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- Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques
- Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d'îlots humains
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Articles by Barbara Barbaro in JoVE
JoVE General
Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques
Department of Surgery, University of Illinois, Chicago
Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie I: la digestion et la collecte des tissus pancréatiques) en utilisant une méthode modifiée automatisés.
JoVE General
Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d'îlots humains
Department of Surgery, University of Illinois, Chicago
Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie II: la purification et la culture d'îlots humains) en utilisant une méthode modifiée automatisés.
Other articles by Barbara Barbaro on PubMed
Corticostéroïdes Modulent Les Processus Sécrétoires De L'épithélium Biliaire Intrahépatique De Rat
Nous avons étudié l'expression des récepteurs des glucocorticoïdes (RME) de l'épithélium biliaire intrahépatique et le rôle des corticoïdes dans la régulation de la sécrétion de cholangiocyte.
Réplétion Acides Biliaires Appauvrissement Règlent Cholangiocyte Croissance Et Sécrétion Par Une Voie De Phosphatidylinositol 3-kinase-dépendante Chez Les Rats
Nous avons testé l'hypothèse que lors de l'obstruction des canaux biliaires, augmentation des acides biliaires biliaires déclencher cholangiocyte la prolifération et la sécrétion par une phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K)-voie dépendante.
Inhibition Dopaminergique De La Cholérèse Stimulée Par La Sécrétine Par Expression Accrue De La PKC-gamma Et Diminution De L'activité De La PKA
Pour déterminer le rôle et les mécanismes d'action par laquelle dopaminergique innervation module canalaire sécrétion chez les rats de ligature des canaux biliaires, nous avons déterminé l'expression des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 cholangiocytes. Nous avons évalué si D1, D2 (quinelorane), ou influencent les agonistes des récepteurs dopaminergiques D3 basale et stimulée par la sécrétine cholérèse et lumen expansion unités biliaires (IBDU) et les taux d'AMPc dans cholangiocytes en absence ou en présence de BAPTA-AM, chélérythine, 1-(5-isoquinolinylsulfonyl)-2-méthyl pipérazine (H7) ou le rottlerin. Nous avons évalué si 1) quinelorane effets sur la sécrétion de canal artériel ont été associés à l'augmentation de l'expression des isoformes PKC dépendante Ca(2+) et 2) augmentation de l'expression de la PKC causes l'inhibition de l'activité de la PKA. Quinelorane inhibe in vivo la cholérèse stimulée par la sécrétine et espace lumen IBDU, taux d'AMPc et l'activité de la PKA dans cholangiocytes. Les effets inhibiteurs du quinelorane sur l'activité de la PKA et de sécrétine-canalaire sécrétion stimulée par ont été bloqués par BAPTA-AM, chélérythine et H7. Quinelorane effets sur la sécrétion de canal artériel ont été associées à l'activation de la PKC-gamma Ca(2+)-dépendant mais pas autres isoformes PKC. Le système nerveux dopaminergique counterregulates canalaire sécrétion stimulée par la sécrétine cholestase expérimentale.
Hypercholérèse Taurohyodeoxycholate Et Le Tauroursodésoxycholate-induite Est Augmentée Chez Les Rats Du Cholédoque Ligaturé
Taurohyodeoxycholate (THDCA) et le tauroursodésoxycholate (TUDCA) induisent plus écoulement de la bile par molécule excrété par rapport aux acides biliaires endogènes. Le but de cette étude est de déterminer si l'effet de hypercholeretic de tauroursodésoxycholate ou taurohyodeoxycholate chez les rats normaux et des canaux biliaires ligaturé (BDL) est due à une sécrétion accrue canalaire.
Facteur De Croissance Nerveuse Module La Capacité De Prolifération De L'épithélium Biliaire Intrahépatique Cholestase Expérimentale
Nous avons évalué l'expression des neurotrophines cholangiocytes de rat et le rôle et les mécanismes par lequel nerf growth factor (NGF) module la prolifération cholangiocyte.
