Translate this page to:
Spanish
In JoVE (1)
Other Publications (32)
- Genome Biology
- Nature
- Nucleic Acids Research
- Nature
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
- Nature
- Nature
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
- Nature Biotechnology
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
- Methods (San Diego, Calif.)
- Genome Biology
- Science (New York, N.Y.)
- Genome Biology
- PLoS Biology
- Nature Methods
- Genome Research
- Nature Biotechnology
- Current Protocols in Human Genetics / Editorial Board, Jonathan L. Haines ... [et Al.]
- Nature Methods
- Genome Biology
- Nature Biotechnology
- Nature Biotechnology
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
- Cell Stem Cell
- Cell
- Genome Biology
- Nature Protocols
- Nature Biotechnology
- Nature Biotechnology
- Genome Biology
- PLoS Genetics
Automatic Translation
This translation into Spanish was automatically generated.
English Version | Other Languages
Articles by Andreas Gnirke in JoVE
JoVE General
Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.
1Program in Gene Function and Expression, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Broad Institute of Harvard and Massachusetts Institute of Technology, 3Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 4Program for Evolutionary Dynamics, Department of Organismic and Evolutionary Biology, Department of Mathematics, Harvard University, 5Department of Applied Mathematics, Harvard University, 6Department of Physics, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 8Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology
El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.
Other articles by Andreas Gnirke on PubMed
Evaluar El Impacto De Los Datos De La Secuencia Genómica Comparativa En La Anotación Funcional Del Genoma De Drosophila
Está ampliamente aceptado que los datos comparativos de la secuencia pueden ayudar la anotación funcional de las secuencias del genoma; sin embargo, las especies y características de la evolución del genoma para la comparación más informativo permanecen para determinarse.
Secuencia De ADN Y Análisis Del Cromosoma Humano 18
Cromosoma 18 parece tener la menor densidad de genes de cualquier cromosoma humano y es uno de los tres cromosomas para que los individuos con trisomía sobreviven a largo plazo. Hay también un número de trastornos genéticos derivados de la trisomía del cromosoma 18 y aneuploidía. Aquí mostramos la secuencia terminada y anotación de genes del cromosoma humano 18, lo que permitirá una mejor comprensión de la biología normal y la enfermedad de este cromosoma. A pesar de la baja densidad de genes codificadores de proteínas en el cromosoma 18, encontramos que la proporción de no codificantes de proteínas de secuencias conservadas evolutivamente entre los mamíferos se encuentra cerca de la media de todo el genoma. La extensión de este análisis a todo el genoma humano, nos encontramos con que la densidad de conserva no codificadores de proteínas secuencias es en gran medida no correlacionada con la densidad de genes. Esto tiene implicaciones importantes para la naturaleza y funciones de las que no codifican para proteínas elementos de la secuencia.
Bisulfito De Representación Reducida De Secuenciación Comparativa De Alta Resolución El Análisis De Metilación Del ADN
Se describe un método aleatorio a gran escala denominado secuenciación de bisulfito de reducir la representación (RRB) para analizar y comparar los patrones de metilación del genoma. Fragmentos de restricción se BglII-tamaño seleccionado a 500-600 pb, equipados con adaptadores, tratados con bisulfito, amplificado por PCR, clonado y secuenciado. Hemos construido bibliotecas RRB de células madre embrionarias de ratón y de células madre embrionarias que carecen de ADN metiltransferasas Dnmt3a y 3b y desmontado (kd) de los niveles de Dnmt1 (Dnmt [1 (kd), 3a-/ -, 3b-/ -]). La secuenciación de 960 clones de RRB de Dnmt [1 (kd), 3a-/ -, 3b-/ - Las células generado 343 kb de la secuencia de bisulfito no redundante que cubre 66212 citosinas en el genoma. Todas las citosinas 38 pero se había convertido a uracilo que indica una tasa de conversión de> 99,9%. De los restantes 35 citosinas se encontraron en CpG y 3 en dinucleótidos CPT. No CpG metilación era> 250 veces más reducido en comparación con las células madre embrionarias de tipo silvestre, en consonancia con el papel de Dnmt3a y / o Dnmt3b en la CPA y la metilación del CPT. Una inspección más cercana reveló ni una secuencia de consenso alrededor de los sitios metilados ni pruebas para la agrupación de metilación en el genoma residual. Nuestros hallazgos indican que la pérdida de azar en lugar de mantenimiento específico de la metilación en Dnmt [1 (kd), 3a-/ -, 3b-/ - Las células. Cercanos a la completa conversión de bisulfito y en gran medida la representación objetiva de las bibliotecas RRB sugieren que la secuenciación aleatoria bisulfito de escopeta se puede escalar a un enfoque de todo el genoma.
