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Articles by Bradford W. Gibson in JoVE

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Une méthode CLHP lectine pour enrichir sélectivement peptides glycosylés d'échantillons biologiques complexes


JoVE 1398 10/01/2009

1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 2, 1, 1

1Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, University of California, San Francisco - UCSF, 2Buck Institute for Age Research, 3Department of Chemistry, Purdue University

Lectine conjuguée perles POROS étaient employés pour la HPLC. Normes glycopeptides ont servi de contrôles positifs et négatifs. MARS-14 appauvri, digérés par la trypsine plasma humain a été chromatographié et accréditives (FT) et les fractions collectées liés à des analyses ESI-LC-MS/MS. Glycopeptides ont été enrichis dans la fraction liée par rapport à FT.

Other articles by Bradford W. Gibson on PubMed

Survie Intracellulaire De Neisseria Gonorrhoeae Dans Les Cellules épithéliales Urétrales Masculins : Importance D'un Lipide Hexaacyl A

Infection and Immunity. Feb, 2002  |  Pubmed ID: 11796626

Neisseria gonorrhoeae est un pathogène humain strict qui envahit et colonise le tractus urogénital des mâles et femelles. Lipooligosaccharide (LOS) s'est avéré de jouer un rôle dans la pathogenèse gonococcique. La transférase acyl MsbB est impliquée dans la biosynthèse des lipides une portion du LOS. Afin de déterminer le rôle d'un lipide intact une structure sur la pathogenèse de N. gonorrhoeae, le gène msbB a été clonée et séquencée, une mutation de suppression et d'insertion a été introduite dans N. gonorrhoeae, et la souche mutante a été désignée 1291A11K3. Les analyses par spectrométrie de masse de LOS 1291A11K3 a déterminé que cette mutation a entraîné un pentaacyl plutôt qu'une structure de lipide A de hexaacyl. Ces analyses ont également démontré une augmentation de la phosphorylation du lipide A et une augmentation de la longueur l'oligosaccharide d'une espèce mineure de la msbB LOS. Les interactions de ce mutant avec les cellules épithéliales urétrales masculins (uec) ont été examinées. Transmission et les études montrent que les mutants msbB forment des associations étroites avec ont été intériorisés par l'uec à des niveaux comparables à ceux de la souche parentale de la microscopie électronique à balayage. Analyses de survie de gentamicine exécutées avec 1291A11K3 et 1291 bactéries a démontré qu'il n'existe aucune différence dans les capacités des deux souches d'adhérer à l'uec ; Cependant, beaucoup moins 1291A11K3 bactéries que les bactéries de la souche mère parasitent d'uec imprégnées de gentamicine. Ces études suggèrent que la modification de lipide A chez le mutant msbB de N. gonorrhoeae peut invalider le plus sensibles aux innée mécanismes intracellulaires de meurtre lorsque internalisés par l'uec.

Haemophilus Influenzae Type B Souche A2 a Impliqué Dans Lipooligosaccharide Sialylation Multiples Sialyltransférases

The Journal of Biological Chemistry. Apr, 2002  |  Pubmed ID: 11842084

Le lipooligosaccharide (LOS) de Haemophilus influenzae contient sialylés glycoformes et une sialyltransférase, Lic3A, a été précédemment identifiée. Nous présentons des preuves pour deux sialyltransférases supplémentaires SiaA et LsgB, qui affectent les glycoformes contenant N-acétyllactosamine. Des mutations dans les gènes que nous avons désigné siaA et lsgB touché seulement les glycoformes sialylés contenant du N-acetylhexosamine. Une mutation de la siaA a entraîné la perte de glycoformes sialyl-N-acetylhexosamine et de l'apparence de glycoformes de poids moléculaire plus élevé, contenant l'ajout de la phosphoéthanolamine, N-acétylgalactosamine et l'acide N-acétylneuraminique. Chromosomique complémentation du mutant siaA soldée par l'expression du phénotype de LOS sialylés original. Une mutation dans lic3A a entraîné la perte de la sialylation dans glycoformes manque de N-acetylhexosamine et n'a aucun effet sur la sialylation de l'épitope terminal de N-acétyllactosamine. Un double mutant siaA et lic3A a entraîné la perte totale de sialylation de l'épitope terminal de N-acétyllactosamine et l'expression de la glycoformes de sialylés poids moléculaire plus élevé vu chez le mutant de la siaA. Mutation de lsgB soldée par persistance de sialylés glycoformes mais une réduction glycoformes contenant N-acétyllactosamine. Un triple mutant de la siaA, lic3A et lsgB ne contenue aucun glycoformes sialylés. Ces résultats démontrent que la sialylation de la LOS de H. influenzae est un processus complexe impliquant plusieurs sialyltransférases.

