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Articles by Archana Khurana in JoVE
JoVE General
Un metodo per la produzione di proteine ricombinanti mCD1d in cellule di insetto.
Department of Developmental Immunology, La Jolla Institute for Allergy and Immunology
Un metodo per preparare le cellule degli insetti e infettare con baculovirus per la produzione di ricombinante proteinand mCD1d generare tetrameri mCD1d.
Other articles by Archana Khurana on PubMed
La Proteina Dell'adattatore AP-3 è Necessaria Per La Presentazione Di CD1d-mediata Antigene Di Sulfatati E Lo Sviluppo Delle Cellule NKT Valpha14i
Si sa relativamente poco circa il percorso che porta alla presentazione di glicolipidi di molecole CD1. Qui vi mostriamo che la proteina dell'adattatore 3 complessi (AP-3) è necessaria per la presentazione degli antigeni glicolipide che richiedono l'interiorizzazione e l'elaborazione efficiente. AP-3 interagisce con il mouse CD1d, e cellule da deficit di topi per AP-3 sono aumentati livelli di superficie delle cellule di CD1d e diminuita espressione in late endosomes. Le cellule della milza da topi carenti AP-3 hanno una ridotta capacità di presentare glicolipidi di natural killer delle cellule T (NKT). Inoltre, topi carenti AP-3 hanno una popolazione di cellule NKT significativamente ridotta, anche se questo non è causato da auto-tolleranza che possa derivare da aumentati livelli di superfici CD1d. Questi dati suggeriscono che la generazione del ligando endogeno che seleziona le cellule NKT può anche essere AP-3 dipendenti. Tuttavia, la funzione dei linfociti T CD4 + di MHC classe II-reattiva non è alterata da carenza di AP-3. Coerente con questa divergenza dal pathway II classe, lo sviluppo delle cellule NKT e presentazione dell'antigene da CD1d non sono ridotto da deficit della catena invariante. Questi dati dimostrano che il requisito di AP-3 è un attributo specifico del percorso CD1d in topi e che, sebbene le molecole di MHC classe II e CD1d si trovano entrambi in late endosomes o lisosomi, diversi percorsi mediano loro traffico intracellulare.
Il Mouse CD1d Coda Citoplasmatica Media CD1d Traffico E Antigene Presentazione Dai Meccanismi Adattatore Proteina 3-dipendente E - Indipendente
La breve coda citoplasmatica del mouse CD1d (mCD1d) è richiesta per la sua localizzazione endosomal, per la presentazione di alcuni glicolipide Ags e per lo sviluppo delle cellule NKT Valpha14i. Questa coda è un quattro-amino acido Tyr-contenente motivo Tyr-Gln-Asp-Ile (YQDI), simili a quelle sequenze di note per essere importante per l'interazione con i complessi della proteina adattatore (AP) che mediano la localizzazione endosomal molte proteine diverse. Infatti, mCD1d è stato dimostrato in precedenza per interagire con l'adattatore per AP-3 complesso. Nel presente studio, abbiamo mutato ogni amminoacido in motivo YQDI per determinare l'importanza della sequenza intera motivo nel traffico d'influenza di mCD1d, l'interazione con adattatori e sua localizzazione intracellulare. I risultati indicano che la Y, D e gli amminoacidi sono significativi funzionalmente perché mutazioni in ciascuna di queste posizioni alterato la distribuzione intracellulare di mCD1d e ridotto la sua capacità di presentare sulfatati alle cellule NKT. Tuttavia, i tre aminoacidi non sono tutti che agisce nello stesso modo perché si differenziano per quanto riguarda come esse influenzano la distribuzione intracellulare del CD1d, il tasso di interiorizzazione e la sua capacità di interagire con la subunità mu di AP-3. Nostri risultati sottolineano che più passaggi, tra cui le interazioni con gli adattatori AP-2 e AP-3, sono necessari per il normale traffico di mCD1d e che queste diverse fasi sono mediate dal solo pochi citoplasmatiche aminoacidi.