Penetraciones Desde El Genoma De Los Hongos De Foliares De La Planta Patógeno Ustilago Maydis
Ustilago maydis es un patógeno ubicuo de maíz y un organismo modelo establecido para el estudio de las interacciones planta-microorganismo. Este hongo basidiomicetos no utiliza estrategias agresivas de virulencia para matar a su anfitrión. U. maydis pertenece al grupo de parásitos foliares (los carbones) que dependen de tejido vivo para la proliferación y el desarrollo. Presentamos la secuencia del genoma de un miembro de este grupo económicamente importante de hongos foliares. La Asamblea de 20,5 millones-base U. maydis genoma contiene genes de proteínas-codificación previstos 6.902 y carece de firmas de patogenicidad encontradas los genomas de hongos patógenos agresivos, por ejemplo, una batería de enzimas degradadoras de pared celular. Sin embargo, detectamos inesperadas características genómicas responsables de la patogenicidad de este microorganismo. En concreto, nos encontramos con 12 grupos de genes que codifican proteínas de secreción pequeño con función desconocida. Una fracción significativa de estos genes existe en familias génicas pequeño. Análisis de la expresión demostraron que la mayoría de los genes contenidos en estos grupos está regulada juntos e inducen en el tejido infectado. Eliminación de racimos individuales había alterado la virulencia de la U. maydis en cinco casos, que van desde una completa falta de síntomas a HIPERVIRULENCIA. A pesar de años de investigación sobre el mecanismo de patogenicidad en U. maydis, factores de virulencia 'verdadero' no habían sido identificados previamente. Así, el descubrimiento de los clusters de gene de la proteína secretada y la demostración funcional de su papel decisivo en el proceso de infección iluminar desconocidos mecanismos de patogenicidad en hongos foliares. Análisis genómico son, asimismo, capaces de abrir nuevos caminos para el descubrimiento de determinantes de virulencia en otros patógenos.
Descubrimiento Sistemático De Los Motivos De Reglamentación En Las Regiones Conservadas Del Genoma Humano, Incluyendo Miles De Sitios De Aisladores CTCF
Conserva elementos no codificantes (CNES) constituyen la mayoría de las secuencias en la purificación de selección en el genoma humano, pero su función sigue siendo desconocida. La evidencia experimental sugiere que muchos de estos elementos desempeñan funciones de regulación, pero poco se sabe acerca de los motivos de reglamentación que contienen. Aquí se describe un método sistemático para descubrir y caracterizar los motivos de reglamentación dentro de los mamíferos CNE mediante la búsqueda de motivos largos (12-22 nt) con un enriquecimiento significativo en el CNES y el estudio de sus propiedades bioquímicas y genómicas. Nuestro análisis identifica 233 motivos largos (LMS), coincide con un total de aproximadamente 60.000 casos conservados a través del genoma humano. Estos motivos son ya conocidos 16 elementos de regulación, tales como la histona 3'-UTR motivo y el elemento silenciador de las neuronas de restricción, así como ejemplos llamativos de nuevos elementos funcionales. El motivo más altamente enriquecido (LM1) corresponde al motivo de X-caja conocida de la levadura y el nematodo. Se demuestra que está obligado por la proteína RFX1 e identificar miles de casos motivo conservado, lo que sugiere un amplio papel de la familia RFX en la regulación génica. Un segundo grupo de motivos (LM2 *) no coincide con ningún motivo conocido previamente. Se demuestra por métodos bioquímicos y de cálculo que se define un sitio de unión para la proteína CTCF, que participa en la función de aislante para limitar la propagación de la activación de genes. Nos identificamos cerca de 15.000 sitios conservados que probablemente sirven como aislantes, y nos muestran que los genes cercanos, separados por los sitios previstos CTCF muestran reduce notablemente la correlación de la expresión génica. Estos sitios por lo tanto hacer una partición del genoma humano en los dominios de expresión.
El Genoma De La Modelo Escarabajo Y Plagas Tribolium Castaneum
Tribolium castaneum es miembro de la orden de eucariota más ricos en especies, un organismo poderoso modelo para el estudio de insectos generalizados del desarrollo y una plaga importante de productos agrícolas almacenados. Describimos aquí su secuencia de genoma. Este escarabajo omnívoro ha evolucionado la capacidad de interactuar con un entorno diverso de la químico, como se muestra por grandes expansiones en olfativa y gustativos receptores, así como P450 y otras enzimas de desintoxicación. Desarrollo en Tribolium es más representativo de otros insectos que es Drosophila, un hecho que se refleja en gen contenido y función. Por ejemplo, Tribolium ha conservado más ancestrales genes implicados en la comunicación de la célula de Drosophila, algunos se expresa en la zona de crecimiento crucial para el alargamiento axial en desarrollo corto-germen. ARN de interferencia sistémica en T. castaneum funciona diferentemente de eso en Caenorhabditis elegans, pero sin embargo ofrece una potencia similar para la aclaración de funciones de los genes y la identificación de dianas para control de insectos selectiva.
