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Articles by Anke Scholz in JoVE
JoVE General
El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal
Institute for Molecular Cell Biology, Universty of Saarland
Adultos miocitos cardíacos son las células primarias que pueden ser aisladas de corazones de animales y se cultivan durante varios días. Dentro de este período de la cultura de transferencia génica adenoviral pueden ser utilizadas para expresar biosensores genéticamente codificados (GEBS) o proteínas fluorescentes de fusión. Ambos enfoques permiten investigaciones celulares por medio de microscopía confocal.
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Fosforilación De La Sacarosa Sintasa En Serina 170: Ocurrencia Y Posible Papel Como Una Señal Para La Proteólisis
Análisis de la secuencia identificado serina 170 (S170) del maíz (Zea mays L.) SUS1 la proteína de sacarosa sintasa (SUS) como un posible, segundo sitio de fosforilación. Hojas de maíz contuvieron dos actividades quinasa de proteínas dependiente de calcio y una actividad de la quinasa calcio-independiente con características de una sacarosa 1 no fermentadores (SNF1)-relacionados con proteína quinasa. Fosforilación de la novela S170 y sitio (S15) 15 por estas proteínas quinasas serina conocido fue determinada en sustratos de péptido y detectada en sustratos de proteína SUS1 utilizando anticuerpos específicos de la secuencia y de la fosforilación. Demostramos la fosforilación de S170 in vitro e in vivo. Las quinasas de proteínas dependiente de calcio fosforila S170 tanto S15, mientras que la actividad de la cinasa de proteína relacionada con la SNF1 se limitó a S15. Dependiente de calcio mediada por la proteína-cinasa S170 S15 fosforilación cinética y determinaron en sustratos de SUS1 de tipo salvaje y mutantes. Estos análisis revelaron esa especificidad quinasa S170 fue tres veces menor que para S15, y que la fosforilación de S170 fue estimulada por fosforilación previa en el sitio de S15. Los péptidos de SUS enlace codificados por principio nodC 40 (ENOD40) específicamente contrarió S170 fosforilación in vitro. Un modelo en donde S170 fosforilación funciona como parte de un mecanismo dirigido a SUS degradación mediada por proteasoma es apoyado por las observaciones que fragmentos SUS proteolíticas: (i) fueron detectados y poseído estequiometría de relativamente alta fosforila-S170 (pS170); (ii) fueron espacialmente coincidente con la actividad del proteasoma en desarrollo de hojas; y (iii) co-sedimentados con actividad del proteasoma. Además, la proteína integral pS170-SUS fue menos estable que S170-SUS en cultivados segmentos de hoja y se estabilizó por la inhibición del proteasoma. Poste-de translación control de nivel de la proteína SUS a través de proteólisis promovida por pS170 puede explicar la disminución significativa y específica en la abundancia SUS que acompaña a la transición de fregadero-fuente en el desarrollo de hojas de maíz.
Remodelación De Ca2 + Manejo De Orgánulos En Adultos Miocitos Ventriculares De Rata Durante Cultivo a Largo Plazo
Es bien sabido que para cardiomiocitos, el aislamiento y cultivo de inducir procesos de remodelación en gran parte desconocidos. Se analizaron los cambios en la estructura de los compartimentos celulares con técnicas ópticas tales como la microscopía confocal y redistribución de fluorescencia después de photobleaching empleando adenovírico mediada por transducción de proteínas fluorescentes específicas y tintes de moléculas pequeñas. Se identificaron características de los procesos de remodelación: el sistema de membrana T-tubular se fue perdiendo por un proceso conocido como "pellizcos secuencial off", en una dirección externa. Las mitocondrias cayó en una de las tres clases, muy pequeño (0,9 micras de longitud), de largo mediano (1,8 micras) o de forma prolongada (3,6 micras) orgánulos. Durante el tiempo de cultivo mitocondrias gradualmente fusionados. El blanqueamiento de los individuos de asociación entre la mitocondria reveló mitocondrias aparentemente separados por el "túnel" a través de sub-resolución orgánulos tubos. Este proceso fue aumentando con el túnel del tiempo de cultivo. Una pérdida gradual de la disposición transversal estrías en el retículo endoplasmático / sarcoplásmico se visualizó. Análisis de las grandes poblaciones de Ca (2 +) por las chispas de vídeo de tipo confocal de barrido 2D reveló importantes aunque pequeños cambios de estos elementales SR-Ca (2 +) eventos de liberación en cardiomiocitos adultos que podrían estar relacionados a cambios en la SR-Ca ( 2 + contenidos) en lugar de descansar Ca (2 +) de concentración. En conclusión, primaria cardiomiocitos aislados de corazones adultos someterse a una remodelación subcelular bien definido, pero reproducible en optimizar la cultura a largo plazo.
Acción óptico De Detección Potencial En Los Miocitos Ventriculares De Adultos Como Alternativa De QT De Pantalla
Intervalo QT-pantallas son cada vez más importante para la seguridad cardíaca de todos los medicamentos nuevos. Hasta ahora, las investigaciones se basan en experimentos con animales o pantallas a base de células exclusivamente de sondeo para las alteraciones en la conductancia heteróloga expresada hERG canales en líneas celulares que permiten un alto grado de automatización. Cardiomiocitos adultos no pueden ser manejados por automatizadas configuraciones de patch-clamp. Por lo tanto detección óptica de primarias miocitos ventriculares aislados se considera como una alternativa. Varios sensores ópticos de tensión se ha informado de las medidas ratiometric, pero todos ellos influyeron en el potencial de acción ingenua. El objetivo del presente estudio fue explorar las condiciones de grabación y definir los ajustes que permiten a los ópticos-pantallas del intervalo QT.
La Preservación Funcional Y Morfológica De Los Miocitos Ventriculares Adultos En Cultura Por El Sub-micromolar Citocalasina D Suplemento
En los miocitos cardíacos, citocalasina D (CytoD) se informó de actuar como un disruptor de actina y desacoplador mecánico. Usando confocal y microscopía de super-resolución STED, nos muestran que CytoD conserva la arquitectura de filamentos de actina de los adultos miocitos ventriculares de rata en cultivo. Quinientos nanomolar CytoD fue la concentración óptima para lograr tanto la preservación de la estructura tubular de T-durante los períodos de cultivo de 3 días y de conservación de las principales características funcionales, tales como los potenciales de acción, transitorios de calcio y, sobre todo, las propiedades contráctiles de miocitos individuales. Por lo tanto, se concluye que la adición de CytoD a la cultura de adultos miocitos cardíacos de hecho puede ser utilizado para generar un sólido de una sola célula modelo que conserva la morfología y la función de células recién aisladas. Por otra parte, nos revelan un vínculo entre la supuesta remodelación del citoesqueleto y T tubular. En ausencia de CytoD, se observó una pérdida de túbulos T-que llevó a importantes Ca asincrónica (2 +) inducida por Ca (2 +) de liberación (CICR), mientras que en presencia de 0,5 mM CytoD, T de túbulos y homogénea CICR se han conservado mayormente. Estos datos sugieren un posible vínculo entre el citoesqueleto de actina, los túbulos T y sincrónica, fiable acoplamiento excitación-contracción. Por lo tanto, T-tubular de reorganización en el cultivo celular arroja alguna luz adicional en los procesos similares que se encuentran en muchas de las enfermedades cardíacas y alteraciones del citoesqueleto podría vincular a los cambios en subcelular Ca (2 +) de señalización reveló bajo tales condiciones fisiopatológicas.
