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Articles by Barbara Leuchs in JoVE
JoVE Immunology and Infection
重组细小病毒与腺病毒派生系统的帮助下高效生产
1Tumour Virology Division F010, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Inserm Unit 701, German Cancer Research Center (DKFZ)
在这里，我们描述只对细胞的感染，从而提高重组细小的生产效率超过100倍相比，在使用中的其他协议为基础的协议。此协议依赖于使用一种新型腺病毒含有的细小副总裁转录单位（AD-VP）5，基于辅助。
Other articles by Barbara Leuchs on PubMed
改进的转录和调控的腺相关病毒载体靶向心脏基因转移。
基于重组腺相关病毒 (腺相关病毒-2) 2 向量是心脏基因转移一个有前途的工具。但是，潜在的治疗应用需要考虑肝脏的主导转导一旦腺相关病毒 2 向量进入体循环。因此，我们旨在通过结合转录和细胞表面针对提高效率和特异性的心矢量交货。
鼻内接种疫苗对人乳头瘤病毒的重组腺相关病毒类型 5 键入 16 L1。
腺相关病毒 (腺相关病毒) 已制订和评估作为重组载体的基因治疗在许多临床前的研究中，以及在临床试验中。然而，只有几种方法已用于重组腺相关病毒 (rAAV） 提供疫苗抗原。我们生成编码主要衣壳蛋白 L1 腺相关病毒 (L1h) 从人类乳头瘤病毒类型 16 (HPV16)，旨在开发一种预防性疫苗 HPV16 感染，这是全世界妇女宫颈癌的主要原因。RAAV5 L1h 经管鼻黏膜给药单剂量不足以促使高滴度的 L1 特异性血清抗体，以及阴道冲洗粘膜抗体。血清被保持至少 1 年。此外，免疫接种后仍然可检测到 60 周细胞免疫反应。此外，成功冻干 rAAV5 L1h 诱发小鼠系统性和粘膜免疫反应。这些数据清楚地表明 HPV16 重组 rAAV5L1h 矢量佐剂，无须单剂量鼻内接种的效果。
溶瘤小鼠自主细小病毒基因治疗脑胶质瘤的候选矢量是无毒无害的正常和免疫小鼠神经胶质细胞。
脑肿瘤细胞与野生型或重组 parvoviruses H1 光伏和 MVMp 的敏感性使成为有希望的候选人的星形细胞瘤的基因治疗这些代理。此应用程序将引发是否 parvoviruses 施加有害或肿瘤周围的正常神经胶质细胞旁观者效应的问题。我们处理这一问题在小鼠模型中的使用来自 BALB/c、 C57BL/6 和 VM/Dk 株的细胞培养。星形胶质细胞和小胶质细胞文化的很大一部分是主管 MVMp 吸收。但是，感染是败在不少于 10%的星形胶质细胞发生复制关联的病毒蛋白质合成以及没有后代 virions 制作了。这种限制更为明显的小胶质细胞在其中没有病毒蛋白的表达可能无法检测到保存为 VM Dk 派生的单元格的九牛一毛。MVMp 感染没有产生重大的影响，对神经胶质细胞存活和不干涉其免疫的潜力。事实上，既不内毒素 （LPS） / 干扰素 (干扰素-γ)-致 VM Dk 派生实现鼠标 （MT539MG） 胶质瘤细胞、 小胶质细胞的细胞毒性也没有肿瘤坏死因子 α 生产后 LPS 刺激或 LPS 干扰素伽马刺激神经胶质细胞的能力受到感染与 MVMp。此外，与脂多糖和/或干扰素 γ 刺激导致减少病毒的繁殖和细胞毒蛋白 NS1 的表达式中。在一起，我们的数据表明，在自然宿主中，正常的神经胶质细胞大部分都不是主管 MVMp 复制和在这些单元格的一小小部分发生的流产感染未能阻碍他们的生存和免疫活性，信贷给予自主 parvoviruses 脑胶质瘤治疗的审议。
