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Articles by Andreea Trache in JoVE
JoVE General
集積光と原子間力顕微鏡による研究機械的刺激に対する細胞応答を生きる
1Department of Systems Biology and Translational Medicine, College of Medicine, Cardiovascular Research Institute, Texas A&M Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University
本論文では、培養中の生細胞の機械的刺激のための統合された原子間力光学イメージング顕微鏡の操作で、リーダーに指示することを目指しています。ステップバイステップのプロトコルが表示されます。機械的な刺激に生細胞の応答を示す代表的なデータセットが表示されます。
Other articles by Andreea Trache on PubMed
インテグリンと微小循環の調節: 原子間力顕微鏡を用いた分子研究の動脈から。
インテグリンの接続セル マトリックスと細胞骨格のおかげで、両方の力の伝達を仲介することができます細胞外マトリックス蛋白質の受容器の重要なクラスです。シグナル伝達、焦点距離の連絡先に関連付ける蛋白質シグナリングの群集から生じる。その結果、インテグリンは、メカノ センサー血管平滑筋や内皮細胞であることとメカノトランスダクションで中心的役割を提案されています。この点は、機械的な力は、多くの収縮を含む血管の関数と緩和過程、増殖、移行、添付ファイル、および細胞表現型決定の重要な刺激です。これらの関数をまとめて血管血流、毛細管圧力、透水性、末梢血管抵抗の制御などの生理的特性を定義してのような高血圧、糖尿病、動脈硬化の病態生理学的プロセスの役割を果たします。インテグリンの感覚し、物理的な力に携帯電話の信号を伝達してどちらのインテグリンの関与しているに関する私たちの知識は完了です。その他細胞表面受容体に比べると、インテグリンは比較的低親和性結合部位の細胞外マトリックス上があるし、の親和性を規制することができます。インテグリンのリガンド相互作用のこれらの特徴は細胞移動、改造、セルおよび収縮活性化に応答して外部の力などの動的なプロセスを促進するかもしれない。重要な質問は自然とインテグリンを介した血管壁をシグナリングの起源に関して残る。
原子間力顕微鏡による血管内皮細胞のフィブロネクチンの相互作用に及ぼすヒスタミン。
原子間力顕微鏡は内皮によりおよび血管漏出を引き起こす主要な炎症のメディエーターであるヒスタミンを細胞の応答を調査するために使用されました。AFM プローブ フィブロネクチンとラベル付けされ、単一フィブロネクチン インテグリンの絆を破るために必要な力を定量化すること alpha5beta1 インテグリンとフィブロネクチンと結合強度を測定するために使用します。細胞骨格の変更, バインド確率及び接着前に、と後の血管内皮細胞のヒスタミン治療された監視力します。セル地形測定はヒスタミンが細胞収縮を誘導することを示しています。ローカル セル剛性と結合確率 2 倍ヒスタミン治療後増加しました。破裂単一 alpha5beta1 フィブロネクチン債券に必要な力 34.0 ± 0.5 pN 制御細胞から 39 1 pN +/-ヒスタミン治療後増加。実験はまた alpha5beta1 フィブロネクチンの相互作用の特異性を確認するために行った。接着事象の確率を減少可溶性 GRGDdSP の存在下で目 alpha5beta1 とフィブロネクチン間の粘着力に残った一方 50 ％ を据え置きます。これらのデータは、細胞外マトリックス-インテグリンの相互作用における外部化学伝達物質の変化に対する内皮細胞応答が重要な役割を再生を示しています。直接測定によるライブ内皮細胞に対する原子間力顕微鏡とこれらの変更を記録できます。