Mapas a Escala Del Genoma De Metilación Del ADN De Células Pluripotentes Y Diferenciado
Metilación del ADN es esencial para el desarrollo normal y ha sido implicada en muchas patologías incluyendo el cáncer. Nuestro conocimiento acerca de la distribución en todo el genoma de la metilación del ADN, cómo cambia durante la diferenciación celular y cómo se relaciona con la metilación de histonas y otras modificaciones de la cromatina en los mamíferos sigue siendo limitada. Aquí mostramos la generación y análisis de los perfiles a escala del genoma de metilación del ADN en la resolución de nucleótidos en células de mamífero. Uso de secuenciación de alto rendimiento reducido de bisulfito de la representación y la secuenciación de una sola molécula base, se generaron mapas de metilación del ADN que cubren la mayoría de las islas CpG, y una muestra representativa de conserva elementos no codificantes, transposones y otras características genómicas, para las células madre embrionarias de ratón, las embrionarias -con células madre derivadas de células neurales y primaria, y ocho otros tejidos primarios. Varias conclusiones principales emergen de los datos. En primer lugar, los patrones de metilación del ADN se correlacionan mejor con los patrones de metilación de histonas que con el contexto de secuencia del genoma subyacente. Metilación En segundo lugar, de CpGs son dinámicas marcas epigenéticas que se someten a grandes cambios durante la diferenciación celular, en particular en las regiones reguladoras fuera de los promotores fundamentales. Tercero, el análisis de las células madre embrionarias derivadas de células y primaria revela que 'débiles' las islas CpG asociadas a un conjunto específico de genes regulados de desarrollo sufren hipermetilación aberrante durante la proliferación prolongada in vitro, en una reminiscencia patrón de lo reportado en algunos tumores primarios . En términos más generales, los resultados de bisulfito de establecer una representación reducida de secuenciación como una tecnología de gran alcance para el perfil epigenético de las poblaciones celulares de interés para la biología del desarrollo, el cáncer y la medicina regenerativa.
El Efecto Materno, Elemento Genético Egoísta Medea Está Asociado Con Un Transposón Compuesto De Tc1
Factores maternos-efecto dominante embrionario arresto ("Medea") son elementos nucleares egoístas que combinan actividades maternales letales y cigóticos rescate para obtener una ventaja de supervivencia postzygotic. Mostramos que Medea(1) actividad en Tribolium castaneum se asocia con un transposón compuesto de Tc1 insertado justo aguas abajo de la symporter de recaptación del neurotransmisor hinchado túbulos (blot), cuya ortólogo de Drosophila tiene funciones maternales y cigóticas. La inserción de 21.5 kb contiene copias defectuosas de alargamiento factor de iniciación-3, ATP synthase subunidad C y un gen relacionado con el RNaseD, así como una copia potencialmente intacta de un gen DUF1703 procariota. Las comparaciones de la secuencia indican que la actual distribución de Medea(1) refleja la emanación global después de un solo evento transposicional en el tiempo evolutivo reciente. El sistema de Medea en Tribolium representa un tipo inusual de conflicto intragenómico y podría proporcionar un medio útil para la conducción de genes deseables en las poblaciones.
Solución Híbrida De Selección Con Ultra-largas Oligonucleótidos Para La Secuenciación Masiva En Paralelo Dirigida
Orientación loci del genoma por la secuenciación masiva en paralelo requiere nuevos métodos para enriquecer las plantillas para ser secuenciados. Hemos desarrollado un método de captura que utiliza biotina ARN 'cebos para pescar de los objetivos de una' laguna 'de fragmentos de ADN. El ARN se transcribe a partir de la PCR-amplificación oligodesoxinucleótidos inicialmente sintetizados en un microarray, generando cebo suficiente para múltiples capturas en concentraciones lo suficientemente altas como para conducir la hibridación. Hemos probado este método con 170-mer cebos que se dirigen a los exones de codificación de 15.000 (2,5 Mb) y cuatro regiones (1,7 MB en total) utilizando la secuenciación de Illumina, como lectura. Alrededor del 90% de las bases única alineación cayó en o cerca de la secuencia de cebo, hasta un 50% estaba en los exones correspondientes. La uniformidad es tal que aproximadamente el 60% de las bases de destino en el exonic 'captura', y aproximadamente el 80% de la captura regional, tuvo al menos la mitad de la cobertura media. Uno de los carriles de la secuencia de Illumina fue suficiente para llamar a los genotipos de alta confianza del 89% del espacio de exón.
Ab Initio Construcción De Un Eucariota Transcriptoma Por Masivamente Paralelo Secuencia De MRNA
Definir el transcriptoma, el repertorio de transcritos regiones codificadas en el genoma, es una difícil tarea experimental. Los enfoques actuales, basándose en la secuencia de tecnologías ecológicamente racionales o bibliotecas de cDNA, son costosos y que requieren mucho trabajo. Aquí, presentamos un enfoque general para descubrimiento del transcriptoma completa del florecimiento levadura ab initio, basado solamente en la secuencia del genoma de unannotated y ejecutan millones de lecturas cortas de una sola secuencia masivamente paralelo. Utilizando nuevos algoritmos, construimos automáticamente un catálogo de alta precisión de la transcripción. Nuestro enfoque automáticamente y totalmente define el 86% de los genes expresados bajo las condiciones dadas y descubre 160 previamente no descritas unidades de transcripción de 250 bp o más. Correctamente delimita el 5' y 3' límites UTR del 86 y el 77% de genes expresados, respectivamente. El método identifica el 83% de empalme conocido ensambladuras en genes expresados y descubre 25 intrones previamente desacostumbradas, incluyendo 2 casos de retención de la condición dependiente del intrón. Nuestro marco es aplicable a organismos mal entendidos y puede conducir a una mayor comprensión de los elementos transcritos en un genoma explorado.
