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PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l'échelle des sites de liaison des protéines liant l'ARN
1Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, 2Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 3Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 4Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 5Genomics Resource Center, Rockefeller University
Transcrits d'ARN sont soumis à régulation post-transcriptionnelle vaste qui est médiée par une multitude d'action trans protéines liant l'ARN (pratiques commerciales restrictives). Nous présentons ici une méthode généralisable pour identifier précisément et à l'échelle du transcriptome à l'échelle des sites liaison à l'ARN de pratiques commerciales restrictives.
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Transcriptome à L'échelle D'identification De L'ARN-binding Protein Et Sites Cibles MicroARN Par PAR-CLIP
Transcrits d'ARN sont soumis à la régulation des gènes post-transcriptionnelle impliquant des centaines de protéines liant l'ARN (pratiques commerciales restrictives) et des complexes ribonucléoprotéiques microARN contenant (miRNPs) exprimées de façon dépendante du type cellulaire. Nous avons développé une approche de réticulation à base de cellules pour déterminer à haute résolution et du transcriptome à l'échelle des sites de liaison des pratiques commerciales restrictives cellulaires et miRNPs. Les sites réticulés sont révélées par la thymidine à des transitions cytidine dans les ADNc préparés à partir de immunopurifié RNP de la 4-thiouridine cellules traitées. Nous avons déterminé les sites de liaison et les conséquences réglementaires de plusieurs pratiques commerciales restrictives intensément étudiées et miRNPs, y compris PUM2, QKI, IGF2BP1-3, AGO/EIF2C1-4 et TNRC6A-C. Notre étude a révélé que ces facteurs se lient des milliers de sites contenant des motifs de séquence définis et ont des préférences distinctes pour exonique contre intronique ou de codage par rapport à des régions non traduites transcription. La cartographie précise des sites de liaison à travers le transcriptome sera cruciale pour l'interprétation des données se font jour rapidement sur la variation génétique entre les individus et la façon dont ces variations contribuent à des maladies génétiques complexes.
TatB Fonctionne Comme Un Site De Liaison Oligomériques Pliées Protéines Précurseurs De Tat
Twin-arginine-contenant des séquences signal médient le transport transmembranaire des protéines repliées. Le mécanisme apparenté à arginine translocation (Tat) d'Escherichia coli est composé des protéines membranaires TatA et TatB TatC. Considérant que les peptides signaux Tat sont reconnus par TatB et TatC, on en sait peu sur contacts moléculaires de la partie mature, pliée de protéines précurseurs Tat. Nous avons placé un photo-Croix-linker en substrats Tat dans les sites prévus pour être exposés à la surface ou cachés dans le noyau des protéines repliées. Le ciblage de ces variantes à la machinerie de le Tat de vésicules membranaires, tous les sites de surface exposée ont été découverts à proximité TatB. Parallèlement, l'incorporation de la réticulant dans TatB a révélé plusieurs sites de liaison du précurseur dans la prédite transmembranaires et amphipathiques hélices du TatB. Gros adduits à l'indicatif du verbe TatB communiquant avec une molécule précurseur des oligomères ont aussi été obtenus. Réticulation des substrats de la Tat à TatB requis un peptide signal de jumeau-arginine intact et a disparu sur la translocation transmembranaire. Nos données collectives sont compatibles avec TatB formant un site de liaison oligomériques pouvant accueillir transitoirement pliées précurseurs de Tat.
Identification in Vivo Et échelle Du Transcriptome De RNA Sites De Liaison Protéine Cible
Animaux ARNm est réglementés par des centaines de protéines de liaison ARN (pratiques commerciales restrictives). L'identification des cibles de la RBP est cruciale pour comprendre leur fonction. Une méthode récente, PAR-CLIP, utilise photoréactifs nucléosides à crosslink restrictives à ARN cibles dans les cellules avant l'immunoprécipitation. Ici, nous établissons iPAR-CLIP (in vivo PAR CLIP) afin de déterminer, à la résolution des nucléotides, des sites de fixation de l'échelle du transcriptome de GLD-1, un répresseur translationnel spécifiques dans les cellules germinales, conservé chez c. elegans. Nous avons identifié des ARNm cible reproductible 439 et démontrent une excellente gamme dynamique de détection de la cible par iPAR-CLIP. GLD-1 assommement, protéine mais pas expression de l'ARNm des 439 cibles était spécifiquement augmentée, ce qui démontre les fonctionnalités. Enfin, nous avons découvert des sites de liaison GLD-1 fortement conservés près le codon de début de gènes cibles. Ces sites sont fonctionnels in vitro et probablement conférant forte répression in vivo. Nous proposons que les GLD-1 interagit avec la machinerie de traduction près le codon de départ, un mode donc-extrême-inconnu de la régulation des gènes chez les eucaryotes.
