dinamica e il Sigma UPS 1 definito miscela equimolare di proteine. Alcuni dei nostri risultati rinforzato saggezza convenzionale, come la ripetibilità e la riproducibilità è più elevato per le proteine che per i peptidi. La maggior parte delle lezioni dai dati, tuttavia, erano più sottili. Orbitraps si dimostrò capace di maggiore ripetibilità e riproducibilità, ma prestazioni aberrante occasionalmente cancellati questi guadagni. Anche i più semplice digestioni di proteina ha reso più ioni del peptide di LC-MS/MS potrebbe identificare durante un singolo esperimento. Abbiamo osservato che peptide sono elencati da coppie di replicati tecnici sovrapposti da 35-60%, dando una gamma per la ripetibilità del peptide-livello in questi esperimenti. Complessità del campione non sembra influenzare la ripetibilità di identificazione del peptide, anche come numeri di spettri identificati cambiato da un ordine di grandezza. Analisi statistica dei conteggi spettrale della proteina ha rivelato una maggiore stabilità attraverso tecniche replicati per Orbitraps, che li rende superiori agli strumenti LTQ per la scoperta di biomarcatori candidato. I peptidi più ripetibili erano quelli corrispondenti ai siti di clivaggio triptico convenzionali, quelli che produceva intensi MS segnali e quelli che hanno provocato dalle proteine generando molti peptidi distinti. Riproducibilità tra diversi strumenti dello stesso tipo rimasti indietro ripetibilità di tecniche replicati su un unico strumento diversi per cento. Questi risultati rafforzano l'importanza della valutazione di ripetibilità come una caratteristica fondamentale delle tecnologie analitiche.

Screening Automatizzato Di Anticorpi Monoclonali Per SISCAPA Dosaggi Utilizzando Una Perlina Magnetico Processore E Liquido Cromatografia-selezionato Reazione Monitoraggio-spettrometria Di Massa

Journal of Immunological Methods. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19961853

Gli standard dell'isotopo stabile e la cattura di anticorpi Anti-Peptide (SISCAPA) utilizza anticorpi per arricchire i peptidi da matrici complesse per la quantificazione di spettrometria di massa dell'isotopo stabile diluizione. SISCAPA migliora la sensibilità e limita la manipolazione del campione necessaria per analisi plasmatica. Finora, SISCAPA le analisi sono state eseguite utilizzando anticorpi policlonali, eppure gli anticorpi monoclonali sono un'alternativa interessante poiché forniscono squisita specificità, una risorsa rinnovabile e il potenziale per l'isolamento di cloni con affinità molto elevata (10(-9) M o migliore). La selezione di un anticorpo monoclonale buona fuori di centinaia di migliaia di cloni presenta una sfida, poiché il test di screening ideale dovrebbe essere nel formato del dosaggio SISCAPA finale, ma eseguendo manualmente i dosaggi è lavoro - e tempo-intenso. In questo manoscritto, dimostreremo che gli anticorpi monoclonali possono essere utilizzati in dosaggi SISCAPA, e descriviamo un metodo automatico di SISCAPA ad alta velocità che fa lo screening di un numero elevato di ibridomi fattibile mentre risparmiare tempo e risorse.

I Geni Saccharomyces Cerevisiae RAD9 E RAD17, RAD24 Sono Necessari Per La Soppressione Di Riparazione Post-replicative Mutageni Durante Cronico Danno Al DNA

DNA Repair. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20472512

In Saccharomyces cerevisiae, un checkpoint di danni del DNA nella fase S-è responsabile per ritardare la replicazione del DNA in risposta a stress genotossici. Questo percorso è parzialmente regolato da proteine checkpoint Rad9 e Rad17, Rad24. Qui, descriviamo un fenotipo romanzo hypermutable per rad9Delta, rad17Delta e rad24Delta cellule in risposta a una dose di 0,01% cronica del DNA alchilanti agente MMS. Segnaliamo che questo hypermutability deriva dall'introduzione di danni del DNA durante la fase S e dipende da un percorso di sintesi di translesion funzionale. Inoltre, abbiamo eseguito una schermata genetica per le interazioni con rad9Delta che conferiscono sensibilità di 0.01% MMS. Abbiamo relazione e quantificare 25 interazioni genetiche con rad9Delta, molti dei quali coinvolgono i macchinari di riparazione successive. Da questi dati, concludiamo che difetti nella regolazione di fase S checkpoint conducono a maggiore affidamento sulla sintesi di translesion mutageni e descriviamo un ruolo nuovo per i membri del checkpoint fase S DNA danni nel sopprimere mutageni post-replicative riparazione in risposta al trattamento con MMS subletale.