Secuenciación De Alto Rendimiento Bisulfito En Genomas Mamíferos
Metilación del ADN es una crítica marca epigenética que es esencial para el desarrollo mamífero y aberrante en muchas enfermedades, incluyendo cáncer. En la última década varios métodos se han desarrollado y aplicado para caracterizar la distribución de su genoma. De estos, secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS) genera nucleótido resolución ADN metilación bisulfito secuenciación bibliotecas que enriquecen para regiones CpG-denso por digestión de metilación-insensible de la restricción. Aquí proporcionamos un protocolo extenso, optimizado para la generación de bibliotecas RRBS y discutir el poder de esta estrategia para perfilar metiloma. Incluimos información sobre análisis de la secuencia y la cobertura relativa sobre regiones genómicas de interés para un ratón representante MspI generado biblioteca RRBS. Secuenciación contemporáneo y tecnologías basadas en la matriz se comparan con producción de muestras y la cobertura, destacando la variedad de opciones disponibles para investigar la metilación del genoma-escala.
ALLPATHS 2: Pequeños Genomas Montada Con Precisión Y Alta Continuidad Corto Lee Emparejados
Demostramos que genoma calidad acabado que puede generarse a partir de secuencias cortas lecturas emparejadas. Usando 36 base (fragmento) y base de 26 (saltar) lee de cinco genomas microbianos de variada composición de GC y tamaños de hasta 40 Mb, ALLPATHS2 genera ensamblados con largos y precisos contigs y andamios. Terciopelo y EULER-SR eran menos precisos. Por ejemplo, Escherichia coli, la fracción de tramos de 10 kb que eran perfectos fue 99.8% (ALLPATHS2), 68.7% (terciopelo) y 42.1% (EULER-SR).
Elaboración De Mapas Detallados De Las Interacciones De Largo Alcance Revela Principios De Plegado Del Genoma Humano
Se describe Hi-C, un método que las sondas de la arquitectura tridimensional de todo el genoma mediante el acoplamiento basado en la proximidad con la ligadura de secuenciación masiva en paralelo. Hemos construido los mapas espaciales de proximidad del genoma humano con Hi-C, a una resolución de 1 megabase. Estos mapas confirmar la presencia de los territorios cromosómicos y la proximidad espacial de pequeñas gen ricos en cromosomas. Se identificaron un nivel adicional de organización del genoma que se caracteriza por la segregación espacial de la cromatina abierta y cerrada para formar dos compartimentos en todo el genoma. En la escala megabase, la conformación de la cromatina es consistente con un glóbulo fractal, un nudo-libre, conformación polímero que permite el envasado máximamente densa preservando al mismo tiempo la capacidad de plegar y desplegar fácilmente cualquier locus genómico. El glóbulo fractal es distinto del modelo de equilibrio más comúnmente utilizado globular. Nuestros resultados demuestran el poder de Hi-C para mapear las conformaciones dinámicas de genomas completos.
Dirigida La Secuencia Next-generation De Un Cáncer Transcriptoma Mejora La Detección De Variantes De La Secuencia Y Transcripciones De La Fusión De Novela
Los RNA-Seq combina secuenciación de nueva generación con la captura de secuencias de un subconjunto relevante de un transcriptoma. Cuando prueba por capturar secuencias de una biblioteca de cDNA de tumor por hibridación de oligonucleótidos sondas específicas para 467 genes relacionados con el cáncer, este método demostró alta selectividad, mejoró la detección de la mutación que permite el descubrimiento de novela transcripciones quiméricas y proporcionaron datos de expresión de RNA. Así, los RNA-Seq produce una vista mejorada del estado molecular de un conjunto de genes de "gran interés".
ZBED6, Un Nuevo Factor De Transcripción Derivado De Un Transposón ADN Domesticado Regula La Expresión IGF2 Y El Crecimiento Muscular
Una única sustitución de nucleótidos en el intrón 3 de IGF2 en cerdos abroga un sitio de unión para un represor y conduce a un 3-veces sobre regulación de IGF2 en el músculo esquelético. La mutación tiene efectos importantes sobre el crecimiento muscular, tamaño del corazón, y la deposición de grasa. En este caso, hemos identificado el represor y encontrar que la proteína, llamada ZBED6, es hasta ahora desconocido, específico para los mamíferos placentarios, y derivado de un transposón ADN exaptadas. Silencios de ZBED6 de ratón C2C12 mioblastos afectados Igf2 expresión, la proliferación celular, la cicatrización de heridas, y la formación de miotubos. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) secuenciación utilizando células C2C12 identificados a unos 2.500 ZBED6 sitios de unión en el genoma, y el consenso motivo deducido dio una combinación perfecta con el sitio establecido obligatorio en Igf2. Genes asociados con sitios de unión ZBED6 mostró un enriquecimiento muy importante para ciertas clasificaciones de ontología de genes, incluyendo el desarrollo y la regulación transcripcional. Los efectos fenotípicos de los cerdos mutantes y ZBED6 los silenciados mioblastos C2C12, la conservación de la secuencia extrema, su localización nucleolar, la amplia distribución en los tejidos y los genes diana con muchas funciones biológicas esenciales sugieren que ZBED6 es un importante factor de transcripción en los mamíferos placentarios, que afectan el desarrollo , la proliferación celular, y el crecimiento.
