Un Recurso De Reactivos Para Identificar Las Proteínas Y Péptidos De Interés Para La Comunidad Del Cáncer: Un Informe Del Taller

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Oct, 2006  |  Pubmed ID: 16867976

Sobre la base de conversaciones con representantes de todos los sectores de la comunidad de investigación del cáncer, el Instituto Nacional del Cáncer (NCI), reconoce las inmensas oportunidades que permitan aplicar las técnicas de proteómica para la investigación del cáncer más allá. Validados y bien caracterizados reactivos de captura de afinidad (por ejemplo, anticuerpos y aptámeros affibodies) jugará un papel clave en las plataformas de proteómica de investigación para la prevención, detección temprana, tratamiento y seguimiento del cáncer. Para discutir las maneras de desarrollar nuevos recursos y optimizar las oportunidades actuales en este ámbito, el NCI convocó a la "Proteómica Tecnologías Taller de Recursos Reactivos" en Chicago, IL 12-13 de diciembre de 2005. El taller reunió a científicos líderes en la investigación proteómica para analizar los sistemas de modelo para la evaluación y la entrega de recursos para los reactivos de apoyo a plataformas MS y la afinidad de captura. Los oradores examinaron los problemas y puntos de acción identificados relacionados con una visión de conjunto de propuestas y modelos para un recurso compartido reactivos proteómica, las aplicaciones de los métodos de captura de afinidad en la investigación del cáncer, control de calidad y validación de los reactivos de captura de afinidad, las consideraciones para la selección de objetivos, y la construcción de un reactivos base de datos. La reunión también contó con las presentaciones y debates de los principales investigadores del sector privado en las tecnologías de estado de la técnica y las capacidades para satisfacer las necesidades de la comunidad del usuario. Este taller se desarrolló como un componente de la Clínica del Instituto Nacional del Cáncer de Proteómica Iniciativa de Tecnologías para el Cáncer, una iniciativa coordinada que incluya el establecimiento de los recursos de reactivos para la comunidad científica. Este informe del taller explora diversos enfoques para desarrollar un marco que la mayor eficacia, cumplir con las necesidades del Instituto Nacional del Cáncer y de la comunidad de investigación del cáncer.

La Normalización En Materia De No-al Azar Los Valores Perdidos En Alto Rendimiento De Datos Espectrometría De Masas

Pacific Symposium on Biocomputing. Pacific Symposium on Biocomputing. 2006  |  Pubmed ID: 17094249

Se propone un procedimiento de normalización de dos etapas de alto rendimiento para espectrometría de masas (MS) de datos, lo cual es un paso necesario en la agrupación o la clasificación de biomarcadores. En primer lugar, un paso de normalización global se utiliza para eliminar las fuentes de variación sistemática entre los perfiles de MS debido a, por ejemplo, cantidades variables de degradación de la muestra con el tiempo. Un modelo de probabilidad se utiliza entonces para investigar la intensidad dependientes de eventos que faltan y proporciona sustituciones posibles para los valores que faltan. Se ilustra el funcionamiento del método con un conjunto de datos LC-MS conjunto de mezclas de proteínas sintéticas.

Basado En Anticuerpos De Enriquecimiento De Los Péptidos En Partículas Magnéticas Para La Espectrometría De Masas Basado En La Cuantificación De Biomarcadores Séricos

Analytical Biochemistry. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17241609

Un obstáculo importante para la validación de los nuevos diagnósticos clínicos en el desarrollo de técnicas más sensibles y específicas para la cuantificación de las proteínas. Hemos descrito previamente un método, las normas de isótopos estables con la captura por los anticuerpos antipéptido, en el que un péptido tríptico específico es seleccionado como un representante estequiométrica de la proteína de la que es escindido, se enriquece a partir de muestras biológicas utilizando anticuerpos inmovilizados, y se cuantificó mediante espectrometría de masas contra un patrón interno de púas para dar una medida de la concentración de proteína. En este estudio, se optimiza una plataforma magnética talón basado susceptibles de captura péptido de alto rendimiento y demostró que la captura de anticuerpos seguido por espectrometría de masas pueden lograr mejoras de iones de señal del orden de 10 (3), con precisión (CV <10% ) y la precisión (error relativo de aproximadamente 20%) suficiente para la cuantificación de biomarcadores en el fisiológicamente relevantes ng / mL. Estos métodos son aplicables en general a cualquier fluido o biológicas de proteínas de interés y tienen un gran potencial para proporcionar una tecnología necesita desesperadamente un puente entre el descubrimiento de biomarcadores y aplicación clínica.