フィブロネクチンと Alpha5beta1-インテグリン血管平滑筋細胞の相互作用の機械的性質は、原子間力顕微鏡を用いた検討。
インテグリン細胞外マトリックス (ECM) の相互作用の機械的性質メカノトランスダクション血管平滑筋細胞 （細胞） 焦点接着斑と関連付けられているプロセスのために重要であるし、特定の意義の心血管疾患のことができます。この研究では, 我々 はバインド解除の力とバインディング活動初期フィブロネクチン (FN) の特徴-原子間力顕微鏡 (AFM) を用いた細胞の表面に alpha5beta1 の相互作用。これらの初期バインディング イベントが後続焦点接着アセンブリに重要であることを仮定しました。FN 細胞癒着は alpha5 と beta1 インテグリンとして RGD 含有ペプチドに対する抗体ではない抗体に対する α 4- と beta3 - FN 主に alpha5beta1 にバインドされていることを示すインテグリン、選択的にブロックされました。39 8 PN +/-の特徴的なバインド解除力だった観察し、FN alpha5beta1 単一結合強度を表す解釈。細胞 (バインディング確率) に準拠する能力の FN はインテグリン拮抗薬や血清飢餓、血小板由来成長因子 (PDGF) によって有意に減少した-BB、FN バインディング リゾホスファチジン酸 （LPA） 増加したに対し。ただし、解決のバインド解除力に大きな変化は認められなかった。婚約の後、FN コーティング ビーズ細胞からを取り除くために必要な力の癒着や変質結合親和性の数の時間依存型増加を示唆の接触時間が増加。LPA このプロセス強化、PDGF それ、ことを示唆して減少に対しこれらの要因はまたフォーカル コンタクト アセンブリの multimolecular プロセスに影響します。こうして AFM インテグリン ECM の相互作用の機械的性質とその規制のキャラクタリゼーションのための強力なツールです。Alpha5beta1 とフォーカル コンタクト アセンブリの機能的活動を急速に調節できることが示唆されました。
生細胞における分子ダイナミクスを監視するため原子力マルチ光学イメージング統合顕微鏡。
イメージング システム新規ハイブリッドは、原子間力顕微鏡 (AFM) は高空間分解能を提供する光学イメージング技術の組み合わせで統合する構築されます。主なアプリケーションはこの楽器 (NanoFluor 顕微鏡) メカノトランスダクションと細胞外マトリックス インテグリン細胞骨格の相互作用に重点を置いてとその外部の化学的・機械的要因の変化に細胞応答における役割の研究です。AFM 細胞骨格の変化の定量的薄切片細胞体 coverslip セル界面での光イメージング アプリケーションの許可が確率、接着力およびマイクロメカニックス プロパティのセルのバインド全内部反射蛍光 （TIRF) と内部反射の顕微鏡検査 (IRM) を使用して焦点接着斑の研究を許可できます。組み合わせの AFM 光学イメージング実験頂端表面細胞の力学刺激フォーカル コンタクト再編がリアルタイムで監視できる基底面に終って、力を生成する細胞骨格応答を誘導することを示します。システムもと小説を機械的に搭載されている NanoFluor デュアル カメラ集録システム合成フォースター共鳴エネルギー移動 (FRET) を揃え。統合 NanoFluor 顕微鏡システムその特性、アプリケーション、および制限事項を含めて説明します。
表面増強ラマン分光法の人間のインテグリン検出の使用。