Genoma Escala Para Secuenciar El ADN De Metilación De Las Muestras Clínicas De Un Solo Nucleótido Resolución
Secuenciación de bisulfito de las medidas de los niveles absolutos de la metilación del ADN en la resolución de un solo nucleótido, proporcionando una plataforma sólida para el diagnóstico molecular. Hemos optimizado la secuencia de bisulfito para el análisis del genoma escala de muestras clínicas: aquí se describen cómo la digestión de restricción apunta a la secuenciación de bisulfito a los hotspots de la regulación epigenética y describir un método estadístico para evaluar la significación de la alteración de los patrones de metilación del ADN. Treinta nanogramos de ADN era suficiente para el análisis del genoma de la escala y el protocolo ha funcionado bien el fijado en formol, embebidos en parafina de muestras.
Análisis Integral Del Transcriptoma Melanoma
Los estudios mundiales de la estructura de la transcripción y la abundancia en las células cancerosas permitir el descubrimiento sistemático de las aberraciones que contribuyen a la carcinogénesis, incluyendo fusiones de genes, isoformas de empalme alternativos, y las mutaciones somáticas. Hemos desarrollado un enfoque sistemático para caracterizar el espectro de alteraciones de mRNA de cáncer asociados a través de la integración de datos genómicos transcriptomic y estructurales, y aplicar este enfoque para generar nuevos conocimientos sobre la biología del melanoma. Usando emparejado extremo masivamente paralela secuenciación de ADNc (ARN-ss), junto con los análisis de datos de alta resolución número de copias cromosómicas, hemos identificado 11 nuevas fusiones de genes melanoma producidos por subyacente reordenamientos genómicos, así como 12 transcripciones readthrough novedosas. La cartografia transcripciones quiméricos de la resolución de pares de bases y trazó a sus orígenes genómicas utilizando coincide la información cromosómica número de copias. También utilizamos estos datos para descubrir y validar los pares de bases-las mutaciones que se acumulan en estos melanomas, revelando una elevada tasa de mutación somática y la prestación de apoyo a la idea de que las mutaciones puntuales constituyen el principal motor de la progresión del melanoma. En conjunto, estos resultados pueden indicar nuevas vías para el descubrimiento de destino en el melanoma, mientras que también proporciona una plantilla para estudios a gran escala transcriptome a través de muchos tipos de tumores.
Reconstrucción Ab Initio De Tipo De Células Específicas Transcriptomes En Ratones Revelan La Conserva Multi-exonic Estructura De LincRNAs
Secuenciación masiva en paralelo ADNc (RNA-Seq) ofrece una forma objetiva para estudiar un transcriptoma, incluyendo tanto la codificación y los genes codificantes. Hasta ahora, la mayoría de los RNA-Seq estudios han dependido fundamentalmente de las anotaciones existentes y por lo tanto se centró en los niveles de expresión y la variación en las transcripciones conocidas. A continuación, presentamos las Escrituras, un método para reconstruir el transcriptoma de una célula de mamífero utilizando sólo RNA-Seq lee y la secuencia del genoma. Lo aplicamos a las células madre embrionarias de ratón, células precursoras neuronales y los fibroblastos de pulmón de reconstruir con precisión las estructuras de genes de longitud completa de los genes expresados más conocidos. Se identificaron una variación sustancial en los genes codificantes de proteínas, incluyendo a miles de nuevos "sitios de inicio, 3 extremos 5 'y exones de codificación interna. A continuación, determinará las estructuras genéticas de más de un millar de grandes intergénica no codificante del ARN (lincRNA) y loci antisentido. Nuestros resultados abren el camino para dirigir la manipulación experimental de miles de ARN no codificantes y demostrar el poder de la reconstrucción desde un principio para hacer una imagen completa de mamíferos transcriptomes.
Concentrado En La Secuencia Del Exón Por Selección En Solución Híbrida
Esta unidad describe un protocolo para el enriquecimiento específico de exones de bibliotecas de ADN genómicos esquilados al azar utilizando un enfoque de selección en solución híbrida para la secuenciación de un genoma de Illumina Analyzer II. Se repasan los pasos para diseñar y ordenar un grupo de oligo selección de híbridos, como son pasos críticos para llevar a cabo la preparación y selección de híbridos de una biblioteca de emparejado-end Illumina. Se discuten los parámetros críticos, métricas de desempeño y flujo de trabajo de análisis.
Integral Análisis Comparativo De Los Métodos De Secuenciación De RNA De Filamento Específicos
Strand específicos, masivamente paralelo cDNA secuenciación (RNA-seq) es una poderosa herramienta para el descubrimiento de transcripción, la anotación del genoma y el perfil de expresión. Existen múltiples métodos publicados para específicos strand RNA-seq, pero no existe ningún consenso en cuanto a cómo elegir entre ellos. Aquí desarrollamos un oleoducto computacional integral para comparar mediciones de calidad de biblioteca de cualquier método de RNA-seq. Usando el well-annotated Saccharomyces cerevisiae transcriptoma como punto de referencia, comparamos siete de biblioteca-construcción protocolos, incluyendo ambos publicados y nuestros propios métodos. Encontramos marcadas diferencias en la especificidad del filamento, complejidad de la biblioteca, uniformidad y continuidad de cobertura, de acuerdo con anotaciones conocidas y precisión para el perfilado de la expresión. Rendimiento y facilidad de cada método de pesaje, identificamos la marca de la segunda cadena de dUTP y los métodos de ligadura Illumina RNA como los principales protocolos, con el anterior aprovechando la disponibilidad actual de la secuencia final emparejado. Nuestro análisis proporciona una referencia completa, y nuestra línea de tubería computacional es aplicable para la evaluación de protocolos futuros en otros organismos.