Agonistes Du Récepteur Adrénergique Alpha-1 Modulent La Sécrétion Canalaire De Rats BDL Par Stimulation Heterodimeric Et De PKC Dépendante Du CAMP
L'acétylcholine potentialise la sécrétine-canalaire sécrétion stimulée par Ca(2+) la calcineurine-induite par la modulation de l'adénylcyclase. Agonistes des récepteurs dopaminergiques D2 inhibent la sécrétion de ductal stimulée par la sécrétine via l'activation de la protéine kinase C (PKC)-gamma. Il n'existe aucune information concernant l'effet des agonistes des récepteurs adrénergiques sur la sécrétion canalaire dans un modèle de la cholestase induite par la ligature du canal cholédoque (BDL). Nous avons évalué l'expression d'alpha-1 a/1 C, - 1beta et récepteurs adrénergiques bêta-1 dans les sections du foie et cholangiocytes de normale et de rats de la BDL. Nous avons évalué les effets des agonistes des récepteurs adrénergiques alpha-1 et bêta-1 (la phényléphrine et la dobutamine, respectivement) biliaires et bicarbonate de sécrétion et cholangiocyte IP(3) heterodimeric niveaux et en normal et les rats de la BDL. Nous avons mesuré l'effet de la phényléphrine sur expansion de lumière en unités biliaires (IBDUs) et le taux d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dans cholangiocytes de rats BDL en l'absence ou la présence de BAPTA / AM et Gö6976 (un inhibiteur de la PKC-alpha). Nous avons évalué si les effets de la phényléphrine sur la sécrétion de ductal étaient associées de la translocation des isoformes PKC entraînant une activité accrue de protéine kinase. Les récepteurs adrénergiques alpha-1 et bêta-1 étaient présents principalement dans le domaine basolatéral des cholangiocytes et, suivant BDL, leur expression a augmenté. La phényléphrine, mais pas la dobutamine, a augmenté la cholérèse stimulée par la sécrétine chez les rats de la BDL. La phényléphrine ne modifiait pas basale mais stimulée par la sécrétine IBDU lumen expansion et cAMP accrus, qui ont été bloqués par BAPTA / AM et Go6976. Phényléphrine augmente les niveaux IP(3) et heterodimeric et activation de la PKC alpha et bêta-PKC-II. Coordonné en conclusion, régulation de la sécrétion canalaire de sécrétine (par cAMP) et l'activation agoniste du récepteur adrénergique (par le biais de Ca(2+)/PKC) induit la sécrétion de bicarbonate canalaire maximale dans les maladies du foie. (On trouvera des données supplémentaires pour cet article sur le site Web de l'HÉPATOLOGIE (http://interscience.wiley.com/jpages/0270-9139/suppmat/index.html).
L'épithélium Biliaire Intrahépatique Est Une Cible De L'hormone De Croissance/insulin-like Growth Factor 1 Axe
Nous avons évalué le rôle et les mécanismes par lequel l'axe GH/IGF1 module cholangiocyte prolifération.
Administration De VEGF-r-A Prévient Les Dommages D'induite Par La Ligature Des Canaux Biliaires Artère Hépatique Chez Le Rat Du Cholédoque Ligaturé
L'artère hépatique, par le plexus péribiliaires, nourrit l'arbre biliaire intrahépatique. Au cours de la cholestase obstructive, les besoins nutritionnels des voies biliaires intrahépatiques sont augmentées en raison de la prolifération accrue ; en effet, le plexus péribiliaires (PBP) affiche expansion adaptative. Les effets de la ligature de l'artère hépatique (HAL) sur les fonctions de cholangiocyte au cours de la cholestase sont inconnus, bien que les lésions ischémiques de l'arbre biliaire compliquent le cours des foies greffés et sont rencontrent dans les cholangiopathies. Nous avons évalué les effets de HAL sur les fonctions cholangiocyte dans experimental cholestase induite par la ligature du cholédoque (BDL). À l'aide de la BDL et BDL + HAL rats ou BDL + HAL des rats traités avec recombinant-vasculaire endothélial facteur de croissance-A (r-VEGF-A) pour une semaine, nous avons évalué le degré de fibrose portale de l'inflammation et periductular, microcirculation, cholangiocyte l'apoptose, la prolifération et la sécrétion de la morphologie du foie,. Microcirculation a été évaluée à l'aide d'un microscope électronique à balayage technique de corrosion vasculaire cast. HAL induite chez le rat BDL 1) la disparition de la PBP, 2) a augmenté l'apoptose et la prolifération des cholangiocyte ayant une déficience et stimulée par la sécrétine canalaire sécrétion et 3) diminution de la sécrétion de VEGF cholangiocyte. Les effets de HAL sur les fonctions PBP et cholangiocyte ont été empêchés par r-VEGF-A, qui, en maintenant l'intégrité de la prolifération de PBP et cholangiocyte, prévient les dommages des voies biliaires après une lésion ischémique.