Cabeza a Cabeza Comparación De Las Técnicas De Fraccionamiento De Suero

Journal of Proteome Research. Feb, 2007  |  Pubmed ID: 17269739

Múltiples enfoques para simplificar el proteoma suero se han descrito. Estas técnicas son generalmente desarrollados a través de diferentes laboratorios, muestras, plataformas de espectrometría de masas y herramientas de análisis. Por lo tanto, la comparación de los sistemas disponibles es imposible en la literatura existente, debido a las variables de confusión. Se describe una comparación cabeza a cabeza de varios esquemas de fraccionamiento de suero, incluyendo el enriquecimiento de N-vinculada glicopéptido, el enriquecimiento de cisteinil-péptido, separación magnética talón (C3, C8 y WCX), fraccionamiento de tamaño, el agotamiento de la proteína A / G, y de inmunoafinidad columna agotamiento de abundantes proteínas séricas. Cada técnica se comparan con los resultados obtenidos a partir de suero humano no fraccionada. Los resultados muestran inmunoafinidad la resta es el medio más eficaz para simplificar el proteoma de suero mientras se mantiene el flujo de muestras razonable. El conjunto de datos está disponible al público informado y proporciona un estándar contra el cual las tecnologías emergentes pueden ser comparados y evaluados por su contribución al descubrimiento de biomarcadores basado en suero.

Canalización Integrada De Discovery Espectrometría De Masas Basado En Y De La Confirmación De Los Biomarcadores Demostrado En Un Modelo De Ratón De Cáncer De Mama

Journal of Proteome Research. Oct, 2007  |  Pubmed ID: 17711321

A pesar de su potencial impacto en el diagnóstico y tratamiento del cáncer, biomarcadores de unas pocas proteínas se encuentran en uso clínico. El descubrimiento de biomarcadores está plagada de dificultades que van desde la tecnología (la imposibilidad de interrogar a todo el mundo proteomas) a (las diferencias genéticas y ambientales entre los pacientes y sus tumores) biológicos. Necesitamos urgentemente nuevos paradigmas para el descubrimiento de biomarcadores. Para reducir al mínimo la variación biológica y facilitar las pruebas de la proteómica, hemos empleado un modelo de ratón de cáncer de mama. En concreto, se realizó LC-MS/MS de tejido del tumor mamario normal y de un modelo de ratón HER2/Neu-driven condicional de cáncer de mama, la identificación de los péptidos que representan a 6758> 700 proteínas. Hemos desarrollado un nuevo método estadístico (SASPECT) para la priorización de las proteínas diferencialmente representados en conjuntos de datos LC-MS/MS y proteínas identificadas más o de menos representados en los tumores. Usando una combinación de enfoques basados ​​en anticuerpos y la reacción de monitoreo múltiple de espectrometría de masas (MRM-MS), que confirmó la sobreproducción de proteínas múltiples a nivel de tejido, identificado fibulina-2 como un marcador biológico de plasma, y ​​descrito con detalle la osteopontina como marcador biológico de plasma capaz de detección temprana de la enfermedad en el ratón. Nuestros resultados muestran que el empleo de un gasoducto en escena escopeta basados ​​en proteómica comparativa para el descubrimiento de biomarcadores y la monitorización de reacciones múltiples para la confirmación de los candidatos biomarcadores es capaz de encontrar el tejido nuevo y biomarcadores de plasma en un modelo de ratón de cáncer de mama. Además, el enfoque puede ser extendido para encontrar biomarcadores pertinentes a la enfermedad humana.

La Interfaz Entre El Descubrimiento De Biomarcadores Y Validación Clínica: El Pozo De Alquitrán Del Oleoducto De Biomarcadores De Proteínas

Proteomics. Clinical Applications. Oct, 2008  |  Pubmed ID: 20976028

La aplicación de las "ómicas" tecnologías para muestras biológicas genera cientos de miles de biomarcadores candidatos, sin embargo, un número desalentador pequeña hacerlo a través de la tubería para el uso clínico. Esto se debe en gran parte debido a la falta de coincidencia increíble entre un gran número de candidatos de biomarcadores y la escasez de ensayos y métodos fiables para estudios de validación. Necesitamos desesperadamente una tubería que alivia este cuello de botella entre el descubrimiento y validación de biomarcadores. Este artículo revisa los requisitos para las tecnologías de manera adecuada los candidatos con credenciales de biomarcadores para la validación clínica costosa y propone métodos y sistemas para verificar los candidatos biomarcadores. Los modelos que prevén la puesta en común de muestras clínicas, en su caso, se discuten. Llegamos a la conclusión de que las actuales tecnologías proteómicas en la cúspide de afectar significativamente a la traducción de diagnóstico molecular a la clínica.

Una Detección Y El Proyecto Proteoma Humano Cuantificación

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. May, 2009  |  Pubmed ID: 19131327

La falta de pruebas sensibles, específicas, multiplexable para la mayoría de las proteínas humanas es la principal barrera técnica que impide el desarrollo de biomarcadores candidatos en las pruebas de utilidad clínica. Los recientes progresos en la espectrometría de masas basada en ensayos de péptidos proteotypic, particularmente aquellos con el enriquecimiento específica péptido de afinidad, ofrece un camino sistemático y económico para la cobertura cuantitativa completa del proteoma humano. Una serie completa de ensayos, por ejemplo, dos péptidos de la proteína producto de cada uno de los aproximadamente 20.500 genes humanos (aquí denominado el proteoma humano y la detección de cuantificación del proyecto), que permiten la verificación rápida y sistemática de los biomarcadores candidatos y establecer una base cuantitativa para los esfuerzos subsiguientes para definir el universo más amplio de variantes de empalme, modificaciones post-traduccionales, las interacciones proteína-proteína, y la localización del tejido.