現在の研究は血液凝固, 血圧, 組織血流および血管リモデリングの制御など様々 な重要な生理機能でインテグリンと呼ばれるセル表面蛋白質のクラスの重要性を明らかにしました。インテグリンの機能へのキーは、細胞外マトリックスと細胞骨格との相互作用によって力伝達を仲介するその能力です。さらに、彼らは焦点接着 （FA） ポイントのタンパク質との結合を介するシグナル伝達の役割を果たします。これら多様な生化学的なインタラクションを担う細胞-細胞外マトリックス (ECM) の接着と細胞の複雑なメカニズムを理解するには、インテグリン細胞の識別し、各種リガンドとの相互作用を監視する必要があります。この最後に初めて、我々 表面増強ラマン （SERS） インテグリンを検出するために採用しています。結果 SERS ナノモル濃度体制へのインテグリンの検出と血管平滑筋細胞 (VSMCs) に存在する 2 つの異なる種類のインテグリン、alphaVbeta3、alpha5beta1、間の区別を使用して機能を示します。SERS アプローチ潜在的生理学的重要性のさまざまな現象におけるインテグリンのリガンドの相互作用の機構解明役立つことが予想されます。
定量化と共焦点特定蛋白質の分子イメージング インプリントポリマー。
我々 FITC--アルブミン蛋白質テンプレート分子は水相分子インプリント高分子 (HydroMIP) 戦略を採用しています。初めて、蛍光に分類されたテンプレートの使用は、HydroMIP nonimprinted コントロール ポリマー （HydroNIP） と比較して大幅な分子メモリを有していることを示すスマート材料の後続のキャラクタリゼーションと報告されます。FITC--のイメージング アルブミンの共焦点顕微鏡を用いた刻印 HydroMIP はの面で表示されるインプリントされたタンパク質の in situ 除去と記載されている変更の前に、と後 （10 ％ SDS/10% 酢酸 (w/v) ソリューションを使用して） テンプレート溶出、インプリント高分子の蛍光観察。我々 も牛ヘモグロビン (BHb) のイメージング 2 光子共焦点顕微鏡を用いた HydroMIP 刻印を報告し、タンパク質蛍光要テンプレート溶出の影響について説明します。それ以上の所見は水相分子インプリンティング プロトコルとドキュメント蛍光テンプレート ラベリング/検出とイメージング戦略小説に有用なツールとしての使用の理解に貢献します。
全内部反射蛍光 （TIRF) 顕微鏡。
全内部反射蛍光 （TIRF) 顕微鏡のエキサイティングで、fluorophores coverslips に育ったライブまたは固定の細胞の膜に近い領域で存在を可視化するメソッドを表します。全反射型顕微鏡、高屈折率の媒体 （例えば、ガラス） から光を通過するときに低屈折率の媒質 （例えば、セル、水） に発生する内部全反射現象に基づいています。合計によって内部的に生成、近接場光蛍光分子セル基板界面を興奮させ、残りのセル ボリュームによって最小限の露出を伴う反映。この手法は非常に低い背景と事実上ないアウト フォーカス ライト、理想の可視化と表面近傍の単一分子蛍光分光の高コントラスト蛍光画像を提供します。このユニットでは、操作、楽器の多様性と生物試料の全反射顕微鏡用途研究のための原則は、簡潔に提示します。
原子間力顕微鏡 （AFM）。
原子間力顕微鏡 (AFM) は、その能力にイメージ表面下の液体による生体試料の勉強のための重要なツールです。AFM は、カンチレバー チップの物理的な相互作用による細胞表面分子で動作します。ヒントと細胞表面分子間の接着力はカンチレバーたわみとして検出されます。したがって、カンチレバー チップは原子分解能の生きているセルのイメージをして生きている細胞生理的条件下での単一分子イベントをプローブに使用できます。現在、これは直接高分解能の構造、機械、及び機能の情報を提供します、唯一の技術です。このユニット AFM の基本的なコンポーネント、動作モード、役に立つヒント試料調製及び AFM アプリケーションのショート レビュー微生物学でプレゼントします。
生細胞におけるメカノ研究のリアルタイムイメージングのための統合された顕微鏡