Facteur De Croissance Endothélial Vasculaire Stimule La Prolifération Cholangiocyte Rat Via Un Mécanisme Autocrine
Facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) est sécrétée par l'épithélium plusieurs et module de fonctions cellulaires par des mécanismes autocrine et paracrine. Le rôle du VEGF dans la physiopathologie de la cholangiocyte est inconnu. Nous avons évalué le rôle du VEGF dans la régulation de la prolifération des cholangiocyte chez le rat qui a subi une ligature du canal cholédoque.
Oestrogènes Et Insulin-like Growth Factor 1 Modulent La Croissance Des Cellules Néoplasiques Dans Le Cholangiocarcinome Humain
Nous avons étudié l'expression des récepteurs d'oestrogène (ERs), insulin-like growth factor 1 (IGF-1), et les lignes de IGF-1R (récepteur) dans le cholangiocarcinome humain et cellule de cholangiocarcinome (HuH-28, FO-1, Mz-ChA-1), l'évaluation du rôle des oestrogènes et d'IGF-1 dans la modulation de la croissance des cellules néoplasiques. ER-alpha, bêta-ER, IGF-1 et IGF-1R ont été exprimé (immunohistochimie) dans toutes les biopsies (18 sur 18) de cholangiocarcinome intrahépatique. ER-alpha a été exprimée (Western blot) que par la lignée de cellules HuH-28 (cholangiocarcinome intrahépatique), alors que le bêta-ER, IGF-1 et IGF-1R ont été exprimés dans les trois lignées cellulaires examinées. Dans les cellules HuH-28 privés de sérum, réadmission sérum induite par la stimulation de la prolifération cellulaire qui est inhibée par les antagonistes de l'ER et IGF-1R. 17beta-oestradiol et IGF-1 stimulent la prolifération des cellules HuH-28 dans une mesure similaire à celle de MCF7 (cancer du sein) mais supérieure à celle de FO-1 et Mz-ChA-1, inhibition de l'apoptose et en exerçant des effets additifs. Ces effets de 17beta-oestradiol et d'IGF-1 ont été associés à l'expression de la protéine accrue d'ER-alpha, phosphorylée (p)-ERK1/2 et pAKT mais avec a diminué l'expression de ER-beta. Enfin, la transfection des oligonucléotides anti-sens de IGF-1R dans les cellules HuH-28 a nettement diminué la prolifération cellulaire. En conclusion, cholangiocarcinomes intrahépatiques humaines exprimant des récepteurs d'oestrogènes et d'IGF-1, qui coopèrent dans la modulation de la croissance cellulaire et l'apoptose. Modulation de l'ER et IGF-1R pourrait représenter une stratégie pour la gestion de cholangiocarcinome.
Résultats De L'homme D'isolement Des îlots De Pancréas Conservé Avec Histidine-tryptophane Ketoglutarate Versus Université Du Wisconsin Solution
Cette étude a été conçue pour comparer histadine-tryptophane-Ketogluterate (HTK) avec l'Université du Wisconsin (UW) solution. Pancréas de donneurs critères étendus ont été vidées et transportées avec HTK (n = 41) ou UW (n = 45). Résultats d'isolement ont été déterminées par les rendements des îlots de Langerhans, la viabilité et in vitro et in vivo de la fonction. Rendements finaux étaient similaires entre les deux groupes (HTK: 383085 vs UW: 328514 EIN, P = 0,14). Dans le groupe HTK, 63,4% (26/41) des isolements conduit à un rendement de plus de 300.000, et dans le groupe UW cela a été réalisé dans 46,7% (21/45, P = 0,12). Les résultats de viabilité ont été similaires (HTK: 82,9 vs UW: 82,7%, P = 0,93). Indice de stimulation dans les groupes de HTK et UW étaient comparables (5,28 vs 4,91, P = 0,62). Dix des 41 préparations d'îlots dans HTK et 4 de 45 dans le groupe UW étaient aptes à la transplantation clinique (P = 0,05). Notre étude montre HTK est équivalente à la solution UW dans la préservation de pancréas pour l'isolement des îlots.