La Secuencia De RNA Específicas Strand Revela Amplias Transcripciones Largo Antisentidas Reguladas Que Se Conservan En Toda Especie De Levadura
Estudios recientes en levadura de florecimiento han demostrado que la transcripción antisentido se produce en muchos lugares geométricos. Sin embargo, el papel funcional de las transcripciones antisentidos se ha demostrado sólo en algunos casos y se ha sugerido que más antisentidas transcripciones pueden resultar de promiscuo transcripción bidireccional de un genoma denso.
Comparación Cuantitativa De Las Tecnologías De Mapeo De Metilación De ADN De Todo El Genoma
Metilación del ADN desempeña un papel clave en la regulación de la expresión de genes eucariotas. Aunque mitotically heredable y estable con el tiempo, los patrones de metilación del ADN cambian con frecuencia en respuesta a la diferenciación celular, las enfermedades y las influencias ambientales. Han desarrollado varios métodos para asignar la metilación del ADN en una escala genómica. Aquí, nosotros cuatro de estos enfoques benchmark analizando dos líneas de células madre embrionarias derivadas de embriones genéticamente sin relación y un par emparejado del tumor de colon y del colon normal adyacente tejido obtenido del mismo donante. Nuestro análisis revela que metilado inmunoprecipitación secuenciación del ADN (MeDIP-seq), captura de ADN metilado por purificación de afinidad (MethylCap-seq), redujo la secuencia de bisulfito de representación (RRBS) y el ensayo de Infinium HumanMethylation27 todos producen datos precisos de metilación de ADN. Sin embargo, estos métodos se diferencian en su capacidad para detectar regiones metiladas diferencialmente entre pares de muestras. Nos resalte las fortalezas y debilidades de los cuatro métodos y dar recomendaciones prácticas para el diseño de epigenómica estudios caso-control.
Comparación De Métodos Basados En La Secuencia a La Metilación Del ADN Del Perfil Y La Identificación De Las Modificaciones Epigenéticas Monoallelic
Análisis de los patrones de metilación de ADN depende cada vez más perfiladoras los métodos basados en la secuencia. Las cuatro tecnologías basadas en la secuencia más utilizadas son los métodos basados en bisulfito MethylC-seq y secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS) y la secuencia de inmunoprecipitación de la DNA de técnicas basadas en el enriquecimiento metiladas (MeDIP-seq) y secuenciación del dominio de unión de ADN metilado (MBD-seq). Aplicamos los cuatro métodos biológicos réplicas de células madre embrionarias humanas para evaluar su cobertura de CpG del genoma, resolución, costo, concordancia y la influencia de la densidad de CpG y contexto genómica. Los niveles de metilación, evaluados por los dos métodos de bisulfito eran concordantes (su diferencia no excedía a un determinado umbral) 82% para GPC y el 99% de los cytosines no-CpG. Mediante llamadas de metilación binario, los dos métodos de enriquecimiento eran 99% concordante y regiones evaluadas por los cuatro métodos eran concordantes de 97%. Combinamos MeDIP-seq con la secuencia de la enzima de la restricción de metilación-sensible (MRE-seq) para metiloma completa cobertura a menor costo. Esto, junto con el RNA-seq y ChIP-seq de las células madre embrionarias nos permitió detectar regiones con Estados epigenéticos alelo-específica, identificar la mayoría de regiones conocidas impresas y nuevos lugares geométricos con marcas epigenéticas monoallelic y expresión monoallelic.
De Alta Calidad Asambleas Proyecto De Los Genomas De Mamíferos a Partir De Datos De Secuencia Masivamente Paralelos
Masivamente paralelos tecnologías de secuenciación de ADN están revolucionando la genómica por lo que es posible generar miles de millones de relativamente corto (~ 100-base) secuencia se lee a muy bajo costo. Mientras que estos datos pueden ser fácilmente utilizada para una amplia gama de aplicaciones biomédicas, se ha demostrado que es difícil de usar para generar alta calidad De las asambleas del genoma de novo de los genomas de vertebrados grandes y ricos de repetición. Hasta la fecha, las asambleas del genoma generados a partir de estos datos están muy por debajo de los obtenidos con la antigua (pero mucho más caro) capilar enfoque basado en la secuenciación. Aquí, se presenta el desarrollo de un algoritmo para el genoma de montaje, ALLPATHS LG-, y su aplicación en paralelo de forma masiva los datos de la secuencia del ADN de los genomas humano y del ratón, generadas en la plataforma Illumina. Los conjuntos de los proyectos resultantes del genoma tiene una buena precisión, la contigüidad de corto alcance, conectividad de largo alcance, y la cobertura del genoma. En particular, la precisión de base es alta (≥ 99,95%) y el tamaño de andamio (N50 tamaño = 11.5 Mb para Mb humanos y 7,2 para ratón) enfoque los obtenidos con capilar basada en la secuencia. La combinación de la tecnología de secuenciación mejorada y la mejora de los métodos de cálculo ahora debe hacer posible que aumenten sustancialmente la secuenciación de novo de grandes genomas. El programa ALLPATHS-LG está disponible en http://www.broadinstitute.org/science/programs/genome-biology/crd.