Una Radiación Derivada De La Firma Expresión Genética Predice Los Resultados Clínicos Para Los Pacientes De Cáncer De Mama

Radiation Research. Feb, 2009  |  Pubmed ID: 19267539

La activación de la vía de respuesta al daño del ADN es una característica de la tumorigénesis temprana, mientras que la pérdida de actividad de la vía se asocia con la progresión de la enfermedad. Por lo tanto la hipótesis de que una expresión genética asociada con la respuesta al daño en el ADN puede servir como una firma pronóstico para los resultados en pacientes con cáncer. Se identificaron ionizantes sensibles a la radiación transcripciones en células de linfoblastos humanos derivados de 12 individuos y utiliza esta firma para cribar un panel de datos de cáncer establece para la capacidad de predecir supervivencia a largo plazo de pacientes con cáncer. Se demuestra que conjuntos de genes inducidos o reprimidos por la radiación ionizante puede predecir el resultado clínico en dos conjuntos independientes de datos de cáncer de mama, y ​​se compara la firma de la radiación de los resultados descritos anteriormente predictores de genes basadas en la expresión. Mientras que los genes reprimidos en respuesta a la radiación probablemente representan la proliferación de la firma bien caracterizado de predicción de los resultados del cáncer de mama, los genes inducidos por la radiación probable que codifican la información adicional que represente otros desregulados propiedades biológicas de los tumores como el puesto de control o las respuestas de apoptosis.

La Evolución Del Papel De La Espectrometría De Masas En El Descubrimiento De Biomarcadores De Cáncer

Cancer Biology & Therapy. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19502776

Aunque el campo de la espectrometría de masas basado proteómica es todavía en su infancia, los acontecimientos recientes en específicas técnicas de proteómica han dejado el campo a punto de impactar en la tubería de biomarcadores de proteínas clínica, ahora más que en cualquier otro momento en la historia. para la proteómica para cumplir con su potencial para la búsqueda de biomarcadores, clínicos, estadísticos, epidemiólogos y químicos deben trabajar juntos en un enfoque interdisciplinario. Estos esfuerzos interdisciplinarios tendrán la mayor posibilidad de éxito si los participantes de cada disciplina tenga un conocimiento básico de las otras disciplinas. A tal fin, el propósito de esta revisión es proporcionar una visión no técnica de las nuevas funciones / evolución que la espectrometría de masas (en especial los modos específicos de la espectrometría de masas) puedan jugar en la tubería de biomarcadores, en la esperanza de hacer que la tecnología sea más accesible a la más amplia la comunidad a los esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores. Además, las tecnologías analizadas son ampliamente aplicables a los estudios proteómicos, y no se limitan al descubrimiento de biomarcadores.

Multi-sitio De Evaluación De La Precisión Y La Reproducibilidad De Los Múltiples De Reacción a Base De Monitoreo-Las Mediciones De Proteínas En El Plasma

Nature Biotechnology. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19561596

La verificación de biomarcadores candidatos se basa en los ensayos cuantitativos específicos optimizados para la detección selectiva de las proteínas diana, y está cada vez más como un paso crítico en el descubrimiento de nuevas que el descubrimiento de biomarcadores puentes imparcial para la validación preclínica. A pesar de los distintos laboratorios han demostrado que la monitorización de reacción múltiple (MRM) acoplada a espectrometría de masas por dilución isotópica puede cuantificar biomarcadores candidatos de proteínas en el plasma, la reproducibilidad y la transferibilidad de estas pruebas entre los laboratorios no han sido demostrados. Se describe un estudio de varios laboratorios para evaluar la reproducibilidad, la recuperación, rango dinámico lineal y los límites de detección y cuantificación de MRM multiplexadas, a base de ensayos, llevados a cabo por el NCI CPTAC. El uso de materiales comunes y protocolos estandarizados, se demuestra que estos ensayos pueden ser altamente reproducible dentro y fuera de los laboratorios y plataformas de instrumentos, y son sensibles a bajas concentraciones de proteína taza / ml en plasma no fraccionada. Se aportan datos y puntos de referencia contra el cual los distintos laboratorios pueden comparar su desempeño y evaluar nuevas tecnologías para la verificación de biomarcadores en el plasma.