Effetto Di Ottimizzazione Energetica Collisione Sulla Misurazione Dei Peptidi Di Reazione Selezionata Monitoraggio Spettrometria Di Massa (SRM)

Analytical Chemistry. Dec, 2010  |  Pubmed ID: 21090646

Proteomics esperimenti basati sulla reazione selezionata di monitoraggio (SRM, noto anche come reazione di monitoraggio multipli o MRM) stanno usandi per un gran numero di candidati di proteine in miscele complesse di destinazione. Attualmente, i parametri dello strumento spesso sono ottimizzati per ogni processo intensivo del peptide, un tempo e risorse. Grandi esperimenti SRM sono notevolmente facilitati avendo la capacità di prevedere i parametri dello strumento di MS che funzionano bene con la grande diversità dei peptidi che target. Per questo motivo, abbiamo studiato l'impatto dell'utilizzo di semplici equazioni lineari per predire l'energia di collisione (CE) sull'intensità di segnale del peptide e confrontato con l'ottimizzazione empirica della CE per ogni peptide e transizione individualmente. Utilizzo ottimizzate delle equazioni lineari, la differenza tra i valori CE previsti ed empiricamente derivati è stata trovata per essere un guadagno medio di solo il 7,8% dell'area totale di picco. Abbiamo anche trovato che esistenti comunemente utilizzato equazioni lineari caduta a corto di loro potenziale e deve essere ricalcolato per ogni stato di carica e quando l'introduzione di nuove piattaforme di strumento. Forniamo una pipeline completamente automatizzata per calcolare queste equazioni e ottimizzare individualmente CE di ogni transizione su strumenti SRM da Agilent, biosistemi applicati, Thermo Scientific e acque in strumento software open source Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline).

Rilevamento Basato Sul Sangue Di Esposizione Alle Radiazioni in Esseri Umani Basata Sul Romanzo Fosfo-Smc1 ELISA

Radiation Research. Dec, 2010  |  Pubmed ID: 21171809

Astratto la manutenzione strutturale del cromosoma 1 (Smc1) della proteina è un membro della coesina altamente conservato complesso ed è coinvolta nella sorella coesione tra cromatidi fratelli. In risposta alle radiazioni ionizzanti, Smc1 è fosforilata in due siti, Ser-957 e Ser-966, e dipendono da questi eventi di fosforilazione della chinasi di proteina ATM. In questo studio, descriviamo la generazione del romanzo due test ELISA per quantificare phospho-Smc1(Ser-957) e phospho-Smc1(Ser-966). Utilizzando questi dosaggi romanzo, noi quantificare le risposte cinetiche e biodosimetric di cellule umane di origine ematologica, comprese cellule immortalate, come pure tranquilli e ciclismo PBMC umano primario. Inoltre, dimostriamo una robusta risposta in vivo per phospho-Smc1(Ser-957) e phospho-Smc1(Ser-966) nei linfociti di pazienti umani dopo terapeutico dell'esposizione alle radiazioni ionizzanti, irradiazione total-body, irradiazione parziale-corpo e esposizione interna a (131). Queste analisi sono utili per quantificare la risposta di danni del DNA in sistemi sperimentali e potenzialmente per l'identificazione degli individui esposti alle radiazioni dopo un incidente radiologico.

Valutazione Dello Sviluppo Di Analisi Proteomic Quantitativa Su Larga Scala Utilizzando La Spettrometria Di Massa Basata Su Affinità Del Peptide