Trigliceridi Microsomiali Trasferimento Della Proteina Lipidation E Controllo Del CD1d Su Presentanti L'antigene Delle Cellule
Proteina di trasporto dei trigliceridi microsomiali (MTP), un chaperone endoplasmatico (ER) che carica i lipidi sul apolipoproteina B, regola anche CD1d presentazione degli antigeni glicolipide nel fegato e intestino. Mostriamo MTP RNA e proteine in presentanti l'antigene cells (APC) da reverse transcription-polymerase chain reaction e di immunoblotting di cellule mononucleate del fegato del mouse e mouse e linee cellulari umane di B. MTP funzionale, dimostrato da attività di trasferimento del trigliceride specifici, è presente in mouse splenocytes sia un ibridoma NKT mouse CD1d-positivo. In un saggio romanzo trasferimento in vitro, MTP purificata direttamente trasferisce fosfolipidi, ma non dei trigliceridi, a ricombinante CD1d. inibizione chimica di trasferimento dei lipidi MTP non pregiudica classe complesso maggiore di istocompatibilità presentazione II di ovoalbumina, ma riduce notevolmente la presentazione CD1d-mediata di alfa-galactosylceramide (alfa-galcer) e gli antigeni endogeni in mouse splenico e derivate da midollo osseo cellule dendritiche (DCs), così come in umane linee APC e monocyte-derivati DCs. silenziamento MTP espressione nella linea monocita umane U937 influisce sulla funzione CD1d, come dimostrato dalla diminuita presentazione di alfa-galcer. Proponiamo che MTP atti a monte del saposins e funzioni come un ER accompagnatore caricando lipidi endogeni sul nascente CD1d. Inoltre, i nostri studi suggeriscono che un inibitore di piccola molecola potrebbe essere utilizzato per modulare l'attività delle cellule NKT.
Sintesi E Valutazione Di Sfinganina Analoghi Di KRN7000 E OCH
[strutture: vedi testo] Il fitosfingosine contenenti alfa-galactosylceramides (alfa-GalCers), KRN7000 e OCH, hanno dimostrato di attivare le cellule NKT tramite interazione con CD1d, un membro della famiglia di proteine di presentanti l'antigene CD1. Prove da KRN7000 stimolazione delle cellule NKT suggeriscono che alfa-GalCers possono avere applicazioni nel trattamento o la prevenzione di una gamma di condizioni autoimmuni, virali e batteriche. Inoltre, OCH, un tronco analogo KRN7000, sembra indurre un bias T (H) 2, che potrebbe avere implicazioni per il trattamento di condizioni infiammatorie e autoimmuni. Abbiamo preparato l'analoghi contenenti sfinganina diretta di KRN7000 e OCH, 1 e 2 e li ha trovati per essere paragonabile in attività per i composti di padre nell'indurre il rilascio di IL-2, IL-4 e IFN. Inoltre, composto 2 conduce ad una polarizzazione di cytokine simile a quello visto con OCH. Ciò è significativo perché sphinganines sono più facilmente accessibili rispetto a phytosphingosines, che dovrebbe facilitare studi SAR.
Una Ceramide Galattosil-alfa Modificato Per Colorazione E Per Stimolare Le Cellule T Killer Naturali
CD1d presentazione di alfa-galattosil ceramidi di naturale cellule T killer è stato un punto focale dello studio di cellule T regolatorie. KRN7000, un'Alfa-galattosil ceramide originariamente generata da studi attività struttura delle proprietà antitumorali dei glicolipidi spugna marina, è attualmente il più comunemente usato ligando agonista e viene utilizzato per colorare le cellule NKT. Tuttavia, questo glicolipide soffre di scarsa solubilità e disponibilità. Abbiamo sviluppato una ceramide galattosil-alfa con solubilità migliorata sopra KRN7000 che efficacemente macchie cellule NKT, mouse sia umani e stimola il rilascio di citochine a basse concentrazioni.