Basado En Anticuerpos De La Pantalla Para Radiaciones Ionizantes Dependen De Los Cambios En El Proteoma De Mamíferos Para Uso En Biodosimetry

Radiation Research. May, 2009  |  Pubmed ID: 19580490

En un esfuerzo para identificar los cambios proteómicos que pueden ser útiles para la biodosimetry la radiación, las células humanas de origen hematológico fueron tratados con radiaciones ionizantes o simulacro de irradiados y luego cosechada en diferentes momentos después del tratamiento. Proteína lisados ​​se generaron a partir de estas células y evaluados por Western Blot utilizando un panel de 301 anticuerpos disponibles comercialmente dirigidos 161 proteínas únicas. Desde esta pantalla, se identificaron 55 que responden a la radiación ionizante, incluyendo las proteínas de 14 proteínas no se informó previamente a ser sensible a la radiación a nivel de proteínas. Los datos de esta pantalla a gran escala han sido reunidas en un sitio web público (http://labs.fhcrc.org/paulovich/biodose_index.html) que pueden ser de valor para la comunidad de la radiación, tanto como fuente de biomarcadores putativo de biodosimetry y también como una fuente de datos de validación de anticuerpos disponibles comercialmente que detectan la radiación sensibles-proteínas. El uso de un panel de biomarcadores candidatos de radiación en líneas celulares humanas, que demuestran la viabilidad de montar un panel complementario de respuesta a la radiación proteínas. Por otra parte, se demuestra la viabilidad de la utilización de sangre basados ​​en la célula de los cambios proteómicos biodosimetry mediante la demostración de detección de cambios en las proteínas en las células circulantes después de la irradiación corporal total en un modelo canino.

Métricas De Rendimiento Para Los Sistemas De Líquidos En Tándem Cromatografía-espectrometría De Masas En El Análisis De Proteómica

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19837981

Una gran necesidad no satisfecha en el análisis de proteómica LC-MS/MS-based es un conjunto de herramientas para la evaluación cuantitativa del rendimiento del sistema y la evaluación de la variabilidad técnica. Aquí se describen 46 indicadores de desempeño del sistema para monitorear el desempeño cromatográfico, la estabilidad fuente de electrospray, MS1 y MS2 señales, el muestreo dinámico de iones de MS / MS, y la identificación de péptidos. Aplicado a los conjuntos de datos de los análisis LC-MS/MS repetidas, estas cifras muestran respuestas coherentes y razonables a las perturbaciones controladas. Las métricas típicamente muestran variaciones menos de 10% y por lo tanto puede revelar diferencias incluso sutiles en el rendimiento de los componentes del sistema. Los análisis de los datos de los estudios interlaboratorios realizadas en el marco de un procedimiento operativo estándar común identificar los datos atípicos y proporcionó pistas sobre las causas específicas. Por otra parte, la variación entre laboratorios se refleja en los indicadores indica que los componentes del sistema varían más entre los laboratorios. La aplicación de estos indicadores permite la evaluación racional, de calidad cuantitativa de la proteómica y la LC-MS/MS otras aplicaciones analíticas.

Un Método Automático Y El Multiplexado Para El Enriquecimiento De Inmunoafinidad Alto Rendimiento De Péptidos Y Monitoreo De Reacción Múltiple Espectrometría De Masas Basado En La Cuantificación De Biomarcadores De Proteínas

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 19843560

Hay una necesidad urgente de ensayos cuantitativos en la verificación y validación de la gran cantidad de candidatos biomarcadores de proteínas producidas en las modernas "-ómicas" los experimentos. Las normas de isótopos estables con la captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) ha demostrado un enorme potencial para satisfacer esta necesidad mediante la combinación de enriquecimiento de inmunoafinidad péptido con la espectrometría de masas cuantitativa. En este estudio, se describen tres importantes avances a la técnica SISCAPA. En primer lugar, desarrollamos un método para un sistema automatizado de bolas magnéticas basada en la plataforma con capacidad de procesamiento de alto rendimiento. En segundo lugar, poner en práctica el método automatizado en un ensayo de multiplexado SISCAPA (nueve objetivos en un ensayo) y valorar las características de rendimiento del ensayo multiplex. Uso de la automática, plataforma de multiplexado, que demuestran los límites de detección en el fisiológicamente relevantes ng / ml (desde el 10 microlitros de plasma) con la suficiente precisión (coeficiente de variación media, el 12,6%) para la cuantificación de biomarcadores. En tercer lugar, hemos demostrado que el enriquecimiento de péptidos a partir de grandes volúmenes de plasma (1 ml) se puede extender los límites de detección a la baja pg / ml rango de concentración de proteína. El método es aplicable en general a cualquier muestra de la proteína o biológicas de interés y una gran promesa para el análisis de un gran número de candidatos biomarcadores.

Estudio Interlaboratorios Caracterización De La Norma De Desempeño Levadura De Rendimiento De La Plataforma De Evaluación Comparativa De LC-MS