Reprogramación De La Expresión Del Factor Inicia La Remodelación De La Cromatina Dirigida Generalizada
A pesar del rápido progreso en la caracterización de la reprogramación de células somáticas a un estado de la célula de vástago (iPSC) pluripotentes inducidas impulsado por el factor de transcripción, siguen siendo muchas preguntas mecanicistas. Para profundizar en los acontecimientos más tempranos en el proceso de reprogramación, analizamos sistemáticamente los cambios transcripcionales y epigenéticos que ocurren durante la inducción temprana de factor después de números discretos de divisiones. Observamos cambios rápidos, todo el genoma en la modificación de histonas euchromatic, H3K4me2, en más de 1 mil lugares geométricos incluyendo grandes subconjuntos de promotores de genes relacionados con la pluripotencia o desarrollo regulado y potenciadores. Por el contrario, patrones de la modificación de H3K27me3 represivo permanecieron prácticamente sin cambios salvo agotamiento centrado específicamente en las posiciones donde se gana H3K4 metilación. Estos eventos regulatorios de cromatina preceden transcripcionales cambios dentro de los loci correspondientes. Nuestros datos demuestran una respuesta epigenéticos temprano, organizada y toda la población a factores de reprogramación ectópicos que clarificar el orden temporal a través del cual se restablece la identidad somática durante la reprogramación.
Mapas De Referencia De ES Derechos Humanos Y De La Variación De Células IPS Habilitar Alto Rendimiento Caracterización De Líneas Celulares Pluripotentes
El potencial de desarrollo de las células madre pluripotentes sugiere que pueden producir enfermedades relevantes para los tipos de células para la investigación biomédica. Sin embargo, la variación sustancial se ha informado entre las líneas celulares pluripotentes, que podrían afectar a su utilidad y seguridad clínica. Estas células-line específicas de las diferencias deben ser mejor entendidas antes de que se pueda utilizar células madre embrionarias (ES) o células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células en la investigación traslacional. Con este objetivo hemos establecido en todo el genoma de referencia de los mapas de la metilación del ADN y la expresión génica durante 20 previamente derivadas líneas embrionarias humanas y 12 líneas de células humanas iPS, y hemos medido la tendencia en la diferenciación in vitro de estas líneas celulares. Este recurso nos permite apreciar la similitud y la epigenética de la transcripción de la ES y las células iPS y para predecir la eficacia de la diferenciación de líneas celulares individuales. La combinación de los ensayos se obtiene un cuadro de mando para la caracterización rápida y completa de las líneas celulares pluripotentes.
Analizar Y Minimizar El Sesgo De Amplificación PCR En Bibliotecas De Secuenciación Illumina
A pesar de la creciente salida de datos de secuenciación Illumina, loci con extremas composiciones de base son a menudo subrepresentados o ausentes. Para evaluar fuentes de sesgo de base-composición, nos remonta a secuencias genómicas entre 6% y 90% GC a través del proceso por PCR cuantitativa. Se identificaron PCR durante la preparación de la biblioteca como principal fuente de sesgo y optimizan las condiciones. Nuestro protocolo mejorado significativamente reduce el sesgo de la amplificación y minimiza los efectos anteriormente graves de tasa de rampa de instrumento y temperatura de polimerización en cadena.
Preparación De Quimiotecas De Secuenciación De Bisulfito De Representación Reducida Para Perfiles De Metilación De ADN De Genoma-escala
Mapeo del genoma de la 5-METILCITOSINA es de gran interés para muchos campos de la biología y la medicina. Se han desarrollado una variedad de métodos, y recientemente varios han aducido a escala de todo el genoma usando matrices y enfoques de secuenciación de última generación. Hemos divulgado previamente la secuencia de bisulfito representación reducida (RRBS), un protocolo basado en bisulfito que enriquece piezas CG-ricos del genoma, reduciendo así la cantidad de secuencia necesaria mientras captura a la mayoría de los promotores y otras regiones genómicas relevantes. El enfoque proporciona resolución de nucleótido, es muy sensible y proporciona mediciones cuantitativas de metilación de ADN. Este protocolo debe permitir cualquier laboratorio estándar de biología molecular generar bibliotecas RRBS de alta calidad. Brevemente, el ADN genómico purificado es digerido por la metilación-insensible enzima de restricción MspI generar fragmentos cortos que contienen dinucleótidos CpG en los extremos. Después de final-reparación, A-tizón y ligadura metilado Illumina adaptadores, los fragmentos de ADN CpG-ricos (40-220 bp) tamaño seleccionado, sometidos a conversión de bisulfito, PCR amplificado y final ordenados en un analizador de genoma Illumina. Tenga en cuenta que la alineación y análisis de la secuencia de RRBS Lee no están cubiertos en el presente Protocolo. Los requisitos de entrada muy bajos (10-300 ng), la aplicabilidad del protocolo muestras fijados con formol y parafina y resolución de nucleótido de la técnica extiende de RRBS a una amplia gama de muestras biológicas y clínicas y aplicaciones de investigación. Todo el proceso de construcción de biblioteca RRBS toma d ∼9.