Le Groupe De Gènes De LbgAB D'Haemophilus Ducreyi Encode Un Beta-1, 4-galactosyltransférase Et Une Alpha-1, 6-DD-heptosyltransférase Impliqués Dans La Biosynthèse Lipooligosaccharide

Infection and Immunity. Jun, 2002  |  Pubmed ID: 12010972

Toutes les Haemophilus ducreyi souches examinées contiennent un lipooligosaccharide (LOS), consistant en un seul mais oligosaccharide de direction variable qui émane hors la première heptose (Hep-je) d'une Hep conservée (3)-phosphorylés acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique lipidiques un noyau. Dans un rapport précédent, identification des gènes de tandem, lbgA et lbgB, qui sont impliqués dans la biosynthèse de LOS a été décrite (Stevens et al., infection. Permis 65:651-660, 1997). Dans une étude distincte, le même groupe de gènes a été identifié et le gène lbgB (losB) s'est avéré nécessaire pour le transfert du second sucre, D-glycéro-D-manno-heptose (DD-Hep), de la structure de la branche principale (Gibson et al., J. gélosées. 179:5062-5071, 1997). Dans cette étude, nous ont identifié la fonction du gène voisin en amont, lbgA et qu'il faut pour l'adjonction de sucre troisième dans la branche dominante oligosaccharide, un beta1 galactose lié--> 4, le DD-Hep. LOS d'un mutant lbgA et un double mutant lbgAB ont été isolés et ont été caractérisés par électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide, analyse des glucides, la spectrométrie de masse et spectroscopie de résonance magnétique nucléaire. Les résultats ont montré que les souches mutantes synthétisent les glycoformes LOS tronquées qui se terminent après l'addition de glucose première (lbgAB) ou le disaccharide JJ-Hepalpha1--> 6Glcbeta1 (lbgA) qui est attaché au noyau heptose. Les deux mutants montrent une réduction significative de la capacité d'adhérer aux kératinocytes humains. Bien que des différences mineures ont été observées après électrophorèse bidimensionnelle des protéines totales provenant des souches de type sauvage et mutantes, les niveaux d'expression de la grande majorité des protéines sont demeurées inchangées, ce qui suggère que les différences dans l'adhésion et l'invasion sont dues aux différences de LOS. Ces études s'ajoute à la preuve de montage pour un rôle de structures de LOS pleine longueur dans la physiopathologie de l'infection à H. ducreyi.

Caractérisation Des Lipooligosaccharides De Haemophilus Ducreyi Contenant Polylactosamine Se Répète

Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Jun, 2002  |  Pubmed ID: 12056572

Haemophilus ducreyi, un pathogène muqueux humain Gram négatif, est l'une des causes principales des ulcérations génitales. Les lipooligosaccharides (LOS) de ces bactéries sont considérées comme un facteur de virulence important et ont été impliqués dans l'adhérence et l'invasion d'h à plusieurs types de cellules humaines. Une souche isogénique heptosyltransférase-III (waaQ) a été récemment construit de H. ducreyi 35000 souche sauvage et immunochimiques et données de poids moléculaire de la LOS isolés ont suggéré la présence de poly-N-acétyllactosamine (LacNAc) (al. Filiatrault, infection. Permis, 2000, 68, 3352-3361). Dans cette étude, les structures de ces nouveaux LOS-glycoformes ont été caractérisés par ionisation laser assistée par matrice (MALDI) et spectrométrie de masse electrospray ionisation (ESI) en combinaison avec la digestion exoglycosidases. Détails structurels a été obtenues pour les portions oligosaccharidiques (OS) de ces LOS montrant entre un à cinq linéaire que LacNAc répète à l'extrémité non réductrice de la branche principale oligosaccharide. Lorsqu'il est cultivé sur un milieu solide, l'organisme produit LacNAc répétitions qui ont été modifiées ultérieurement par l'addition d'acide sialique. Digestion enzymatique avec bêta-galactosidase, bêta-N-acétylhexosaminidase et le type de neuraminidase VI-A ont donné des tronqué glycoformes compatible avec une structure polyLacNAc plafonnée aux différents points de terminaison avec l'acide sialique. ESI-MS/MS spectrométrie de masse sur un instrument de temps de vol quadripolaire a été particulièrement efficace dans l'obtention des informations structurelles détaillées sur les glycoformes moins abondante, massive. LOS contenant di-LacNAc terminal ont été signalés, c'est la première fois à notre connaissance qu'une structure linéaire polyLacNAc a été caractérisée chez les bactéries.

Identification Et Caractérisation Du Gène De La N-acétylglucosamine Glycosyltransferase D'Haemophilus Ducreyi

Infection and Immunity. Oct, 2002  |  Pubmed ID: 12228324

Haemophilus ducreyi est l'agent causal du chancre mou, une maladie ulcéreuse sexuellement. Dans la présente étude, le gène Neisseria gonorrhoeae lgtA lipooligosaccharide glycosyltransferase a permis d'identifier un homologue dans le génome d'h. Le H. ducreyi glycosyltransferase gène (désigné lgtA) a été cloné et préalablement inactivé, et construit un mutant isogénique. Les études structurales ont démontré que le lipooligosaccharide isolé de la souche mutante n'avait pas de N-acétylglucosamine et sucres distales dans le lipooligosaccharide produite par la souche parentale. Le mutant isogénique a été transformé avec un plasmide recombinant contenant le gène putatif glycosyltransférase. Cette souche produit le lipooligosaccharide glycoformes produite par la souche parentale, ce qui confirme que le gène lgtA encode la glycosyltransférase N-acétylglucosamine.