腺相关病毒 2 型 Capsids 与外在化 VP1/VP2 贩运域生成之前通过细胞质和维持直到脱壳发生在细胞核中。
细小病毒 capsids 的共同特点是打开毛孔在遍历病毒体壳五倍的对称轴。对有限热处理体外，毛孔可以作为门户网站得以具体化的港湾感染有关的功能域例如，A(2) 磷脂酶催化域 VP1/VP2 蛋白 N 端序列。在这里我们显示 （AAV2） 2 型腺相关病毒还公开其感染，大概是在 endosomal 车厢过程中体内的 VP1/VP2 N 总站。这种构象变化受到治疗 lysosomotropic 试剂。虽然 bafilomycin A1 单元格的孵化减少暴露的 VP1/VP2 N 总站，孵化与氯喹短暂刺激外化。N 身患位于基本氨基酸集群与核定位活动也成为暴露在这个过程中，可访问关于病毒衣壳当它进入细胞质。这是一个强制性的步骤，AAV2 感染。然而，这些序列中核易位的病毒性 capsids 直接作用无法的野生型或突变病毒显微注射法确定。这表明进一步修改的衣壳核条目编写病毒的 precytoplasmic 项步骤中进行。注射细胞核成几个衣壳特异性抗体阻止 AAV2 感染完全支持 AAV2 capsids 携带原子核的传染性基因组的结论。
武装 Parvoviruses 与 CpG 序列，以改善其 Oncosuppressive 的能力。
溶瘤病毒是癌症治疗的新型工具。除了专门杀死癌细胞 (裂)，这些代理还提供的危险信号，提示免疫系统消灭病毒感染的肿瘤。溶瘤事件导致先天和自适应免疫系统访问肿瘤抗原，这导致跨吸和接种疫苗的效果。我们的目的是要看看是否我们可以加强这种佐剂性能力通过免疫刺激 CpG 序列纳入单绞溶瘤 (H 1PV） 细小病毒的基因组。我们工程 2 中央人民政府富 H 1PV 变种 （JabCG1 和 JabCG2），保留复制能力和父母的病毒的溶瘤功能。根据其增加的中央人民政府内容，JabCG1 和 JabCG2 基因组证明要更有力触发器的单反 9 介导信号比野生型 H 1PV DNA 的体外。具有抗癌活性评为 MH3924A 肝癌肺转移，与父母或修改过的病毒感染在担任前模型大鼠体内皮下管理自体造血细胞疫苗的佐剂。在此设置中，不包括对转移直接溶瘤作用，JabCG2 矢量显示增强免疫原性，诱导细胞免疫 （伽玛干扰素） 和树突状细胞激活 (CD80、 CD86) 的标记 (肿瘤排水） 的纵隔淋巴结。这导致大大减少转移率 （50%） 与其他疫苗接种时间表 (H-1PV-JabCG1、 JabGC 或模拟处理的单元格）。数据提供原则，即增加免疫刺激 CpG 序列内溶瘤病毒的数量使它能够改善其整体抗癌效果诱导抗肿瘤免疫接种的证明。
杀害的 P53 缺陷型肝癌细胞的细小病毒 H 1 和化疗药物需要早幼粒细胞白血病蛋白。
评价的协同靶向和杀害的肝细胞癌 (HCC) 细胞缺乏 p53 由溶瘤自主细小病毒 (PV) H-1 和化疗代理和功能性早幼粒细胞白血病蛋白 (PML) 的依赖。
通过溶瘤细小病毒 H 1PV 胰腺癌吉西他滨为基础治疗的改进。
胰腺癌是消化道恶性肿瘤预后不良。治疗与吉西他滨，最有力的化疗对这种癌症最新的不是治疗，并且可能出现阻力。作为一个创新的选项出现溶瘤病毒，是传染性，但在人类病源，H-1PV，大鼠细小病毒病等的辅助治疗。