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21245105

Stabile agli standard dell'isotopo e catturare dall'arricchimento di affinità coppie anticorpi antipeptide (SISCAPA) di peptidi con diluizione isotopica stabile e rilevamento di reazione più monitoraggio spettrometria di massa per fornire una misura quantitativa di peptidi come surrogati per loro rispettive proteine. In questo rapporto, descriviamo un studio di fattibilità per determinare il tasso di successo per la produzione di anticorpi adatti per SISCAPA dosaggi al fine di informare le strategie per lo sviluppo di test su larga scala. Un flusso di lavoro è stato progettato che comprendeva una strategia di immunizzazione multiplex in cui fino a cinque proteotypic peptidi da un singola proteina bersaglio sono stati utilizzati per immunizzare i conigli individuali. Un totale di 403 proteotypic triptico peptidi che rappresenta 89 destinazioni della proteina sono stati utilizzati come immunogeni. Antipeptide anticorpali sono stati misurati con ELISA e 220 anticorpi antipeptide che rappresentano le 89 proteine sono stati scelti per la purificazione di affinità. Questi anticorpi sono stati caratterizzati rispetto alla loro performance nella reazione SISCAPA-multiplo monitoraggio analisi utilizzando la matrice di plasma umano digerite tripsina. Più della metà dei saggi generati sono stati in grado di rilevare il peptide di destinazione in concentrazioni inferiori a 0,5 fmol/μl a nel plasma umano, corrispondente a concentrazioni di proteina di meno di 100 ng/ml. La strategia di multiplazione cinque peptide immunogeni riusciva a generare un dosaggio di lavoro per il 100% delle proteine mirati in questo studio di valutazione. Questi risultati indicano che è fattibile per un unico laboratorio sviluppare centinaia di analisi all'anno e consentire la pianificazione per la generazione di conveniente SISCAPA dosaggi.

Rilevamento Basato Sul Sangue Di Esposizione Alle Radiazioni in Esseri Umani Basata Sul Romanzo Fosfo-Smc1 ELISA

Radiation Research. Mar, 2011  |  Pubmed ID: 21388270

La manutenzione strutturale del cromosoma 1 (Smc1) della proteina è un membro della coesina altamente conservato complesso ed è coinvolta nella sorella coesione tra cromatidi fratelli. In risposta alle radiazioni ionizzanti, Smc1 è fosforilata in due siti, Ser-957 e Ser-966, e dipendono da questi eventi di fosforilazione della chinasi di proteina ATM. In questo studio, descriviamo la generazione del romanzo due test ELISA per quantificare phospho-Smc1(Ser-957) e phospho-Smc1(Ser-966). Utilizzando questi dosaggi romanzo, noi quantificare le risposte cinetiche e biodosimetric di cellule umane di origine ematologica, comprese cellule immortalate, come pure tranquilli e ciclismo PBMC umano primario. Inoltre, dimostriamo una robusta risposta in vivo per phospho-Smc1(Ser-957) e phospho-Smc1(Ser-966) nei linfociti di pazienti umani dopo terapeutico dell'esposizione alle radiazioni ionizzanti, irradiazione total-body, irradiazione parziale-corpo e esposizione interna a (131). Queste analisi sono utili per quantificare la risposta di danni del DNA in sistemi sperimentali e potenzialmente per l'identificazione degli individui esposti alle radiazioni dopo un incidente radiologico.

Proteoma E Transcriptome Profili Di Un Modello Murino Di Her2/Neu-driven Del Cancro Al Seno

Proteomics. Clinical Applications. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21448875

Abbiamo generato ampi transcriptional e proteomic profili da un modello murino di Her2-driven di cancro al seno che ricapitola strettamente il cancro al seno umano. Questo rapporto rende questi dati pubblicamente disponibili in moduli grezzi e lavorati, come una risorsa per la Comunità. Soprattutto, abbiamo precedentemente fatto biospecimens da questo stesso modello di mouse liberamente disponibile attraverso un repository di campione, così i ricercatori possono ottenere campioni per testare l'ipotesi biologiche senza la necessità di animali di allevamento e di raccolta biospecimens.

Una Mirata Basata Su Proteomics Pipeline Per La Verifica Dei Biomarcatori Nel Plasma

Nature Biotechnology. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21685906

Tecnologie high-throughput ora possono identificare centinaia di biomarcatori proteina candidato per qualsiasi malattia con relativa facilità. Tuttavia, perché non ci sono nessun dosaggi per la maggior parte delle proteine e de novo immunodosaggio sviluppo è proibitivamente costoso, che alcuni biomarcatori candidato vengono testati in studi clinici. Abbiamo testato se le prestazioni analitiche di una pipeline di identificazione di biomarker basata sulla spettrometria di massa mirata sarebbe sufficiente per dipendenti dai dati prioritizzazione dei biomarcatori candidato, de novo sviluppo di dosaggi e multiplexed verifica biomarcatore. Abbiamo usato un processo dipendente dai dati triage per definire le priorità di un sottoinsieme di biomarcatori putativo plasma da &gt; 1.000 candidati precedentemente identificati utilizzando un modello murino di cancro al seno. Eighty-eight romanzo analisi quantitative basate sulla reazione selezionata monitoraggio spettrometria di massa erano sviluppate, multiplexate e valutate in 80 campioni di plasma. Trenta-sei proteine sono state verificate come essere elevata nel plasma di animali del tumore-cuscinetto. Le prestazioni analitiche di questo gasdotto suggeriscono che essa dovrebbe sostenere l'uso di un approccio analogo con campioni umani.