Une Autre Stratégie Pour Déterminer Le Protéome Mitochondrial à L'aide De Fractionnement Gradient De Saccharose Et D 1 PAGE Sur Les Mitochondries De Coeur Humain Hautement Purifié

Journal of Proteome Research. Sep-Oct, 2002  |  Pubmed ID: 12645917

Une stratégie alternative pour la protéomique mitochondriale est décrite qui vient compléter les enquêtes précédentes en utilisant des techniques PAGE 2D. La stratégie implique (a) préparations hautement purifiées pour obtenir des mitochondries de coeur humain utilisant des gradients de métrizamide pour enlever les protéines cytosoliques et autres contaminants subcellulaires ; b séparation des complexes de protéine mitochondriale avec des gradients de densité de saccharose après solubilisation avec le n-dodécyl-bêta-D-maltoside ; (c) 1 D électrophorèse des fractions de gradient de saccharose ; (d) protéomique haut débit à l'aide de l'excision bande de gel de robotique, digestion de dans-gel, MALDI cible spotting et acquisition spectrale automatisée ; et identification des protéines (e) de mélanges de peptides tryptiques de peptide de haute précision masse prise d'empreintes digitales. En utilisant cette approche, nous avons rapidement identifié 82 protéines mitochondriales véritables ou éventuelles, 40 qui n'ont pas encore été déclarées à l'aide de techniques de PAGE 2D. Ces protéines incluent petit complexe j'et complexes sous-unités IV, ainsi que très fondamentales et hydrophobes protéines transmembranaires tels que l'adénine nucléotide translocase qui ne sont pas libérés dans les gels 2D. La technique décrite ici devrait également être utile pour l'identification de nouvelles associations de protéines, comme en témoigne la validation d'un complexe récemment découvert qui implique des protéines appartenant à la famille des prohibitin.

Caractérisation De La Séquence Primaire Des Catestatin Intermédiaires Et Peptides Définit Les Sites De Clivage Protéolytique Utilisées Pour Convertir La Chromogranine Un Dans Active Catestatin Sécrétée Par Les Cellules Chromaffines Neuroendocrines

Biochemistry. Jun, 2003  |  Pubmed ID: 12795588

Catestatin est un peptide de 21-résidu actif dérivé de la chromogranine précurseur (CgA), et catestatin est sécrétée par les cellules chromaffines neuroendocrines comme régulateur autocrine de la libération de catécholamines stimulée par la nicotine. L'objectif de cette étude était de caractériser les séquences primaires des intermédiaires catestatin de masse moléculaire élevée et de peptides pour définir les sites de clivage protéolytique dans les CgA qui sont utilisées dans la biosynthèse de la catestatin. Catestatin contenant des polypeptides, démontrée par transfert western anti-catestatin, 54-56, 50, 32 et 17 kDa contenues NH (2)-séquences peptidiques terminal indiquant les clivages protéolytiques du précurseur de la CgA à flèche vers le bas de KK, flèche vers le bas KR, flèche vers le bas R et sites de résidus base KR flèche vers le bas, respectivement. Les terminus COOH de ces intermédiaires de catestatin ont été définis par la présence du peptide trypsique COOH-terminale du précurseur de la CgA, correspondant aux résidus 421-430, qui a été identifiée par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Résultats ont également démontrent la présence de 54-56 et 50 intermédiaires catestatin kDa qui contiennent l'extrémité NH(2) du CgA. La sécrétion des catestatin intermédiaires des cellules chromaffines était accompagnée de la co-sécrétion de catestatin (CgA(344)(-)(364)) et formes variant de peptide (CgA(343)(-)(368) et CgA(332)(-)(361)). Elles déterminées sites de clivage prédit que la production d'intermédiaires catestatin de masse moléculaire élevée exige clivage aux côtés COOH-terminale des résidus basiques appariés, qui est compatible avec les spécificités de clivage des convertases prohormone PC1 et PC2. Toutefois, il est à noter que la production de catestatin lui-même (CgA(344)(-)(364)) utilise des sites de clivage plus inhabituelles à l'hémisphère Nord (2)-terminal et d'autre de la flèche vers le bas R et les sites de résidus base de flèche vers le bas RR, compatibles avec les spécificités de clivage de la protéase de cystéine granules chromaffines « PTP » qui participe au traitement de la proenképhaline. Ces résultats démontrent que la production de catestatin implique un clivage de CgA à résidus basiques et monobasiques appariés, les étapes nécessaires à la régulation peptide catestatin de la libération des catécholamines nicotinique cholinergique induite.