结合预防和治疗鼻内接种疫苗对人乳头瘤病毒类型-16 使用不同的腺相关病毒血清型载体。
宫颈癌是全世界的女人的第二最常见癌症，被认为由高危乳头状瘤病毒感染引起的。使用重组腺相关病毒 (rAAV) 载体的遗传免疫表明 (HPV) 感染人类乳头瘤病毒疫苗接种前景一片光明。
细小病毒 H1 有选择性地诱导神经母细胞瘤细胞的毒性作用。
多式联运的治疗概念，尽管先进本地化和高危神经母细胞瘤仍是治疗挑战与长期存活率低于 50%。因此，迫切需要治疗神经母细胞瘤，如溶瘤 virotherapy 的新模式。H 1PV 是啮齿动物的细小病毒没有受感染的成年动物的有关致病作用。相比之下，这种病毒有溶瘤属性，特别是各种物种包括人类起源细胞转化或源性肿瘤细胞的细胞毒。在这里，我们进行了治疗神经母细胞瘤细胞溶 H 1PV 瘤的应用体外临床前评估。感染效率、 病毒复制和裂解活性的 H 1PV 的分析在不同 MYCN 状态 11 神经母细胞瘤细胞株。Oncoselectivity 病毒确认了短期内文化不同来源的恶性婴儿细胞的感染。在这些 nontransformed 的单元格中，发现 H 1PV 上生存能力没有影响或细胞形态。相比之下，在审查 mois 》 杂志在 0.001 和 10 的 pfu 单元格之间的所有神经母细胞瘤细胞系中裂解的感染被引起。H 1PV 积极与病毒滴度达 5,000-fold 48-96 小时内感染后提出增加复制。H 1PV 溶菌作用有人认为独立的 MYCN 基因扩增或分化状态。此外，可以表明一个重大的 G2 逮捕和诱导细胞凋亡。感染效率、 病毒快速复制和详尽无遗的溶效果，对神经母细胞瘤细胞与低毒性的 H 1PV nontransformed 单元格，使这细小病毒溶瘤 virotherapy 神经母细胞瘤有希望的候选人。
重组腺相关病毒的表征键入 2 引用标准材料。
重组腺相关病毒血清型 2 参考生产标准物质 (rAAV2 RSM) 并将其目的是提供一个参考标准粒子效价、 基因组，滴度矢量和感染性滴度为 AAV2 基因转移载体的特点。生产和纯化的参考材料是由助手无病毒瞬时转染和色谱纯化进行的。纯净的散装材料是 vialed、 证实不利的微生物污染，然后分发以及标准检测协议和向世界各地的 16 实验室检测试剂的表征。使用统计转换和建模的原始数据，意味着滴度和置信区间被确定为衣壳粒子 ({X}，9.18 x 10 粒子/ml ； 95%的置信区间 [CI] 78.9 x 10 到 1.05 x 10 粒/毫升），矢量基因组 ({X}，3.28 x 10¹⁰ 矢量基因组/ml ； 95 %ci，至 4.75 x 10¹⁰ 2.70 x 10¹⁰ 矢量基因组/ml)，氙气单位 (X {}、 5.09 x 10⁸ 传感单位/毫升;95 %Ci，2.00 x 10⁸ 到 9.60 x 10⁸ 氙气单位/毫升） 和传染性单位 ({X}、 4.37 x 10⁹ TCID₅₀ IU/ml ； 95 %ci，至 9.26 x 10⁹ TCID₅₀ 2.06 x 10⁹ IU/ml)。进一步分析证实身份的参考材料作为 AAV2 和 nonvector 蛋白作为大于 94%相对纯度。定量数据中的一个明显趋势是差异的尽管相对紧密的相关性的检测结果在一个机构内每个检定机构之间的程度。这种相对较差的实验室间的精度和准确性程度是明显的即使试图通过提供详细的协议和共同试剂标准化检测方法。这是彻底记载了这种变异实验室之间的首次，调查结果强调领域中通用的参考标准。RAAV2 RSM 交存美国类型文化集合，可向科学界要校准实验室特定内部效价标准。预计的使用 rAAV2 RSM 的讨论。