機械的な力は収縮、増殖、遊走、細胞接着を含む多くの血管平滑筋細胞機能の重要な刺激と決定因子である。接着斑を介して細胞外からの力の伝達は、これらの接着部位の動態を制御し、細胞の振る舞いを変更する細胞内シグナル伝達カスケードを開始します。生きている細胞は機械的な力を感知するメカニズム、およびそれらがどのように対応し、その環境に適応を理解するために、重要な最初のステップは、合計で原子間力顕微鏡（AFM）を統合する細胞内レベルでの細胞挙動を調査するための新技術を開発することである内部反射蛍光（全反射）と高速回転するディスク（FSD）共焦点顕微鏡は、高い空間分解能と時間分解能を提供しています。 AFMは、細胞表面形状を測定するナノセンサーを使用して、高精度で機械的な力を適用して測定することができます。全反射顕微鏡は、細胞カバースリップインタフェースのすぐ近くに蛍光標識分子の高いZ-解像度で高コントラストな画像を提供する光イメージング技術である。 FSD共焦点顕微鏡は、リアルタイムで細胞全体の急速な3-Dイメージングすることができます。統合されたシステムは、リアルタイムでの機械的刺激に対する細胞応答の直接光イメージングを可能にする、任意の付着生細胞における分子動力学研究の広い範囲を越えて広く適用されます。
Mg 2 + 原子間力顕微鏡による血管平滑筋細胞におけるインテグリン細胞外マトリックスの相互作用を調節します。
原子間力顕微鏡 (AFM) は alpha5beta1 インテグリンとフィブロネクチン (FN) 2価陽イオンの存在下での相互作用を調査するために使用されました。AFM プローブ FN とラベル付けされ、金額 （100-10,000 pN/秒） の読み込みの生理的範囲に 1 つの FN インテグリン債券を破るに必要な力を定量化すること alpha5beta1 インテグリンと FN の間結合強度を測定するために使用します。破裂単一 alpha5beta1 FN 債券に必要な力二重調査料金の読み込みの政権にわたって増加しました。Mg(2+) とカルシウム濃度変化の相互作用の熱力学的パラメーターの影響を受けるし、結合エネルギーの変調します。これらのデータは、血管平滑筋細胞が存在する外部イオン環境影響を細胞外マトリックスとインテグリンの相互作用を定義する機械的パラメーターを示しています。したがって、動的力学環境血管壁などでは、FN と alpha5beta1 インテグリン間熱力学的バインディング プロパティは、ローカルで適用される荷重と 2価陽イオン濃度との関係異なります。これらの変更は原子間力顕微鏡を使用してライブの平滑筋細胞の直接測定として記録できます。
血管平滑筋細胞におけるRhoAのシグナリング変調における細胞外マトリックスの影響
それらが住んでいる機械的にアクティブな環境への血管平滑筋細胞（VSMC）の形態学的適応は、細胞内レベルでの生理的変化を誘導する細胞外マトリックス（ECM）との直接的な相互作用によって媒介される。本研究では、アクチンの組織と接着斑の形成を制御するRhoAの誘導性、機械的シグナル伝達にECMの効果を分析することを目的とした。 VSMCは、RhoAの構造（野生型、恒常的にマイナスの優性またはアクティブ）と基板（フィブロネクチン、コラーゲンIV、コラーゲンI、およびラミニン）、または対照としてのポリ-L-リジンとして使用される別のECMタンパク質上にメッキでトランスフェクトした。 VSMCの形態変化は、蛍光共焦点顕微鏡と全反射蛍光（全反射）顕微鏡で検出され、独立して接着アッセイおよびウェスタンブロット分析を用いて検証した。我々の結果は、ECMが変調RhoAのシグナル伝達に直接影響を持つセル拡散、接着と形態の重要な役割を担っていることが明らかになった。 RhoA活性が有意にストレスファイバーと接着斑の再編成に影響を与えますが、コンテキスト内でECMによって課された。有意な阻害は、異なるECM上にめっき後24時間で記録されつつ、VSMCにおけるRhoA活性変調は、5HでストレスファイバーとFA形成の増加した活性化を誘導した。我々の調査結果は、ECMが局所微小環境に細胞の適応に関与する細胞内の生化学的シグナル伝達を誘導する機械的な刺激にVSMC応答を調節することを生物物理学的証拠を提供しています。