MS2Assign, Automatique Affectation Et Nomenclature Des Spectres De Masse En Tandem De Chimiquement Réticulés De Peptides

Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12892908

Dans un précédent rapport (Young et al., proc. nat Acad. sci., États-Unis, 2000, 97, 5802-5806), nous avons fourni une preuve de principe pour la reconnaissance de pliage des protéines à l'aide d'un réactif de réticulation chimique spécifique amine homobifunctional en combinaison avec l'analyse par spectrométrie de masse et de la modélisation par homologie. Dans ce travail actuel, nous proposons une nomenclature systématique pour décrire les types de peptides générés après la protéolyse des protéines de réticulation, leur fragmentation en spectrométrie de masse et un algorithme automatisé pour affectation spectrale MS/MS, appelé « MS2Assign. » Plusieurs exemples sont fournis de réticulé peptides et protéines dont l'intégrase du VIH, cytochrome c, ribonucléase A, myoglobine, synthétase d'acide N-acétylneuraminique cytidine monophosphate 5 et la thymopentin de peptide. Les spectres de masse en tandem ont été obtenus de différents peptides réticulé à l'aide de poste source carie MALDI-TOF et dissociation de collision provoquée par un instrument quadrupolaire-TOF, ainsi que leur interprétation automatisée à l'aide de MS2Assign. Une variété de résultats possibles sont décrites et classées en fonction du nombre de lysines modifiées et/ou chaînes peptidiques impliqués, ainsi que la présence de résidus de lysine (impasse) modifiés individuellement. En outre, la protéolyse et les conditions chromatographiques nécessaires à la récupération de peptide réticulé optimisée sont présentées.

PHOSPHOSPECIFIQUES La Protéolyse Pour La Cartographie Des Sites De Phosphorylation De La Protéine

Nature Biotechnology. Sep, 2003  |  Pubmed ID: 12923550

La phosphorylation des protéines est un mécanisme dominant de transfert de l'information dans les cellules, et des principaux objectifs des efforts actuels de protéomique sont de générer une carte de niveau système décrivant tous les sites de phosphorylation de la protéine. Les efforts récents ont mis l'accent sur le développement de technologies pour enrichir et quantification des phosphopeptides. Identification des sites de phosphorylation s'appuie généralement sur la spectrométrie de masse des peptides de séquence. Nous décrivons ici une approche pour la cartographie de phosphopeptides qui permet d'interroger une séquence de protéines directement avec une protéase qui reconnaît les sites de phosphorylation. La clé de cette approche est la transformation chimique sélective des résidus de phosphosérine et phosphothréonine en analogues de la lysine (aminoethylcysteine et bêta-methylaminoethylcysteine, respectivement). Peptides modifiés Aminoethylcysteine sont clivés par une protéase spécifique de la lysine pour mapper des sites de phosphorylation. Une étape de blocage permet à site unique clivage et enrichissement des phosphopeptides et modification en une seule étape facilite l'adaptation de cette réaction à la phase solide.

Le Mutant MsbB De Souche De Neisseria Meningitidis NMB a Un Défaut De Montage Lipooligosaccharide Et Transport à La Membrane Externe

Infection and Immunity. Feb, 2003  |  Pubmed ID: 12540541

Une mutation d'insertion-délétion msbB, un gène codant une acyltransférase de lipide A, a été introduite dans encapsulée Neisseria sérogroupe du meningitidis B souche NMB et un mutant de la paroi de la même souche. Ces mutants ont été désignés NMBA11K3 et NMBA11K3cap, respectivement. Lipooligosaccharide (LOS) ni lipide A pu être isolé de NMBA11K3 bien qu'un certain nombre de techniques ont été jugé, mais tous deux ont été facilement extraites de NMBA11K3cap-. Immunomicroscopie électronique à l'aide d'anticorps monoclonaux (ACM) 6 b 4, qui reconnaît le terminal Galbeta1-4GlcNAc de LOS, démontré que NMB, NMBcap et NMBA11K3cap - exprimé sur sa circonférence, le LOS tandis que MAb 6 b 4 ne se lie pas à la surface de NMBA11K3. Toutefois, une coloration cytoplasmique de NMBA11K3 avec 6 b 4 MAb a été une observation cohérente. Les analyses par spectrométrie de masse ont démontré que les quantités relatives de la C12 lipides spécifiques A 3-OH et C14: 0 3-OH présents dans les préparations de membrane (MP) de NMBA11K3 ont sensiblement diminué (- 25 et 23, respectivement) par rapport à la quantité en MP de sa souche parentale, NMB. Des analyses de Western blot de MP de NMBA11K3 ont démontré que les niveaux de la porine dans la membrane externe de NMBA11K3 ont été également considérablement diminuées. Ces études suggèrent que le défaut d'acylation de lipide A dans NMBA11K3 encapsulé influe sur l'Assemblée du lipide A et, par conséquent, l'incorporation de la porine dans la membrane externe.