筛选肿瘤抗原基因的 CD4 T 细胞抗原表位的 HLA 转基因小鼠、 重组腺病毒和抗原肽库的组合。
如肿瘤抗原特异性 CD4 + T 细胞可以调解黑色素瘤病人强治疗抗肿瘤反应我们定出建立一个全面的检查，战略的肿瘤特异性 CD4 + T 细胞表位适合检测、 隔离和扩大患者肿瘤活性 T 细胞识别。
IL-10 和 MCP-1-7ND 基因转移与保护 AAV9 载体从小鼠自身免疫性心肌炎的比较。
与潜在疾病限制的影响，特别是炎症的现场，治疗作用的基因的过度表达仍然是炎症的临床的一大挑战。在此研究中，我们调查的腺相关病毒 (腺相关病毒）-9 潜力-介导的抗炎调解人白细胞介素 (IL)-10 心脏表达和单核细胞趋化蛋白-1 的 (MCP1-7ND) 预防自身免疫性心肌炎的显性负抑制剂。
由细小病毒 H-1 鼻内应用程序模型大鼠脑胶质瘤的回归。
在以往的研究中，我们表明 apathogenic 大鼠细小病毒 H-1 (H 1PV) 是能够诱使的回归先进症状性大鼠与人脑胶质瘤在大鼠模型中，当病毒被注入肿瘤 (intracranially) 或静脉滴注。H 1PV 感染没有引起任何病理癌旁组织中。这项研究解决的问题包括是否还鼻中的应用这种溶瘤病毒是适当和足够治疗脑胶质瘤在此动物模型。
心脏 AAV9 S100A1 基因治疗救助缺血后心脏衰竭在临床前的大动物模型。
作为临床应用的先决条件，我们确定的长期疗效和安全性腺相关病毒 (腺相关病毒）-S100A1 基因治疗心衰的临床前期大动物模型中。S100A1、 心肌收缩力，积极肌力调节器变得枯竭未在人和动物的心肌细胞和心肌靶向 S100A1 基因转移营救心脏收缩功能通过还原肌浆网钙 （Ca(2+)) 中敏锐地和长期未心小动物模型中的处理。我们在国内猪心衰所致左扬抑冠状动脉球囊闭塞导致心肌梗死。2 周后，猪只显示巨大左心室收缩功能不全时，我们经管，逆行冠状动脉静脉交付、 腺相关病毒血清型 9 (AAV9)-向左心室、 非心肌梗死心肌的 S100A1。AAV9-荧光素酶和盐水治疗作为控制。14 周，在这两个控件组显示明显减少心肌 S100A1 蛋白的表达与心脏性能的逐步恶化和左室重构。AAV9 S100A1 治疗阻止和扭转这些功能和结构的变化通过恢复心脏 S100A1 蛋白水平。S100A1 治疗心肌细胞经单车、 肌浆网内质网钙处理和能量稳态实现了正常化。转基因表达仅限于心肌组织和心外脏器功能是不折不扣。此平移的研究显示心衰临床前期模型中的长期疗效的临床前期可行性和心脏 AAV9 S100A1 基因治疗的良好安全配置文件。我们的研究结果提出强有力的理由，S100A1 可能可以补充治疗终末期心衰的当前战略的人类心衰的基因治疗临床试验。
干扰素 γ 提高溶瘤细小病毒 H 1PV 治疗胰腺癌组织中的腹膜癌病的疫苗接种潜力。
溶瘤病毒与专门在复制和杀死肿瘤细胞的能力成为一类新型的癌症疗法。大鼠溶瘤细小病毒 (H 1PV) 用来治疗不同类型癌症的临床前设置中和最近成功结合标准吉西他滨化疗治疗胰腺癌 (PDAC) 在大鼠中。我们以前的工作表明免疫系统，以及尤其是释放干扰素 (IFNγ) 似乎调解 H 1PV 的抗癌效果，在该模型中。因此，我们推断可以提高治疗的 H 1PV 属性了 IFNγ，不治之症后期的 PDAC 像腹膜癌病的治疗。轴承的大鼠建立原位胰头癌与腹膜转移治疗单癌瘤 (i.t.） 或在腹腔内 （） 注射 5 x 10⁸ 斑块形成单位的 H 1PV 有无相应的 IFNγ 应用程序。瘤内注射证明是在控制的原发性胰腺肿瘤和腹膜转移存款从主伴随病毒迁移的增长的腹腔内路由比更有效。RecIFNγ H 1PV 伴随腹腔治疗导致收益扩展的动物生存，相比 H-1PV 仅通过腹腔治疗提高疗效。IFNγ 应用程序导致腹水中的 H1 光伏破获抗体滴度显著减少的同时增强的 H-1PV 诱导腹膜巨噬细胞和脾细胞反应对肿瘤细胞。因此，与 H 1PV IFNγ 协办可能被视为改善 PDAC 腹膜癌病患者的生存的新治疗选择。