Amélioration De La Purification Des îlots Humains Pancréatique Avec Le Gradient De Densité De L'UIC-UB Raffiné
L'homme les résultats d'isolement des îlots de Langerhans ont été comparés entre les deux méthodes de purification; 32 pancréas ont été traitées par la méthode classique de purification Biocoll (SM, méthode standard) et 132 pancréas par une université raffiné de l'Illinois à Chicago UW / Biocoll méthode (UIC-UB). Il n'y avait pas de différence dans les caractéristiques des donneurs entre les deux groupes d'étude. Le nombre d'îlots équivalent prépurification était similaire entre les groupes (359 425 + numéro / -40794 îlot équivalent en SM vs 370 682 + / -17 579 dans l'UIC-UB). SM îlots purifiés ont été principalement collectées dans seulement 2 des 12 fractions (68,9% et la pureté de 36,3%). Avec les UIC-UB, îlots hautement purifiés ont été recueillies dans 6 des 12 fractions séparées (fractions 3-8 avec une pureté de 84,8%, 82,5%, 72,0%, 59,3%, 46,8% et 36,2%). UIC-UB a donné un rendement significativement plus élevé par rapport îlot avec SM (368 419 + / -18 245 260 908 vs + / -37 835, P = 0,017). Taux de récupération Islet était supérieur dans l'UIC-UB (84,9% vs 64,5%, P = 0,04). Notre étude démontre une reprise supérieure de haute pureté îlots pancréatiques humains après purification en utilisant la méthode raffinée de l'UIC-UB gradient.
Augmentation De La Concentration D'albumine Et De La Fonctionnalité Réduit Apoptose Améliore D'îlots Humains
Fournir de masse suffisante d'îlots est important pour la transplantation d'îlots de succès. L'apoptose joue un rôle majeur dans l'après-mort de la cellule d'isolement d'îlots, et la prévention de l'apoptose pourrait améliorer les résultats des transplantations. Le but de cette étude était de déterminer si la concentration accrue de l'albumine humaine (HA) dans la culture pré-transplantation d'îlots humains permettrait de réduire l'apoptose. Îlots de l'homme ont été cultivées dans CMRL avec 1,5 ou 5% de HA pour 24 h et de l'apoptose a été évaluée indirectement par la mesure de l'activité caspase 3 et tétraméthylrhodamine-éthyl-ester (TMRE) dans les îlots dissociées. La fonction des îlots et la viabilité ont été évalués. Îlots cultivés dans la concentration d'albumine supérieur présenté inférieure caspase 3 activité (43,9 + / - 3,9 vs 67,4 + / - 11,1, p = 0,011), et avait une capacité accrue de sécrétion d'insuline (3,76 indice de stimulation + / - 0,91 vs 1,23 + / - 0,21, p = 0,023). Nous concluons qu'une augmentation de la concentration de l'albumine peut empêcher l'apoptose dans les îlots humains isolés. Ces résultats peuvent avoir des implications pour les résultats de la transplantation des îlots de Langerhans.