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19858499

El rendimiento óptimo de las plataformas de LC-MS/MS es fundamental para generar altos de calidad de datos proteómicos. A pesar de los distintos laboratorios han desarrollado muestras de control de calidad, no hay ninguna norma de rendimiento ampliamente a disposición de la complejidad biológica (y los conjuntos de datos de referencia) para la evaluación comparativa del rendimiento de la plataforma para el análisis de proteomas complejos biológicos a través de los diferentes laboratorios de la comunidad. Preparaciones individuales de la levadura Saccharomyces cerevisiae proteoma han sido ampliamente utilizados por los laboratorios de la comunidad de la proteómica para caracterizar LC-MS rendimiento de la plataforma. El proteoma de levadura es un atractivo singular como un estándar de rendimiento, ya que es el más ampliamente caracterizado proteoma complejo biológico y el único asociado con varios estudios a gran escala de estimación de la abundancia de todas las proteínas detectables. En este estudio, se describe un protocolo de funcionamiento estándar para la producción a gran escala de la norma de desempeño de la levadura y las alícuotas ofrecer a la comunidad a través del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología en el proteoma de levadura se encuentra en desarrollo como un material de referencia certificado para satisfacer a largo plazo necesidades de la comunidad. Utilizando una serie de indicadores que caracterizan el desempeño de LC-MS, ofrecemos un conjunto de datos de referencia establecidos que demuestra el rendimiento típico de plataformas de uso común del instrumento de trampa de iones en laboratorios especializados, los resultados proporcionan una base para que los laboratorios de referencia de su propio desempeño, para mejorar los métodos actuales , y para evaluar las nuevas tecnologías. Además, se demuestra cómo la referencia levadura, enriquecida con proteínas humanas, se puede utilizar para comparar la potencia de las plataformas de proteómica para la detección de proteínas expresadas diferencialmente en los diferentes niveles de concentración en una matriz compleja, proporcionando así una métrica para evaluar y minimizar pre- variación analítica y analítica en los experimentos de proteómica comparativa.

La Repetibilidad Y La Reproducibilidad En Las Identificaciones Proteómico Por Cromatografía Líquido-espectrometría De Masas En Tándem

Journal of Proteome Research. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19921851

La complejidad de la instrumentación de proteómica para la LC-MS/MS presenta muchas posibles fuentes de variabilidad. Dependiente de los datos de muestreo de péptidos constituye un elemento estocástico en el centro de la proteómica descubrimiento. Aunque esta variación afecta a la identificación de los péptidos, las identificaciones proteómicos están lejos de ser completamente al azar. En este estudio, analizamos los conjuntos de datos entre laboratorios del Instituto Nacional del Cáncer Clínica de Evaluación de Tecnologías para el cáncer de Proteómica para examinar la repetibilidad y la reproducibilidad en péptidos y las identificaciones de proteínas. Los datos incluidos abarcó 144 experimentos LC-MS/MS en cuatro Thermo LTQ Orbitrap y cuatro instrumentos. Las muestras incluyeron lisado de levadura, el NCI-20 se define el rango dinámico de mezcla de proteínas, y el SAI Sigma una mezcla definida de proteínas equimolar. Algunos de nuestros hallazgos reforzado sabiduría convencional, tal como repetibilidad y reproducibilidad siendo mayor para las proteínas que para péptidos. La mayoría de las lecciones de los datos, sin embargo, eran más sutiles. Orbitraps demostrado ser capaz de una mayor repetibilidad y la reproducibilidad, pero el rendimiento aberrante de vez en cuando borrar esas ganancias. Incluso los más simples las digestiones de proteínas dado más iones de péptidos que LC-MS/MS pudo identificar en un solo experimento. Hemos observado que las listas de péptidos a partir de pares de repeticiones técnica solapado por 35-60%, dando un rango para el péptido a nivel de repetición en estos experimentos. Complejidad de muestra no parece afectar a la repetibilidad de identificación de péptidos, aún cuando el número de espectros identificado cambiado por un orden de magnitud. El análisis estadístico de los recuentos de las proteínas del espectro reveló una mayor estabilidad a través de repeticiones técnica de Orbitraps, haciéndolas superiores a los instrumentos LTQ para el descubrimiento de biomarcadores candidatos. Los péptidos más repetibles eran los correspondientes a los sitios de escisión convencionales trípticos, aquellas que producen intensas señales MS, y aquellos que resultan de las proteínas que generan muchos péptidos distintos. Reproducibilidad entre diferentes instrumentos del mismo tipo rezagado repetibilidad de técnicos repeticiones en un solo instrumento por varios puntos porcentuales. Estos resultados refuerzan la importancia de evaluar la repetibilidad como una característica fundamental de las tecnologías de análisis.

Detección Automatizada De Anticuerpos Monoclonales Para Ensayos SISCAPA Usando Un Procesador De Bolas Magnéticas Y Cromatografía Líquida-espectrometría De Reacción Seleccionada De Vigilancia De La Masa

Journal of Immunological Methods. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19961853

Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) utiliza anticuerpos para enriquecer péptidos a partir de matrices complejas para la cuantificación por espectrometría de masas de isótopos estables de dilución. SISCAPA mejora la sensibilidad y limita el manejo de la muestra requerido para el plasma basado en el análisis. Hasta ahora, los ensayos SISCAPA se han realizado utilizando anticuerpos policlonales, sin embargo, los anticuerpos monoclonales son una alternativa atractiva ya que proporcionan especificidad exquisita, un recurso renovable, y el potencial para el aislamiento de clones con afinidades muy altos (10 (-9) M o mejor) . La selección de un anticuerpo monoclonal de buena cientos-a-miles de clones presenta un reto, ya que el ensayo de cribado idealmente debe estar en el formato de la final del ensayo SISCAPA, pero realizando los ensayos de forma manual es de mano de obra y requiere mucho tiempo. En este manuscrito, se demuestra que los anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados en ensayos de SISCAPA, y se describe un sistema automatizado de alto rendimiento método SISCAPA que hace detección de un gran número de hibridomas viables mientras que el tiempo conservar y recursos.

