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Articles by Birte Kalveram in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia
Department of Pathology, University of Texas Medical Branch
A la inversa sistema de genética de la cepa del virus de la fiebre del Valle del Rift MP-12 vacuna es una herramienta útil para la creación de nuevas MP-12 mutantes con mayor atenuación e inmunogenicidad. Se describe el protocolo para la generación y caracterización de cepas mutantes Sociedades Nacionales.
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FAT10, Una Señal De Ubiquitina-independiente Para Degradación Proteasomal
FAT10 es un modificador de ubiquitina-como pequeño que está codificado en el complejo principal de histocompatibilidad y es sinérgico inducible por el factor de necrosis tumoral alfa y gamma interferón. Se compone de dos dominios de ubiquitina-como y posee un motivo de diglycine C-terminal libre que se requiere para la formación de conjugados de FAT10. Aquí mostramos que no conjugada FAT10 y un FAT10 conjugado se degradación rápidamente por el proteasoma en una tasa similar. Fusión de FAT10 a la terminal N de proteínas muy duraderas mejora su tasa de degradación tan potentemente como fusión con ubiquitina. Fusión de la proteína fluorescente verde FAT10 proteínas no fueron troceadas pero totalmente degradado, sugiriendo que las enzimas deconjugating FAT10 específicos no estaban presentes en las líneas celulares analizadas. Curiosamente, la prevención de ubiquitylation de FAT10 por mutación de lisinas todos o por la expresión en células ubiquitylation-deficientes no afectó la degradación FAT10. Así, conjugación con FAT10 es una alternativa y ubiquitina-independiente dirigida a mecanismo de degradación por el proteasoma, que, en contraste con poliubiquitinación, citoquina inducible e irreversible.
Los Dominios De La UBA De NUB1L Se Requieren Para El Enlace Pero No Para La Aceleraron Degradación De Los Modificadores De Ubiquitina-como FAT10
Seleccionado para la degradación de proteínas están marcadas con múltiples moléculas de ubiquitina y posteriormente son divididas por el proteasoma S 26. Una familia de proteínas que contienen al menos un dominio (UBA) de ubiquitina-asociados y un dominio de ubiquitina-like (UBL) han demostrado actúan como receptores solubles de la ubiquitina del proteasoma S 26 e introducir un nuevo nivel de especificidad en el sistema de degradación. Ellos unen proteínas ubiquitylated través de sus dominios de la UBA y el proteasoma S 26 mediante su dominio UBL y facilitan el contacto entre el sustrato y proteasa. NEDD8 último buster-1 largo (NUB1L) pertenece a esta clase de proteínas y contiene una UBL y tres dominios de la UBA. Recientemente informamos que NUB1L interactúa con el modificador de ubiquitina-como FAT10 y acelera su degradación y de sus conjugados. Aquí demostramos que un mutante de eliminación de NUB1L falta el dominio UBL es todavía capaz de enlazar FAT10 pero no el proteasoma y ya no acelera la degradación de la FAT10. Una versión de NUB1L que carecen de los tres dominios de la UBA, por el contrario, pierde la capacidad de enlazar FAT10 pero es todavía capaz de interactuar con el proteasoma y acelera la degradación de FAT10. La degradación de un mutante de FAT10 que contiene sólo el dominio c-terminal UBL también todavía se acelera por NUB1L, a pesar de que las dos proteínas no interactuar. Además, demostramos que FAT10 y uno de sus dominios UBL solos pueden interactuar directamente con el proteasoma S 26. Proponemos que la NUB1L no sólo actúa como un enlazador entre los 26 S proteasoma y ubiquitina-como proteínas, sino también como un facilitador de degradación proteasomal.
El Modificador De Ubiquitina-como FAT10 Interactúa Con HDAC6 Y Localiza a Aggresomes Bajo La Inhibición Del Proteasoma
Durante el estrés del mal-proteína, la proteína citoplásmica Histona deacetilasa 6 (HDAC6) funciona como un enlazador entre el motor de la dineína y la poliubiquitina para mediar el transporte de carga de polyubiquitylated a la aggresome. Aquí, identificamos a un nuevo enlace socio de HDAC6, el modificador de ubiquitina-como FAT10 (también conocido como UBD), que es inducible por citocina y - similar a la ubiquitina - sirve como una señal para degradación proteasomal. In vivo, las dos proteínas sólo interactuaron en condiciones de deterioro del proteasoma. La Unión de HDAC6 a FAT10 fue mediada por dos dominios separados: el c-terminal ubiquitin-enlace-dedo de cinc (dominio BUZ) de HDAC6 y su primer dominio catalítico, a pesar de que la actividad catalítica de HDAC6 no fue requerida para esta interacción. Tanto FAT10 endógeno y ectópicamente expresado como el modelo conjugado FAT10-GFP localizada a la aggresome en una forma dependiente de microtúbulos. Además, aggresomes que contienen FAT10 como que contienen ubiquitina fueron reducidos en tamaño y número en fibroblastos HDAC6 deficientes. Concluimos que, si FAT10 no someter sus proteínas Diana a degradación proteasomal, se toma una ruta alternativa para su secuestro y posiblemente también su retiro subsecuente transportándolos a la aggresome mediante la asociación con HDAC6.