L'encapsulation Des îlots Humains En Nouveaux Inhomogènes Alginate-Ca2 + / Ba2 + Microbilles: in Vitro Et in Vivo La Fonction
La microencapsulation peut permettre à l'immunosuppression sans la transplantation d'îlots. Ici nous avons examiné si des îlots humains peuvent être expédiés en toute sécurité à une installation de base d'encapsulation et de maintenir à distance in vitro et in vivo la fonctionnalité. En non-encapsulés îlots avant et après l'expédition encapsulée îlots, la viabilité était de 88,3 + / -2,5 et 87,5 + / -2,7% (n = 6, p = 0,30). Indice de stimulation après une incubation de glucose statique était de 5,4 + / -0,5 et 6,3 + / -0,4 (n = 6, p = 0,18), respectivement. Après la transplantation intrapéritonéale, à long terme normoglycémie a été systématiquement réalisé avec 3.000, 5.000, et 10.000 IEQ encapsulé îlots humains. Lors de la transplantation 1000 IEQ, souris retourné à l'hyperglycémie après 30 à 55 (n = 4/7) et 160 jours (n = 3/7). Souris transplantées ont montré l'homme de tolérance au glucose par voie orale avec des niveaux de glucose inférieurs à ceux des souris témoins non diabétiques. Capsules récupéré après la transplantation étaient intacts, avec une prolifération minime. Cette étude montre que les îlots de l'homme a maintenu la viabilité et in vitro la fonction après l'encapsulation et la inhomogène alginate-Ca (2 +) / Ba (2 +) des microbilles permettent à long terme in vivo îlot de fonction du greffon humain, en dépit de longues distances d'expédition.
Capacité Fonctionnelle Des îlots Humains Après De Longues Distances D'expédition Et D'encapsulation
Îlots de l'homme produits à un centre d'isolement sont expédiées aux chercheurs, le plus souvent en prenant de courtes périodes pour arriver à leur destination. Dans cette étude, nous avons examiné si des îlots humains après l'expédition de longue distance à travers l'océan Pacifique pour 2 à 3 jours et l'encapsulation ont pu maintenir leur fonctionnalité.
À Long Terme Métaboliques Et Immunologiques De Suivi Des Patients Nonimmunosuppressed Avec Diabète De Type 1 Traités Avec Allogreffes Islet Microencapsulés: Quatre Cas
Afin d'évaluer à long terme métabolique et immunologique suivi des micro-encapsulés allogreffes d'îlots humains chez des patients nonimmunosuppressed diabétiques de type 1 (DT1).
Hautement Purifiée Versus Filtré Collagénase Brut: L'homme Comparables Les Résultats D'isolement Des îlots
Cette étude a été conçue pour comparer l'impact a posteriori de pétrole brut de la collagénase Sigma V (Sigma V, n = 52) à haute purifié collagénase Serva NB1 (Serva NB1, n = 42) sur l'homme les résultats d'isolement des îlots de Langerhans. Une filtration en trois étapes a été appliquée au brut V Sigma pour éliminer la contamination d'endotoxine et les impuretés, en outre, ce processus a été utilisé comme outil de présélection beaucoup. Résultats d'isolement ont été déterminées par l'efficacité de digestion, les rendements des îlots de Langerhans, la pureté, la viabilité, stimulée par le glucose libération d'insuline, et la teneur en endotoxines. L'efficacité de digestion entre Sigma V et Serva NB1 était statistiquement significative (Sigma V: 64,71% vs Serva NB1: 69,71%, p = 0,0014). Toutefois, les rendements des îlots étaient similaires (Sigma V: 23422,58 vs Serva NB1: 271097 IEQ, p = 0,23) entre les groupes. Il n'y avait pas de différence significative observée dans la pureté des fractions ayant des puretés supérieures à 75%. Viabilité (Sigma V: 93,3% vs Serva NB1: 94,8%, p = 0,061) et les indices de stimulation (Sigma V: 3,41 vs Serva NB1: 2,74, p = 0,187) étaient également similaires entre les deux groupes. L'impact de l'ischémie froide et l'âge sur les résultats d'isolement dans le groupe Sigma V était comparable au groupe Serva NB1. Le contenu en endotoxines des produits finaux dans le groupe Sigma V filtrée était significativement inférieure à celle dans le groupe de haut-purifié Serva NB1 (0,022 UE / ml vs 0,052 EU / ml, p = 0,003). En outre, dans le groupe Sigma V, il était beaucoup minime à la variation du lot et aucune perte significative de l'activité enzymatique après filtration. Ces résultats indiquent que l'utilisation de Sigma V ou d'autres mélanges d'enzymes brutes pour la recherche pancréas est justifié de réduire les coûts d'isolement et d'augmenter la quantité d'îlots disponibles pour la recherche îlot critique. Ces résultats valident également la nécessité d'une analyse par des enzymes systématique pour résoudre ces incohérences dans la qualité de l'enzyme ensemble une fois pour toutes.