El Saccharomyces Cerevisiae Rad9, Rad17 Y Rad24 Genes Son Requeridas Para La Supresión De Un Potencial Post-replicativa De Reparación En El Daño Del ADN Crónica

DNA Repair. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20472512

En Saccharomyces cerevisiae, un puesto de control de daño del ADN en la fase S es responsable del retraso de la replicación del ADN en respuesta a estrés genotóxico. Esta vía se encuentra parcialmente regulada por las proteínas de control Rad9, Rad17 y Rad24. Aquí, se describe un nuevo fenotipo hypermutable para rad9Delta, rad17Delta y células rad24Delta en respuesta a una dosis crónica 0,01% del ADN agente alquilante MMS. Nos informan de que este hipermutabilidad resultados derivados de la introducción daños en el ADN durante la fase S y depende de una vía de síntesis de translesion funcional. Además, se realizó un rastreo genético de las interacciones con rad9Delta que confieren sensibilidad a 0,01% MMS. Presentamos 25 y cuantificar las interacciones genéticas con rad9Delta, muchas de las cuales implican la maquinaria de reparación post-replicación. A partir de estos datos, llegamos a la conclusión de que los defectos en la fase S de plomo puesto de control de regulación para una mayor dependencia de la síntesis de translesion mutagénico, y se describe un nuevo papel para los miembros del puesto de control de ADN de la fase S en la supresión de los daños mutagénicos post-replicativa de reparación en respuesta a subletal MMS tratamiento.

Efecto De La Optimización De Energía De Colisión En La Medición De Los Péptidos Por El Control De La Reacción Seleccionada (SRM) Espectrometría De Masas

Analytical Chemistry. Dec, 2010  |  Pubmed ID: 21090646

Proteómica experimentos basados ​​en control de la reacción seleccionada (SRM, también conocido como control de la reacción múltiple o MRM) están siendo utilizados para atacar un gran número de candidatos de proteínas en mezclas complejas. En la actualidad, los parámetros del instrumento se han optimizado para cada péptido, el tiempo y un proceso de recursos. Grandes experimentos SRM se facilitó en gran medida por tener la capacidad de predecir los parámetros de MS instrumentos que funcionan bien con la amplia diversidad de péptidos que se dirigen. Por esta razón, se investigó el impacto del uso de ecuaciones lineales simples para predecir la energía de colisión (CE) sobre la intensidad de la señal de péptidos y la comparó con la optimización empírica de la CE para cada péptido y la transición de forma individual. Uso optimizado ecuaciones lineales, la diferencia entre predecir y derivados empíricamente los valores de la CE se encontró que era una ganancia promedio de sólo el 7,8% del área total del pico. También se encontró que los actuales de uso común ecuaciones lineales por debajo de su potencial, y debe ser recalculado para cada estado de la carga y cuando la introducción de nuevas plataformas de instrumentos. Ofrecemos una tubería totalmente automatizado para el cálculo de estas ecuaciones y de forma individual la optimización de la CE de cada uno de transición en instrumentos de MSR de Agilent, Applied Biosystems, Thermo Scientific y Aguas de la herramienta de software de código abierto Skyline (http://proteome.gs.washington.edu / software / horizonte).

A Base De Sangre De Detección De La Exposición a La Radiación En Los Seres Humanos Basada En La Novela Fosfo-SMC1 ELISA

Radiation Research. Dec, 2010  |  Pubmed ID: 21171809

Resumen El mantenimiento de la estructura del cromosoma 1 (SMC1) proteína es un miembro de la muy conservada cohesin complejo y está involucrado en la cohesión de cromátidas hermanas. En respuesta a la radiación ionizante, SMC1 es fosforilada en dos sitios, Ser-957 y Ser 966-, y estos eventos de fosforilación son dependientes de la proteína quinasa ATM. En este estudio, se describe la generación de dos nuevas pruebas ELISA para la cuantificación de fosfo-SMC1 (Ser-957) y fosfo-SMC1 (Ser-966). El uso de estos nuevos ensayos, que cuantificar las respuestas cinéticas y biodosimetric de células humanas de origen hematológico, incluyendo las células inmortalizadas, así como tanto en reposo y en bicicleta PBMC humano primario. Además, se demuestra una robusta respuesta in vivo para fosfo-SMC1 (Ser-957) y fosfato SMC1 (Ser-966) en linfocitos de pacientes humanos después de la exposición a la radiación ionizante terapéutica, incluyendo la irradiación corporal total, parcial irradiación corporal, y la exposición interna a (131) I. Estos ensayos son útiles para la cuantificación de la respuesta al daño en el ADN en sistemas experimentales y potencialmente para la identificación de individuos expuestos a la radiación después de un incidente radiológico.