Degradación De FAT10 Por El Proteasoma 26S Es Independiente De Ubiquitylation Pero Se Basa En NUB1L
Las proteínas de objetivos de ubiquitina-como modificador FAT10 para la degradación por el proteasoma, un proceso acelerado por la proteína de dominio de UBL-UBA NEDD8 ultimate buster 1-largo. Aquí, demostramos que la degradación mediada por FAT10 ocurre independientemente de poli-ubiquitylation como purificados proteasoma 26S fácilmente degradado FAT10-dihidrofolato reductasa (DHFR) pero no ubiquitin-DHFR in vitro. Curiosamente, el proteasoma 26S sólo podía degradar FAT10-DHFR cuando NUB1L estaba presente. Precipitación de NUB1L atenúa la degradación de FAT10-DHFR en las células intactas, lo que sugiere que la NUB1L determina la tasa de degradación de proteínas FAT10-ligado. En conclusión, nuestros datos establecen FAT10 como una señal dirigida a ubiquitina-independiente pero NUB1L-dependiente para degradación proteasomal.
USE1 Es Una Tienen Que Conjugar La Enzima Ubiquitina Y FAT10, Que FAT10ylates Sí Mismo En Cis
El modificador de ubiquitina-como FAT10 objetivos de proteínas para la degradación por el proteasoma y es activado por la enzima E1 UBA6. En este estudio, identificamos la enzima específica UBA6 E2 (USE1) como un socio de la interacción de FAT10. FAT10 activado se pueden transferir desde UBA6 a USE1 in vitro y endógeno USE1 y FAT10 pueden ser coinmunoprecipitó de las células intactas. Pequeño interferente downregulation mediada por RNA de mRNA USE1 dio lugar a una fuerte reducción de formación conjugada FAT10 condiciones endógenas, sugiriendo que USE1 es una importante enzima E2 en la cascada de FAT10 verbal. Curiosamente, USE1 es no sólo la primera enzima E2, sino también el primer sustrato conocido de FAT10 verbal, como lo fue eficientemente auto-FAT10ylated en cis pero no en trans.
Sociedades Nacionales De Proteínas Del Virus De La Fiebre De Rift Valley Promueve La Regulación a La Baja Postraduccional De La Subunidad TFIIH P62
Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV; familia Bunyaviridae, género Phlebovirus) es un importante patógeno emergente de los seres humanos y los rumiantes. Su proteína NSS ha sido previamente identificado como un importante factor de virulencia que suprime la defensa del huésped a través de tres mecanismos diferentes: que inhibe directamente el interferón beta (IFN-β) promotor de la actividad, que promueve la degradación de la doble hélice de la proteína quinasa dependiente de ARN (PKR) , y se suprime la transcripción de acogida mediante la interrupción de la asamblea de la TFIIH factor de transcripción basal a través del secuestro de su subunidad p44. En este caso, nos informan de que, además de PKR, NSS también promueve la degradación de la subunidad p62 TFIIH. Infección de células con la cepa MP-12 RVFV vacuna redujo los niveles de proteína P62 por debajo del límite de detección temprana en el curso de la infección. Esta regulación a la baja NSS-mediada de p62 era postraduccional, ya que no se vio afectada por la inhibición farmacológica de la transcripción o la traducción y la infección MP-12 tuvo ningún efecto sobre los niveles de mRNA P62. El tratamiento de células con inhibidores del proteasoma, pero no de inhibición de la acidificación lisosomal o exportación nuclear resultó en una estabilización de p62 en presencia de NSS. Además, p62 podría ser coprecipitado con NSS de lisados de células infectadas. Estos datos sugieren que la proteína RVFV NSS es capaz de interactuar con la subunidad p62 TFIIH dentro de las células infectadas y promueve su degradación, lo que puede ocurrir directamente en el núcleo.