Etiquetado Metabólico Del ARN Destapa Principios De Dinámica De La Producción Y La Degradación Del RNA En Células De Mamíferos
Los niveles de ARN celulares están determinados por la interacción de la producción de RNA, transformación y degradación. Sin embargo, porque la mayoría de los estudios de regulación de la RNA no distinguen las contribuciones separadas de estos procesos, poco se sabe sobre cómo se integran temporal. Aquí combinamos etiquetado metabólico del ARN en alta resolución temporal con cuantificación de RNA avanzada y modelado computacional para estimar tasas de degradación y transcripción de RNA durante la respuesta de células dendríticas a lipopolisacárido. Encontramos que los cambios en las tasas de transcripción determinan la mayoría de los cambios temporales en los niveles de ARN, pero que los cambios en las tasas de degradación son importantes para formar respuestas 'pico' agudo. Se utilizó la secuencia de la población de RNA recién transcrita para estimar temporal constante transformación y degradación tarifas genoma ARN amplia. Las tasas de degradación varían significativamente entre genes y contribuyen a las diferencias observadas en la respuesta dinámica. Algunas transcripciones, incluyendo aquellas codificación citoquinas y factores de transcripción, maduran más rápido. Nuestro estudio proporciona un enfoque cuantitativo para estudiar el proceso integrador de regulación de RNA.
Conjunto De Larga Duración Transcriptoma Del RNA-Seq Datos Sin Un Genoma De Referencia
Secuenciación masiva y en paralelo del cDNA ha permitido sondeo profundo y eficaz de transcriptomas. Enfoques actuales para la reconstrucción de la transcripción de los datos a menudo dependen de alinear a Lee a un genoma de referencia y así no son adecuados para las muestras con un genoma de referencia parcial o falta. Aquí presentamos el método de la Trinidad de novo montaje de transcripciones de larga duración y evaluarlo en muestras de la levadura de fisión, el ratón y la mosca blanca, cuyo genoma de referencia aún no está disponible. Creando eficientemente y analizar sistemas de gráficos de Bruijn, Trinidad reconstruye completamente una gran parte de las transcripciones, incluyendo isoformas alternativamente empalmado y transcripciones de genes recientemente duplicados. En comparación con otros de novo transcriptoma ensambladores, Trinidad recupera más transcripciones de cuerpo entero en una amplia gama de niveles de expresión, con una sensibilidad similar a los métodos que se basan en las alineaciones del genoma. Nuestro enfoque ofrece una solución unificada para la reconstrucción de transcriptoma en cualquier muestra, especialmente en la ausencia de un genoma de referencia.
Selección De Híbridos Para Secuenciar Genomas De Patógeno De Muestras Clínicas
Hemos adaptado un protocolo de selección de solución híbrida para enriquecer el patógeno de ADN en muestras clínicas, dominado por el material genético humano. Utilizando mezclas simulacros de humanos y parásito de la malaria Plasmodium falciparum ADN, así como muestras clínicas de pacientes infectados, demostramos un promedio de aproximadamente 40-fold enriquecimiento del ADN del parásito después de selección de híbridos. Este enfoque permitirá la secuenciación del genoma eficiente de patógenos de muestras clínicas, así como la secuencia de organismos endosimbiótica como Wolbachia que viven dentro de diverso phyla metazoarios.
Distribución De La Variación Genómica Y El Inter De Muestra De La No-CpG Metilación Través De Tipos De Células Humanas
Metilación del ADN juega un papel importante en el desarrollo y la enfermedad. Los principales sitios de metilación del ADN en los vertebrados son las citosinas en el contexto dinucleótido CpG, que representan aproximadamente tres cuartas partes del contenido total de la metilación del ADN en las células humanas y de ratón. Mientras que la distribución genómica, la estabilidad entre los individuos, y el papel funcional de metilación de CpG se entienden razonablemente bien, se sabe poco sobre la metilación del ADN objetivo de CPA, CPT y CPC (dinucleótidos CpG no). Aquí se presenta un análisis exhaustivo de la no-CpG metilación en 76 mapas a escala del genoma a través de la metilación del ADN pluripotentes y diferenciados tipos de células humanas. Confirmamos no CpG metilación a ser predominantemente presente en los tipos de células pluripotentes y observar una disminución en la diferenciación y la ausencia casi completa en varios tipos de células somáticas. Aunque no ha sido la función que le atribuye el pluripotencia, nuestros datos ponen de manifiesto que no CpG metilación vuelven a aparecer en la reprogramación de células iPS patrones. Curiosamente, los patrones son muy variables y muestran poca conservación entre las diferentes líneas de células pluripotentes. Encontramos una fuerte correlación de la no-CpG metilación y DNMT3 los niveles de expresión mientras se muestra la independencia estadística de no CpG metilación de la expresión génica asociada a la pluripotencia. En línea con estos resultados, nos muestran que el derribo de DNMTA DNMT3B y en los resultados de células madre embrionarias humanas en una reducción global de la no-CpG metilación. Finalmente, no CpG metilación parece estar espacialmente correlacionada con la metilación CpG. En resumen, estos resultados contribuyen aún más a nuestra comprensión de los patrones de metilación de citosina en las células humanas utilizando un conjunto representativo de la muestra grande.