Evaluación De Las Inversiones a Gran Escala Ensayo Cuantitativo De Proteómica Con Péptido De Afinidad Basada En La Espectrometría De Masas

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21245105

Las normas de isótopos estables y la captura de anticuerpos antipéptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables y la detección por espectrometría de masas de reacción múltiple de control para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. En este reporte se describe un estudio de factibilidad para determinar la tasa de éxito para la producción de anticuerpos adecuados para los ensayos de SISCAPA con el fin de informar a las estrategias para el desarrollo de ensayos a gran escala. Un flujo de trabajo fue diseñado que incluye una estrategia de inmunización multiplex en el que hasta cinco péptidos proteotypic de una sola proteína diana se utiliza para inmunizar conejos individuales. Un total de 403 péptidos trípticos proteotypic que representan 89 dianas proteicas fueron utilizados como inmunógenos. Los títulos de anticuerpos antipéptido se midieron por ELISA y 220 anticuerpos antipéptido que representan 89 proteínas fueron elegidos para la purificación de afinidad. Estos anticuerpos se caracterizaron con respecto a su rendimiento en SISCAPA-múltiples ensayos de reacción de seguimiento utilizando tripsina digerido humano matriz de plasma. Más de la mitad de los ensayos generados fueron capaces de detectar el péptido diana a concentraciones de menos de 0,5 fmol / l en el plasma humano, correspondiente a las concentraciones de proteína de menos de 100 ng / ml. La estrategia de multiplexación cinco inmunógenos peptídicos tuvo éxito en la generación de un ensayo de trabajo para el 100% de las proteínas específicas en este estudio de evaluación. Estos resultados indican que es factible para un solo laboratorio para desarrollar cientos de ensayos por año y permitir la planificación para que sea rentable la generación de ensayos SISCAPA.

La Sangre Basado En La Detección De Exposición a La Radiación En Los Seres Humanos Basada En La Novela Fosfo-SMC1 ELISA

Radiation Research. Mar, 2011  |  Pubmed ID: 21388270

El mantenimiento de la estructura de las proteínas del cromosoma 1 (SMC1) es un miembro de la muy conservada cohesin complejo y está involucrado en la cohesión de cromátidas hermanas. En respuesta a la radiación ionizante, SMC1 es fosforilada en dos sitios, Ser-957 y Ser 966-, y estos eventos de fosforilación son dependientes de la proteína quinasa ATM. En este estudio, se describe la generación de dos nuevas pruebas ELISA para la cuantificación de fosfo-SMC1 (Ser-957) y fosfo-SMC1 (Ser-966). El uso de estos nuevos ensayos, que cuantificar las respuestas cinéticas y biodosimetric de células humanas de origen hematológico, incluyendo las células inmortalizadas, así como tanto en reposo y en bicicleta PBMC humano primario. Además, se demuestra una robusta respuesta in vivo para fosfo-SMC1 (Ser-957) y fosfato SMC1 (Ser-966) en linfocitos de pacientes humanos después de la exposición a la radiación ionizante terapéutica, incluyendo la irradiación corporal total, parcial irradiación corporal, y la exposición interna a (131) I. Estos ensayos son útiles para la cuantificación de la respuesta al daño en el ADN en sistemas experimentales y potencialmente para la identificación de individuos expuestos a la radiación después de un incidente radiológico.

Perfiles Proteoma Y Transcriptoma De Un Modelo De Ratón De Cáncer De Mama Her2/Neu-driven

Proteomics. Clinical Applications. Apr, 2011  |  Pubmed ID: 21448875

Hemos generado amplios perfiles de transcripción y proteómica de un modelo de ratón Her2-cia de cáncer de mama que de cerca el cáncer de mama humano recapitula. Este informe hace que estos datos a disposición del público en forma cruda y procesada, como un recurso para la comunidad. Es importante destacar, que previamente hizo bioespecímenes de este mismo modelo de ratón disponibles gratuitamente a través de un repositorio de pruebas, por lo que los investigadores pueden obtener muestras para probar hipótesis biológicas sin la necesidad de los animales de cría y recogida de bioespecímenes.

Una Dirigida Basados ​​en La Proteómica Gasoducto Para La Verificación De Los Biomarcadores En El Plasma

Nature Biotechnology. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21685906

Tecnologías de alto rendimiento ahora se puede identificar cientos de biomarcadores de proteínas candidatos para cualquier enfermedad con relativa facilidad. Sin embargo, porque no hay ensayos para la mayoría de las proteínas y de desarrollo inmunoensayo novo es prohibitivamente caro, biomarcadores pocos candidatos son probados en estudios clínicos. Pusimos a prueba si el resultado analítico de una tubería de la identificación de biomarcadores basados ​​en la espectrometría de masas orientada sería suficiente para los datos que dependen de la priorización de los biomarcadores candidatos, de desarrollo de novo de las pruebas y multiplexado de verificación de biomarcadores. Se utilizó un proceso de clasificación dependiente de los datos para dar prioridad a un subconjunto de los biomarcadores plasmáticos supuestos de> 1.000 candidatos previamente identificados con un modelo de ratón de cáncer de mama. Ochenta y ocho nuevos ensayos cuantitativos basados ​​en la espectrometría de masas de reacción seleccionada monitoreo han sido desarrollados, multiplexado y evaluado en 80 muestras de plasma. Treinta y seis proteínas fueron verificadas como siendo elevada en el plasma de animales portadores de tumores. El rendimiento analítico de este gasoducto sugiere que se debe apoyar el uso de un enfoque similar con muestras humanas.