Caractérisation Du Protéome Mitochondrial Coeur Humain

Nature Biotechnology. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12592411

Pour acquérir une meilleure compréhension du rôle crucial des mitochondries dans la fonction cellulaire, nous avons compilé un catalogue exhaustif du protéome mitochondrial utilisant des mitochondries hautement purifiées de tissu cardiaque humain normal. Centrifugation en gradient de saccharose a été utilisée pour résoudre partiellement les complexes de protéines dont les composants individuels de protéines ont été séparées par PAGE unidimensionnelle. Traitement de dans-gel total et subséquente détection par spectrométrie de masse et analyse bioinformatique rigoureux a donné un total des identifications de 615 protéines distinctes. Toutes les valeurs de pI de protéine, des tranches de poids moléculaire et hydrophobicités étaient représentées. La couverture des sous-unités connues de la machinerie de la phosphorylation oxydative dans la membrane mitochondriale interne était > 90 %. Une proportion importante des protéines identifiées sont impliqués dans la signalisation, ARN, ADN et la synthèse des protéines, transport des ions et du métabolisme des lipides. Le rôle biochimique de 19 % des protéines identifiées n'ont pas été défini. Cette base de données des protéines fournit une ressource complète pour la découverte des voies et de nouvelles fonctions mitochondriales.

Incorporation Métabolique Des Acides Sialiques Synthétiques Dans Les Haemophilus Ducreyi Lipooligosaccharides

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12615992

Les lipooligosaccharides (LOS) de Haemophilus ducreyi sont hautement sialylés, une modification qui a été impliquée dans la résistance à la défense de l'hôte et de virulence. Dans des travaux antérieurs, nous avons démontré que H. ducreyi nettoie l'acide sialique issus du milieu extracellulaire et intègre ces résidus de LOS. Nous rapportons ici que H. ducreyi pouvez utiliser contre-nature acides sialiques portant des groupes de N-acyl allongés de trois à sept atomes de carbone en longueur, résultant dans la présentation de la membrane externe du sialyl-LOS contre-nature. La variante non naturelle comprend environ 90 % des cellules a surface lorsque des substrats exogènes sont ajoutés aux médias à des concentrations micromolaires, malgré l'existence de l'acide sialique naturelle dans les milieux de croissance. Bien qu'ils représentent la majorité des cellules a surface, analogues avec les groupes N-acyle plus diminuent le niveau global de LOS sialylation, aboutissant à une inhibition complète de LOS sialylation de N-octanoyl l'acide sialique. Ainsi, sialylation d'h LOS peut être modulée en ce qui concerne la structure des résidus de l'acide sialique terminal et le degré auquel l'accepteur de LOS est modifié en fournissant les bactéries avec divers analogues de l'acide sialique.

Identification D'un Opéron De Biosynthèse Acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique Moraxella Catarrhalis Et L'analyse D'un Mutant Isogénique KdsA Déficient

Infection and Immunity. Nov, 2003  |  Pubmed ID: 14573664

Lipooligosaccharide (LOS), une composante principale surface exposée de la membrane externe, est considéré comme un facteur de virulence dans la pathogenèse des infections de Moraxella catarrhalis. Toutefois, les étapes critiques impliqués dans la biosynthèse et Assemblée de M. catarrhalis LOS restent actuellement non définie. Dans cette étude, nous avons utilisé par transposon aléatoire pour identifier un 3-désoxy-D-manno-octulosonique acid (KDO) biosynthétique opéron M. catarrhalis avec le gène ordre pyrG-kdsA-eno. La molécule A-KDO de lipides sert l'accepteur sur lequel une variété de glycosyl transférases ajouter séquentiellement les extensions d'oligosaccharide core et de la direction générale pour la molécule de LOS. KdsA, le KDO-8-phosphate synthase, catalyse la première étape de la biosynthèse de KDO et est une enzyme essentielle chez les entérobactéries Gram négatifs pour le maintien de la viabilité bactérienne. Nous rapportons la construction d'un mutant de kdsA M. catarrhalis isogénique chez la souche 7169 par échange allélique. Nos données indiquent qu'une molécule de LOS consistant uniquement en lipide A et manque de glycosylation KDO est suffisante pour assurer la survie de catarrhalis M. in vitro. En outre, comparatives essais de croissance et de la sensibilité ont été effectuées pour évaluer la sensibilité des 7169kdsA11 par rapport à celle de la souche parentale. Les résultats de ces études démontrent que la molécule de LOS native est un facteur important dans le maintien de l'intégrité de la membrane externe et suggèrent que LOS est un élément essentiel dans la capacité de M. catarrhalis à résister à l'activité bactéricide du sérum humain.

