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Articles by Andrew D. Klocko in JoVE
JoVE General
Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis
Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan-Ann Arbor
Un protocolo detallado se describe para la formación de imágenes en tiempo real de los complejos de reparación del ADN en
Other articles by Andrew D. Klocko on PubMed
Comportamiento Memorandum De Un Vector De Gene Mos1 Mariner En Aedes Aegypti
El comportamiento Memorandum de vectores insectos gene determinará los tipos de aplicaciones que pueden ser utilizados. Mutagénesis del Transposon, atrapando el reforzador y el uso de elementos transponibles como sistemas de impulsión genéticos en insectos requiere elementos transponibles con altas tasas de removilización en presencia de la transposasa. Investigamos el comportamiento Memorandum del elemento Mos1 mariner en transgénico Aedes aegypti examinando tanto línea germinal y somáticos transposiciones de un elemento no autónomo en presencia de Mos1 transposasa. Transposiciones somáticas en ocasiones fueron detectados mientras que solamente raramente se observó la transposición de la línea germinal. Sólo un evento de transposición de línea germinal solo se recuperó después de la proyección de 14.000 progenie. Los patrones observados de transposición sugieren que Mos1 movimiento ocurre entre la fase S y la anafase. Los datos aquí consignados indican que Mos1 será un vector útil en Ae. aegypti para aplicaciones que requieren un alto grado de estabilidad de vector pero han limitado uso en la construcción de la unidad de genética, trampa de reforzador o transposon sistemas de etiquetado en esta especie.
La Expresión Ectópica De Un Transgen De Cecropina En El Paludismo Humano Vector Mosquito Anopheles Gambiae (Diptera: Culicidae): Efectos Sobre La Susceptibilidad a Plasmodium
Alterar genéticamente el estado de vector de la enfermedad de insectos utilizando tecnologías de ADN recombinante se está considerando como una alternativa a los esfuerzos de erradicación. Manipulación de la respuesta inmune endógena de mosquitos como la expresión temporal y especial de péptidos antimicrobianos como cecropina puede resultar en un fenotipo refractario. Utilizando la tecnología transgénica un patrón único de expresión de la cecropina A (cecA) en Anopheles gambiae se creó tal que cecA se expresó comenzando 24 h después de una comida de sangre en el intestino medio posterior. Dos líneas independientes de transgénico gambiae y fueron creadas usando un vector de gene piggyBac que contiene el cDNA de cecA gambiae y bajo el control reglamentario del promotor Carboxipeptidasa Aedes aegypti. Infección con Plasmodium berghei resultó en una reducción del 60% en el número de ooquistes en mosquitos transgénicos en comparación con los mosquitos nontransgenic. Manipular el sistema inmunitario innato de mosquitos puede afectar negativamente su capacidad para servir de anfitriones para el desarrollo de patógenos microbios.
Especificidad Del Promotor Para Regulación De RNA De 6S De La Transcripción Se Determina Por Núcleo Promotor Secuencias Y Competencia Para La Región 4.2 De Sigma70
6S RNA ATA sigma70-ARN polimerasa y la transcripción de algo en muchos promotores de sigma70-dependiente, pero otros escapan Reglamento incluso durante la fase estacionaria, cuando la mayoría de la maquinaria de transcripción está limitada por el RNA. Divulgamos que núcleo promotor elementos determinan la especificidad de este promotor; un elemento débil de-35 permite un promotor que 6S RNA sensible, y un elemento extendido de-10 asimismo determina inhibición de RNA de 6S excepto cuando existe un elemento de consenso -35. Estas dos características juntos predijeron que cientos de asignadas promotores de Escherichia coli podrían ser objeto de 6S RNA humedecimiento en fase estacionaria. Análisis de microarrays confirman 6S downregulation del RNA-dependiente de la expresión del 68% de los genes predichos, que corresponde al 49% de los genes expresados con trazado promotores de e. coli y 6S RNA establece como un regulador global en fase estacionaria. También demostramos un papel crítico para la región 4.2 de sigma70 en las interacciones de la ARN polimerasa con ARN 6S. Región 4.2 une el elemento-35 durante la iniciación de la transcripción; por lo tanto, proponemos un mecanismo de regulación de RNA de 6S de la transcripción es a través de la competencia para la región de enlace 4.2 de sigma70.
Unión Del RNA De 6S a Esigma(70) Requiere Una Superficie De Carga Positiva De Sigma(70) Región 4.2
6S RNA es un pequeño, no codificante del RNA que interactúa con el sigma 70-RNA polimerasa y regula la transcripción en muchos promotores durante la fase estacionaria. Cuando estén Unidas al sigma 70-ARN polimerasa, 6S RNA participa en el sitio activo de la polimerasa de sigma 70-RNA de una manera bastante similar al promotor de ADN que el RNA puede servir como una plantilla para la síntesis de ARN. Se ha propuesto que el RNA 6S imita la conformación del ADN durante la iniciación de la transcripción, sugiriendo contactos entre la ARN polimerasa y 6S ARN o ADN puede ser similar. Aquí demostramos que esa región 4.2 de sigma(70) es fundamental para la interacción entre 6S ARN y ARN polimerasa. Definimos una superficie ampliada Unión que abarca residuos a lo largo de la hélice de reconocimiento del motivo hélice-giro-hélice en región 4.2, en contraste con la Unión de ADN que se centra principalmente en la región N-terminal de esta hélice positivamente cargados. Además, residuos cargados negativamente en región 4.2 debilitan la Unión a RNA 6S pero igualmente no afecta DNA obligatorio. Proponemos que los sitios de Unión para el promotor ARN ADN y 6S en región 4.2 de sigma(70) se solapan pero distintas, criando posibilidades interesantes de cómo núcleo promotor elementos contribuyen a la definición de promotores que son sensibles a la regulación de RNA 6S.