Enriquecimiento De Inmunoafinidad Péptido Acoplado a Espectrometría De Masas De Péptidos Y Cuantificación De Proteínas

Clinics in Laboratory Medicine. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21907104

Entre Laboratorios De Evaluación De Los Sistemas Automatizados, Multiplexado De Enriquecimiento De Inmunoafinidad Péptido Acoplado a Espectrometría De Masas De Reacción Múltiple De Monitoreo Para La Cuantificación De Proteínas En El Plasma

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22199228

La incapacidad de cuantificar un gran número de proteínas en los tejidos y biofluidos con alta precisión, la sensibilidad y el rendimiento es un cuello de botella importante en los estudios de biomarcadores. Hemos demostrado previamente que el enriquecimiento de acoplamiento de inmunoafinidad con anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) a MRM-EM produce inmuno-GRM ensayos que pueden ser multiplexados para cuantificar las proteínas en el plasma con alta sensibilidad, especificidad y precisión. Aquí se presenta la primera evaluación sistemática del desempeño entre laboratorios de multiplexado (8-plex) inmuno-MRM-MS en tres laboratorios independientes. Un estudio se llevó a cabo por etapas en las que el efecto de cada paso de procesamiento y análisis de ensayo de CV, LD, LC y se evaluó la recuperación. Los límites de detección son iguales o por debajo de 1 ng / ml para las proteínas ensayadas en 30 uL de plasma. Reproducibilidad del ensayo era aceptable para los estudios de verificación, con una mediana de CV intra-e inter-laboratorio sobre el límite de cuantificación del 11% y% <14, respectivamente, para el proceso de ensayo de toda la inmuno-MRM-MS, incluyendo la digestión enzimática de plasma. Digestión con tripsina y su manejo de la muestra necesaria contribuido la variabilidad del ensayo más a reducirse y la recuperación de los péptidos de las proteínas diana digeridos. Usando una proteína isótopo estable etiquetada como un patrón interno en lugar de los péptidos de isótopos estables etiquetados para dar cuenta de las pérdidas en el proceso de digestión duplicado exactitud del análisis de este tiempo que mejora la precisión del ensayo 5%. Nuestros resultados demuestran que multiplexada inmuno-MRM-MS se pueden hacer reproducibles entre laboratorios independientes y tiene el potencial de ser adoptado ampliamente para ensayar las proteínas en matrices tan complejo como el plasma.

Secuencial Del Compuesto Multiplexado Cuantificación Mediante Enriquecimiento Inmunoafinidad Péptido Acoplado a Espectrometría De Masas

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22203691

Enriquecimiento de péptido inmunoafinidad junto a la supervisión de reacción seleccionada (SRM) espectrometría de masas (inmuno-SRM) ha emergido como una tecnología con gran potencial para los ensayos cuantitativos proteómicos. Una ventaja más de inmunoensayos tradicionales es el enorme potencial para la cuantificación simultánea de múltiples analitos de una muestra dada (es decir, el análisis multiplex). Hemos tratado de explorar la capacidad de la técnica de inmuno-SRM para analizar un gran número de analitos mediante la evaluación de las capacidades de múltiplex y demostrar el análisis secuencial de los grupos de péptidos a partir de una sola muestra. Para evaluar el análisis multiplex, inmuno-ensayos de SRM se organizaron en grupos de 10, 20, 30, 40, 50 y péptidos utilizando un conjunto común de los reactivos. Los multiplex inmuno-SRM ensayos se utilizaron para medir péptidos sintéticos añadidos al plasma que abarcan varios órdenes de magnitud de concentración. Las mediciones realizadas en grupos grandes multicines están altamente correlacionados (R2 ≥ 0,98) y contó con un buen acuerdo (sesgo de ≤ 1%) en comparación con los ensayos de complejos individuales o una configuración de 10-Plex. La capacidad para enriquecer secuencialmente conjuntos de péptidos de analito se demostró mediante el enriquecimiento grupos de 10 péptidos a partir de una muestra de plasma de una manera secuencial. Los datos muestran un buen acuerdo (sesgo de ≤ 1,5%) y la reproducibilidad similar, con independencia del orden de enriquecimiento. Estos avances significativos demostrar la utilidad de inmuno-SRM para analizar un gran número de analitos, tales como en grandes experimentos biomarcadores de verificación o en vía de análisis basado en blanco.