Proteome De Haemophilus Ducreyi Par 2D SDS-PAGE Et Spectrométrie De Masse : Expression De Variation, Virulence Et Hydrates De Carbone De La Souche

Journal of Proteome Research. Sep-Oct, 2003  |  Pubmed ID: 14582649

Nous avons analysé le protéome de plusieurs souches d'Haemophilus ducreyi par électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) et la spectrométrie de masse. Plus de 100 sites ont été analysés depuis les fractions de protéines solubles et insolubles de la 35000HP de souche prototype et 122 protéines distinctes ont été identifiées. Fonctions d'environ 80 % des 122 protéines ont été déduites par identification avec homologues étroites d'Haemophilus influenzae. Quatre autres wild type et trois mutants ont été analysés qui varient dans leurs structures lipooligosaccharide virulence et/ou de la membrane externe. Dans l'ensemble, les cartes DE 2 gel du type sauvage et des souches mutantes sont semblables aux 35000HP, suggérant le protéome peu de diversité en ce qui concerne l'expression des hydrates de carbone et/ou de la virulence de la souche. Une exception a été la souche du Kenya 33921 qui contenait des différences significatives dans son proteome 2-DE la carte et synthétise également un LOS inhabituelle avec une structure de branche trisaccharide. Cette souche africaine peut représenter un prototype d'un deuxième groupe clonal d'h.

La Protéine De Liaison De Plaquettes Streptococcus Gordonii GspB Subit Une Glycosylation Indépendamment Des Exportations

Journal of Bacteriology. Feb, 2004  |  Pubmed ID: 14729688

La liaison des bactéries et des plaquettes peut jouer un rôle central dans la pathogenèse de l'endocardite infectieuse. Fixation des plaquettes par souche de Streptococcus gordonii M99 est principalement médiée par la protéine ancrée à la paroi cellulaire de 286-kDa GspB. Cette protéine anormalement élevée ne dispose pas d'un peptide signal d'amino-terminale typique et est transloquée du cytoplasme via un système de transport dédié. Un segment de 14 kb juste en aval de gspB encode SecA2 et SecY2, système de transport de deux composantes de la GspB spécifique. Le segment en aval encode également plusieurs présumés glycosyl transférases qui pourraient être responsables de la modification post-traductionnelle de la GspB. Dans cette étude, nous avons comparé les capacités de M99 et deux souches mutantes GspB(-) lier diverses lectines. GspB s'est avéré pour avoir une affinité pour les lectines qui lient la N-acétylglucosamine. Nous avons aussi examiné des formes variantes de GspB qui n'ont pas un domaine carboxy-terminal de fixation de paroi cellulaire et sont donc libres de liaison covalente de peptidoglycane de la paroi cellulaire. Comme natif de GspB, ces protéines tronquées semblent être fortement glycosylée, comme en témoigne la migration durant l'électrophorèse en gel sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide avec une masse moléculaire apparente > 100 kDa excédant la masse prédite, négligeable la coloration avec taches protéiniques conventionnel et la réactivité avec suit l'hydrazide oxydation au periodate. En outre, l'analyse des glucides associés avec les variantes GspB par chromatographie échangeuse d'anions à pH élevé a révélé la présence d'environ 70 pour 100 des résidus de monosaccharide par GspB polypeptide (principalement la N-acétylglucosamine et glucose). Analyse des GspB dans des protoplastes de souches mutantes secA2 ou secY2, qui n'exportent pas de GspB, indique que GspB est glycosylée dans le cytoplasme de ces souches. La combinaison des données suggèrent que l'indigène GspB est une glycoprotéine et qu'il peut être glycosylées avant l'exportation.

Protéomique Et Caractérisation Immunochimique D'un Rôle Pour Stathmine Dans La Neurogenèse Adulte

FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. Feb, 2004  |  Pubmed ID: 14769823

Stathmine est une protéine cytosolique développemental réglée exprimée à des niveaux élevés dans le cerveau. Électrophorèse bidimensionnelle de gel-différentiel et spectrométrie de masse des protéines exprimées dans les cultures immatures et matures de rat embryonnaires stathmine de cortex cérébral identifié parmi plusieurs différentiellement expriment protéines, compatibles avec un rôle possible dans la neurogenèse. L'immunohistochimie stathmine dans le cerveau de rongeur adulte a révélé expression proéminente dans montré zones et voies de migration neuronale, un modèle qui ressemble à l'expression de doublecortin, qui est impliqué dans la migration neuronale. L'immunoréactivité de la stathmine était également associée des neurones en cours de migration de la chaîne ectopique dans le striatum ischémique et le cortex cérébral suite à une ischémie cérébrale focale. Réduction de l'expression de la stathmine ou doublecortin avec un oligonucléotide antisens inhibe la migration des neurones de la zone sous-ventriculaire à l'ampoule olfactive via le flux migratoire rostral. Ces résultats suggèrent un rôle stathmine dans la migration de la neurogenèse du cerveau adulte.