Las Mutaciones En La Pinza De Bacillus Subtilis Que Beta Separar Sus Funciones En La Replicación Del ADN De Reparación De Genes
La pinza beta es una abrazadera de replicación esencial deslizante requerido para la síntesis de ADN procesiva. La pinza beta es también un factor crítico para varios otros aspectos del metabolismo del ADN, incluyendo la reparación del ADN mismatch (MMR). El alelo dnaN5 de Bacillus subtilis codifica una forma mutante de la pinza beta que contiene la sustitución G73R. Las células con el alelo dnaN5 son sensibles a la temperatura para el crecimiento debido a un defecto en la replicación del ADN en 49 grados C, y muestran un aumento en la frecuencia de mutación causada por un defecto parcial en MMR a temperaturas permisivas. Se han seleccionado de los supresores de intragenic dnaN5 que rescataron viabilidad a 49 grados C para determinar si el defecto de replicación del ADN podría ser separado del defecto MMR. Se aislaron tres supresores intragénicos de dnaN5 que restauraron el crecimiento a la temperatura no permisiva manteniendo al mismo tiempo un aumento en la frecuencia de mutación. Los tres alelos DNAn codificada la sustitución G73R, junto con una de las tres nuevas mutaciones missense. Las mutaciones sin sentido aislados fueron S22P, S181G, y E346K. De éstos, S181G y E346K están situados cerca de la hendidura hidrófoba de la pinza beta, un sitio común ocupado por proteínas que se unen la pinza beta. Usando varios métodos, nos muestran que el incremento en la frecuencia de mutación que resulta de cada alelo DNAn está vinculada a un defecto en MMR. Por otra parte, encontramos que S181G E346K y permitió el crecimiento a temperaturas elevadas y no tienen un efecto apreciable en la frecuencia de mutación cuando se separa de G73R. Por lo tanto, hemos encontrado que los cambios de residuos específicos en la beta de B. subtilis abrazadera separar el papel de la pinza beta en la replicación del ADN de su papel en MMR.
Estructura De La Endonucleasa De Dominio De MutL: Sin Licencia Para Cortar
La reparación del ADN no coincide corrige los errores que se han escapado de la polimerasa corrección, el aumento de la replicación de la fidelidad 100 - 1000 veces en los organismos que van desde las bacterias hasta los seres humanos. La proteína MutL juega un papel central en la reparación de genes mediante la coordinación de múltiples interacciones proteína-proteína que la eliminación de la señal de cadena a partir del reconocimiento por la falta de coincidencia MutS. Aquí se presenta la estructura cristalina del dominio endonucleasa de Bacillus subtilis MutL. La estructura está organizada en la dimerización y subdominios reguladoras conectadas por una palanca helicoidal que abarca el motivo endonucleasa conservada. Adicionales del clúster motivos conservados alrededor de la palanca y definir un Zn (2 +)-sitio de unión que es fundamental para la función MutL in vivo. La estructura presenta un poderoso mecanismo de inhibición para evitar muescas no deseado de ADN recién replicado y nos permite proponer un modelo que describe cómo la interacción con MutS y la abrazadera procesividad podría autorizar la actividad endonucleasa de MutL. La estructura también proporciona un marco molecular para proponer y probar las funciones adicionales de MutL en la reparación de genes.
De Reparación De Genes Provoca La Liberación De La Dinámica De Una ADN Polimerasa Esencial Del Tenedor De Replicación
Reparación de apareamientos erróneos (MMR) corrige errores en el ADN polimerasa que se producen durante la replicación del genoma. MMR es crítico para el mantenimiento del genoma, y su pérdida aumenta las tasas de mutación varios cientos de veces. Trabajos recientes han demostrado que la interacción entre las proteínas MutS desajuste reconocimiento y la abrazadera de replicación procesividad es importante para MMR en Bacillus subtilis. Para entender mejor como MMR se acopla a la replicación del ADN, se analizó la localización subcelular de las proteínas de replicación del ADN y la MMR fusionados a la proteína verde fluorescente (GFP) en células vivas, a raíz de un aumento en los errores de replicación del ADN. Se demuestra que los focos de la polimerasa del ADN esencial dnaE-GFP incorporación desajuste disminución de seguir y que la pérdida de dnaE-GFP focos requiere MutS. Por otra parte, nos muestran que MutS y MutL unen dnaE in vitro, lo que sugiere que dnaE se acopla a la reparación. También se encontró que dnaE-GFP disminución de focos en vivo después de un daño en el DNA independiente de detención de la síntesis de ADN que muestra que la pérdida de dnaE-GFP focos es causada por perturbaciones en la replicación del ADN. Proponemos que MutS en contacto directo con la maquinaria de replicación del ADN, causando un cambio dinámico en la organización de dnaE en el tenedor de replicación durante la MMR. Nuestros resultados establecen una conexión sorprendente e íntimo entre la triple vírica y el complejo de la polimerasa del ADN de replicación in vivo.