Arricchimento Immunoaffinity Peptide Accoppiato Con Spettrometria Di Massa Per Quantificazione Della Proteina E Del Peptide

Clinics in Laboratory Medicine. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21907104

Valutazione Interlaboratorio Di Automatizzato, Multiplexed Arricchimento Immunoaffinity Peptide Accoppiato Alla Reazione Più Monitoraggio Spettrometria Di Massa Per Quantificare Le Proteine Nel Plasma

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22199228

L'impossibilità di quantificare un gran numero di proteine nei tessuti e ha con alta precisione, la sensibilità e la velocità effettiva è un collo di bottiglia importante negli studi di biomarker. Abbiamo precedentemente dimostrato che giunto arricchimento immunoaffinity usando gli anticorpi anti-peptide (SISCAPA) a MRM-MS produce saggi immuno-MRM che possono essere multiplexati per quantificare le proteine nel plasma con alta sensibilità, specificità e precisione. Riportiamo che la prima valutazione sistematica delle prestazioni interlaboratorio multiplexed (8-plex) immuno-MRM-MS in tre laboratori indipendenti. È stato condotto uno studio in scena in cui è stato valutato l'effetto di ogni fase di elaborazione e analisi su analisi CV, LOD e LOQ recupero. Limiti di rilevamento sono stati pari o inferiore a 1 ng/mL per le proteine dosate in 30 uL di plasma. Riproducibilità del test è stato accettabile per verifica studi, con mediana intra - e inter - laboratorio CVs sopra il LOQ del 11% e < 14%, rispettivamente, per il processo intero saggio immuno-MRM-MS, compresa la digestione enzimatica del plasma. Digestione della tripsina e la sua gestione campione necessarie più per analisi di variabilità contribuito e ridotto il recupero dei peptidi di destinazione da proteine digerite. Utilizzando un isotopo stabile etichettato proteine come standard interno invece di un isotopo stabile etichettato peptidi per tenere conto delle perdite nel processo di digestione quasi raddoppiato il dosaggio precisione per questo migliorando la precisione di dosaggio 5%. I nostri risultati dimostrano che multiplex immuno-MRM-MS possono essere resi riproducibili attraverso laboratori indipendenti e ha il potenziale per essere adottato ampiamente per dosaggio proteine in matrici complesse come plasma.

Quantificazione Dell'analita Multiplex Sequenziale Mediante Arricchimento Immunoaffinity Peptide Accoppiato Alla Spettrometria Di Massa

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22203691

Arricchimento immunoaffinity peptide accoppiato alla reazione selezionata monitoraggio spettrometria di massa (SRM) (immuno-SRM) è emerso come una tecnologia con grandi potenzialità per le analisi proteomic quantitativa. Un vantaggio sopra immunodosaggi tradizionale è l'enorme potenziale per la quantificazione simultanea di più analiti da un campione (vale a dire analisi multiplex). Abbiamo cercato di esplorare le capacità della tecnica immuno-SRM per analizzare un gran numero di analiti di valutare le funzionalità di multiplex e dimostrando l'analisi sequenza dei gruppi di peptidi da un singolo campione. Per valutare l'analisi multiplex, immuno-SRM dosaggi erano organizzati in gruppi di 10, 20, 30, 40 e 50 peptidi usando un insieme comune di reagenti. I dosaggi di multiplex immuno-SRM erano usati per misurare i peptidi sintetici aggiunti al plasma che copre diversi ordini di grandezza concentrazione. Misurazioni effettuate in grandi gruppi multiplex erano altamente correlati (r2 ≥ 0.98) e caratterizzato da buon accordo (bias ≤ 1%) rispetto al singolo plex dosaggi o una configurazione 10-plex. La capacità di arricchire in modo sequenziale insiemi di peptidi di analita è stata dimostrata da arricchente gruppi di 10 peptidi da un campione di plasma in modo sequenza. I dati mostrano buon accordo (bias ≤ 1,5%) e riproducibilità simili indipendentemente dall'ordine di arricchimento. Questi avanzamenti significativi dimostrano l'utilità di immuno-SRM per analizzare un gran numero di analiti, come negli esperimenti di verifica biomarcatore grandi o in analisi mirate basate sul percorso.