Exploiter La Protéomique à La Découverte De Médicaments Qu'oxydatif Mitochondrial De Cible

Science of Aging Knowledge Environment : SAGE KE. Mar, 2004  |  Pubmed ID: 15028863

Pour comprendre comment le stress oxydatif contribue au vieillissement et à l'âge des maladies et à mieux évaluer l'effet thérapeutique des médicaments antioxydant, il serait hautement souhaitable d'avoir une lecture complète et détaillée des types de dommages oxydatifs qui se produisent à des protéines à l'échelle mondiale ou protéome. Dans cette Perspective, j'examine comment la protéomique, définie ici comme la science de l'examen de toutes les protéines dans un organite, cellulaire ou tissulaire dans le contexte des phénomènes biologiques, peut être utilisé pour fournir des détails moléculaires de dommages oxydatifs protéine mitochondriale. Plus précisément, discuter des approches qui allient les connaissances du protéome mitochondrial avec de nouvelles techniques par spectrométrie de masse qui sont capables d'identifier les sites d'oxydation et de protéines de façon haut débit.

Couverture élargie Du Protéome Mitochondrial Coeur Humain Multidimensionnel Chromatographie En Phase Liquide Couplée à La Spectrométrie De Masse

Journal of Proteome Research. May-Jun, 2004  |  Pubmed ID: 15253431

Des preuves récentes suggèrent que les mitochondries sont étroitement liées avec le processus de vieillissement et les maladies dégénératives comme la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson. Ainsi, il a augmenté intérêt en cataloguage des protéomes mitochondrial pour identifier des cibles diagnostiques et thérapeutiques possibles. Nous avons déjà rapporté les résultats d'une chromatographie de liquides/électrophorèse unidimensionnelle étude MS/MS pour caractériser le protéome des mitochondries de coeur humain normal (Taylor et al., NAT. biotechnologie. 2003, 21, 281-286). Nous rapportons deux études subséquentes où chromatographie multidimensionnelle MS/MS a été étudiée comme un autre moyen pour caractériser le même échantillon.

Laser Assistée Par Matrice De Désorption/ionisation-temps De Vol-spectrométrie De Masse Des Espèces Lipopolysaccharide Séparées Par électrophorèse Sur Gel De Polyacrylamide-dalle : Séparation à Haute Résolution Et La Détermination De La Masse Moléculaire De Lipooligosaccharides De Vibrio Fischeri Souche HMK

Electrophoresis. Jul, 2004  |  Pubmed ID: 15273999

Nous avons récemment démontré que l'utilisation combinée du lipopolysaccharide (LPS) inverser la coloration et techniques de haute efficacité passive d'élution peuvent être utilisés avec succès comme une interface appropriée entre LPS dalle-gel de séparation et par électronébulisation spectrométrie de masse d'ionisation (ESI-MS) des oligosaccharides dérivés de LPS. Ici, nous étendons notre stratégie micropurification pour l'analyse des formes de l'O-désacylée LPS de Vibrio fischeri HMK après récupération de simples bandes de LPS colorés à l'inverse à l'aide assistée par matrice laser désorption/ionisation-temps de vol-spectrométrie de masse (MALDI-TOF-MS). Les quantités (30-40 microg) obtenues à partir de deux bandes LPS résolue en gel ne suffisaient pas permettre la détection de MALDI-TOF-MS de glycoformes de LPS O-désacylée à m/z 3767.1, 3890.1 pour la haute masse moléculaire ou à m/z 2522.5, 2645.4, 2725.7 et 2848.7 pour la bande de LPS de faible poids moléculaire. Ces hétérogénéités de bande de LPS a entraîné non seulement des variations dans la région d'oligosaccharides du LPS, mais aussi de deux États de phosphorylation de la lipide A (opposition et opposition plus une substitution de la phosphoéthanolamine unique). En revanche, les spectres de masse MALDI-TOF des bandes séparées LPS affichées réduit l'hétérogénéité et des rapports signal sur bruit par rapport aux spectres du LPS non purifiés. En outre, micropurification des bandes de LPS préalable MALDI-TOF-MS a conduit à une plus grande sensibilité de détection de moins abondantes glycoformes de LPS de faible poids moléculaire. En somme, cela et notre étude précédente sur gel-micropurified LPS à l'aide d'ESI définitivement montrent comment on peut déterminer sans ambiguïté les différentes espèces moléculaires contenus dans chaque bande de LPS gel séparées, leur abondance relative et les séquences d'oligosaccharides.