Le Cellule T Killer Naturale Riconoscono Antigeni Diacilglicerolo Da Batteri Patogeni
Natural killer delle cellule T (NKT) riconoscere Solfatati presentato da molecole CD1d e sono state collegate alla difesa contro le infezioni microbiche. Precedentemente definiti Solfatati stranieri riconosciuti dalle cellule NKT univocamente si trovano in parte sphingomonas batteri. Qui vi mostriamo che mouse e cellule NKT umane riconosciuto anche glicolipidi, specificamente un diacilglicerolo, da Borrelia burgdorferi, che causa la malattia di Lyme. La b. burgdorferi-derivato, glicolipide-indotta NKT proliferazione e cytokine produzione di celle e la potenza di questo glicolipide antigenica dipendeva saturazione e lunghezza catena acil. Questi dati indicano che le cellule NKT riconoscono categorie dei glicolipidi di là di quelle di sphingomonas e suggeriscono che le risposte delle cellule NKT guidate dal riconoscimento glicolipide mediata dal recettore delle cellule T possono fornire protezione contro gli agenti patogeni diversi.
Coinvolgimento Di Secretiva E Compartimenti Endosomal Nella Presentazione Di Un Self-glicolipide Esogeno Di Tipo Cellule Di II NKT
Naturale delle cellule T Killer (NKT) riconoscono sé sia estera lipidico Ags presentato da molecole CD1. Sebbene presentazione del alphaGalCer marino lipidi derivati spugna a cellule NKT di tipo I è stato ben studiato, poco si sa circa self-glicolipide presentazione di tipo I o tipo cellule di II NKT. Qui abbiamo studiato presentazione del self-glicolipide solfatidi a una cella di tipo II NKT che specificamente riconosce una sola specie di sulfatidi, vale a dire lyso-solfatidi ma non altri sulfatidi contenente catene acil supplementari. Rispetto ad altri sulfatidi o alphaGalCer, lyso-solfatidi associa con bassa affinità per CD1d. Anche se associato a piastra CD1d è inefficiente nel presentare lyso-solfatidi a pH neutro, è presentato in modo efficiente a pH acido ed in presenza di saposina C. Il traffico lisosomiale di mCD1d è necessario per la presentazione di alphaGalCer di tipo I le cellule NKT, non è importante per la presentazione di lyso-solfatidi tipo cellule di II NKT. Coerentemente, APC carenti di una proteina lisosomiale di lipidi-trasferimento presentare efficacemente lyso-sulfatidi. Presentazione di lyso-sulfatidi è inibito in presenza di un inibitore della proteina di trasporto dei trigliceridi microsomiali, concanamycin A, monensin, cicloeximide e Primachina ma rimane invariati a seguito di trattamento con GBF1 inibizione mediata da A. Wortmannin di presentazione lipidi indica un ruolo importante per la PI-3kinase in mCD1d traffico. I nostri dati suggeriscono collettivamente che debole ligandi di self-glicolipide CD1d-associazione come lyso-solfatidi possono essere presentati tramite i vani secretivi ed endosomal. Quindi questo studio fornisce importanti intuizioni presentazione self-glicolipide esogena a cellule T CD1d-limitato.
Naturali Sphingomonas Glicolipidi Variano Notevolmente Nella Loro Capacità Di Attivare Le Cellule T Killer Naturali
Mouse naturale killer T (NKT) cellule che esprimono un recettore antigene invarianti delle cellule T (TCR) riconoscono Solfatati (GSLs) da batteri Sphingomonas. Gli antigeni sintetici precedentemente testati, tuttavia, sono stati progettati per assomigliano molto la ceramide di alfa-galattosil potente agonista sintetico (alphaGalCer), che contiene un monosaccaride e una lipide sfingosina C18:0. Alcuni batteri Sphingomonas, tuttavia, hanno anche degli oligosaccaridi contenenti GSLs, e sono normalmente sintetizzare diversi GSLs con catene di sfingosina diversi tra cui uno con un C21:0 di anello contenente ciclopropile Sfingosina (C21cycl). Qui abbiamo studiato la stimolazione delle cellule NKT con antigeni sintetici GSL contenenti zuccheri naturali tetrasaccharide, o la sfingosina C21cycl. I nostri risultati indicano che c'è un grande grado di variabilità antigenica potenza di diversi glicolipidi di Sphingomonas naturale, con la sfingosina C21cycl avendo potenza intermedia e gli antigeni che contengono oligosaccaride espositrici limitata o nessuna capacità stimolante.