激活人体的免疫系统，通过化疗或有针对性的代理商结合溶瘤细小病毒 H-1。
细小病毒 H-1 (H 1PV) 感染并裂解包括黑色素瘤、 肝癌、 胃癌、 大肠癌、 宫颈和胰腺癌的肿瘤细胞。我们评估是否可以与 H 1PV 的溶瘤和 immunostimmulatory 属性合并化疗药物或有针对性的代理人的有利影响。
大鼠细小病毒 H 1PV 对肿瘤细胞通过遗传工程病毒衣壳的重定目标。
大鼠细小病毒 H 1PV 是副作用的有前途的抗癌药在人类赋予其 oncosuppressive 属性和没有已知。H 1PV 优先复制在转化的细胞，但这种病毒可以输入正常和肿瘤细胞。正常细胞吸收固远离肿瘤目标病毒性剂量的很大一部分。因此，针对具体 H 1PV 进入肿瘤细胞是重要的是要增加基于细小病毒病的治疗方法的疗效。在此研究中，我们首次发现，唾液酸 H 1PV 条目中发挥着关键作用。然后，我们转基因 H 1PV 衣壳，改善其对人类肿瘤细胞的亲和力。通过解决的晶体结构密切相关的细小病毒分钟病毒小鼠的类比，我们开发的硅三维 (3D) 模型的 H 1PV 野生型衣壳。我们基于此模型，确定假定氨基酸参与细胞膜识别和病毒进入一级的对称的衣壳，所谓的酒窝区域内二折轴的。这些残留物的原位诱变大大减少的绑定和 H 1PV 进入许可的单元格。工程项缺陷病毒衣壳，然后插入循环 RGD-4 C 肽在其三折轴穗的水平。此肽绑定 α(v)β(3) 和 α(v)β(5) 整合素，抗原在癌细胞和越来越多的血管。插入的肽救出病毒性传染性走向超量表达 α(v)β(5) 整合素，由重新设计病毒造成高效被害，这些单元格的单元格。这项工作演示 H 1PV 可以重基因定向通过其衣壳修改显示在癌症治疗中更有效地利用这种病毒很有前途。
鼻内接种疫苗与 AAV5 和 9 载体对猕猴第 16 型人乳头状瘤病毒。
抽象的宫颈癌是全世界妇女在第二个最常见的癌症。被认定为这种类型的癌症发展的致病事件持续高危人乳头瘤病毒 (HPV) 感染。重组腺相关病毒 (rAAVs) 目前正在编制并评价作为疫苗载体。在以往的工作中，我们表现出小鼠鼻黏膜给药管理 rAAVs 诱导高滴度和持久的中和抗体对人乳头瘤病毒类型 16 (HPV16)。若要扩展到更多与人类相关的物种这种方法，我们与 AAVs 表达在鼻内的预防性设置中使用 rAAV5 和 9 向量 HPV16 L1 蛋白免疫猕猴 (猕猴)。其次，进一步推动了 rAAV9 L1 rAAV5 L1 矢量诱导 L1 特异性血清抗体高效价比单个 rAAV5 L1 免疫。L1 特异性抗体诱发 AAV9 矢量中性的 HPV16 假和持续的至少 7 个月后免疫接种。有趣的是，即使存在高 AAV9 抗体，允许与没有预防的转基因表达的同一血清型的免疫免疫原性鼻中 rAAV9 的应用。六种动物的两个没有回应腺相关病毒介导的鼻内接种疫苗，虽然他们不是容忍，作为这两个发达国家与 HPV16 病毒样颗粒的肌内接种后抗体。这些数据清楚地表明使用而无需辅助 rAAV9 L1 矢量滴鼻免疫的功效。我们从我们的研究结果得出结论 rAAV9 矢量是无创性鼻疫苗接种策略有前途的候选。