Cellule NKT Invarianti Sono Richieste Per L'infiammazione Delle Vie Aeree Indotta Da Antigeni Ambientali
Invariante NKT cellule (iNKT) sono un sottoinsieme unico dei linfociti T che rapidamente svolgono funzioni effettrici. In questo studio, segnaliamo che la maggioranza degli estratti di polvere sterile casa (HDEs) testato gli antigeni contenuti in grado di attivare il mouse e le cellule umane iNKT. HDEs aveva proprietà adiuvante-come un ovoalbumina (OAV)-modello di asma indotta, che erano dipendenti su cellule NKT Vα14i, come gli animali vaccinati carenti per le celle iNKT visualizzato risposte immunitarie significativamente attenuate e infiammazione delle vie aeree. Inoltre, la somministrazione di HDEs insieme con ovuli reciprocamente aumentata la sintesi di citochine dalle cellule NKT Vα14i e da cellule T CD4(+) convenzionale nel polmone, dimostrando una sinergia profonda risposta immunitaria sia per citochine Th2 e IL-17A. Questi dati dimostrano che iNKT antigeni sono molto più ampiamente disperso nell'ambiente quanto in precedenza previsto. Inoltre, come l'attività antigenica in case differenti variata notevolmente, essi suggeriscono ulteriori risposte cellulari iNKT agli antigeni ambiente, in particolare a determinati ambienti, potrebbero promuovere la sensibilizzazione agli allergeni respiratori convenzionali.
Le Cellule T Killer Naturale Invariante Riconoscono Glicolipidi Da Batteri Patogeni Gram-positivi
Le cellule T killer naturali (cellule NKT) riconoscere antigeni glicolipide presentati da CD1d. Queste cellule esprimono un recettore antigene evolutivamente conservato, invarianti delle cellule T (TCR), ma le forze che guidano la conservazione TCR rimase incerte. Qui vi mostriamo che le cellule NKT riconosciuto glicolipidi contenenti diacilglicerolo da Streptococcus pneumoniae, la principale causa di polmonite acquisita in comunità e Streptococcus gruppo B, che causa la meningite e sepsi neonatale. Inoltre, risposte CD1d-dipendente dalle cellule NKT erano necessarie per l'attivazione e protezione host. La risposta di glicolipide dipendeva dall'acido vaccenico, che è presente in basse concentrazioni nelle cellule dei mammiferi. I nostri risultati mostrano come microbica lipidi posizione lo zucchero per il riconoscimento da parte del TCR invariante e, più in particolare, estendere la gamma di microbi riconosciuto da questo TCR conservata a diversi batteri clinicamente importante.
Glicolipidi Che Suscitano Risposte IFN-γ-polarizzato Da Cellule Di T Naturale Killer
Natural killer delle cellule T (NKT) riconoscono glicolipidi presentati da CD1d. L'antigene prima descritto, la ceramide galattosil-α (αGalCer), è un potenziale agente anticancro cui attività dipende dalla secrezione di IFN-γ. Riportiamo due analoghi del αGalCer basato su un naturale glicosfingolipidi, plakoside A. Questi composti inducono una maggiore IFN-γ che correla con associazione resistenti al detergente per CD1d e una maggiore stabilità dei complessi lipide-CD1d presentanti l'antigene delle cellule. Analisi strutturale su uno dell'analoghi indicano che è più profondamente associato all'interno della scanalatura CD1d, suggerendo le interazioni lipidi-CD1d più strette. A nostra conoscenza, questo è il primo esempio in cui informazioni strutturali forniscono una spiegazione per la stabilità aumentata lipido-CD1d, probabile responsabile per la polarizzazione Th1. Forniamo intuizioni nel meccanismo di composti che inducono IFN-γ, e perché il nostro composti attivare cellule NKT umane, che potrebbe avere utilità terapeutica.