Nouvelle Modification De Lipide A De Francisella Tularensis

Infection and Immunity. Sep, 2004  |  Pubmed ID: 15322031

Nous avons étudié le lipide A de Francisella tularensis subsp. holarctica souche 1547-57, une souche de type B, à l'aide de la spectrométrie de masse laser assistée par matrice desorption ionisation-time-of-flight, spectrométrie de masse à trappe d'ions quadripolaire SPECTROMETRIE et méthodes chimiques. Selon les structures déjà publiées du lipide A de F. tularensis vivre la souche vaccinale (LVS) (ATCC 29684) (E. Vinogradov et al., EUR j Biochem. 269:6112-6118, 2002), toutes les formes de lipide majeur A partir de souche 1547-57 ont été tétrapentamannophosphoinositide. Comme dans la souche LVS, les principaux acides gras détecté en lipide F. tularensis 1547-57 qu'un échantillon comprenait l'acide 3-hydroxyoctadecanoic, acide 3-sont et Acide hexadécanoïque acide tétradécanoïque. Cependant, plusieurs des lipides Qu'a les composants présent dans la souche 1547-57 étaient de poids moléculaire plus élevé que les structures déjà publiées. Une composante majeure avec une APW de 1 666 s'est avérée pour contenir trois acides gras C(18:0)(3-OH), un acide gras C(16:0), un groupement phosphate et une portion de 161-Da. Cette portion de 161-Da pourraient être retirée le lipide A par traitement à l'acide fluorhydrique aqueux et a été identifiée comme la galactosamine après peracétylation et analyse par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. Détaillés des enquêtes du M (r)-1 666 espèces par spectrométrie de masse à trappe d'ions avec plusieurs étapes de fragmentation a suggéré que la galactosamine-1-phosphate était liée à l'extrémité réductrice du lipide A. semblable à la modification du lipide A, avec arabinosamine, espèces de lipopolysaccharides de F. tularensis contenant un phosphate lié galactosamine pourraient potentiellement influencer sa survie intracellulaire par conférant la résistance aux peptides antimicrobiens.

Régulateur Lipophile D'un Commutateur De Développement Chez Caenorhabditis Elegans

Aging Cell. Dec, 2004  |  Pubmed ID: 15569358

Résumé Dans le ver Caenorhabditis elegans, la décision de se développer en un adulte de reproduction ou de l'arrestation comme une larve dauer est influencée par de multiples voies, notamment l'insuline-like et transforming growth factor beta (TGFbeta)-comme les voies de signalisation. Il a été proposé que les hormones lipophiles agir en aval de ces voies de réglementer la formation dauer. Une cible probable pour un tel hormone est DAF-12, un récepteur hormonal nucléaire orphelin qui médie ces décisions de développement et influe également sur la durée de vie des adultes. Afin de trouver des hormones lipophiles que nous avons générés extraits lipophiles à partir de cultures de masse de C. elegans et montré qu'ils sauver le phénotype dauer constitutive de classe 1 daf-2 mutants signalisation de l'insuline et la signalisation TGFbeta mutants daf-7. Ces extraits sont également en mesure de sauver le phénotype dauer létale de daf-9 mutants, qui n'ont pas de hydroxylase P450 stéroïdes soupçonnées d'être impliquées dans la synthèse de la DAF-12 ligand; extraits, toutefois, n'ont pas d'effet sur un DAF-12 ligand mutant domaine de liaison qui est prévu pour être ligand insensible. La production de cette hormone semble être DAF-9 dépendent que des extraits à partir d'un daf-9; daf-12 double mutant ne présentent pas cette activité. Fractionnement préliminaire des extraits lipophiles montre que l'activité est hydrophobe avec quelques propriétés polaires, compatible avec une hormone petite lipophile. Nous proposons que l'activité sauvetage dauer est une hormone synthétisée par DAF-9 qui agit par DAF-12.

Composants Moléculaires D'une Voie De Mort Cellulaire Activé Par Le Stress Du Réticulum Endoplasmique

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2004  |  Pubmed ID: 14561754

Altérations de l'homéostasie du Ca2 + et l'accumulation de protéines mal repliées dans le réticulum endoplasmique (re) engendrer des contraintes de ER qui mène à la mort cellulaire programmée. Des études récentes ont montré que les déclencheurs de stress ER mort programmée des cellules via une voie alternative intrinsèque de l'apoptose qui, contrairement à la voie intrinsèque décrite précédemment, est indépendante de l'Apaf-1 et le cytochrome c. Dans le présent travail, nous avons utilisé un ensemble d'approches complémentaires, y compris d'électrophorèse bidimensionnelle, couplée à la spectrométrie de masse laser assistée par matrice desorption ionisation-temps de vol et de nano-liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry avec la spectrométrie de masse, l'interférence ARN, co-immunoprécipitation, IMMUNODÉPLÉTION des protéines du candidat et des études de reconstitution, d'identifier les médiateurs de la voie de la mort cellulaire induite par le stress ER. Nos données identifient deux molécules, protéine contenant valosine et liés à l'apoptose gène-2 (ALG-2), qui semblent jouer un rôle dans la médiation de la mort cellulaire induite par le stress ER.

Identification D'un Transporteur De L'acide Sialique Roman à Haemophilus Ducreyi

Infection and Immunity. Oct, 2005  |  Pubmed ID: 16177350

Haemophilus ducreyi, l'agent responsable du chancre mou, produit un lipooligosaccharide (LOS), qui se termine par la N-acétyllactosamine. Cette GLYCOFORME peut être étendu par l'ajout d'un résidu d'acide sialique unique à la voie galactose terminal. H ne pas synthétiser l'acide sialique, qui doivent être acquises de l'hôte au cours de l'infection ou de milieu de culture lorsque les bactéries sont cultivées in vitro. Cependant, h n'a pas les gènes qui sont hautement homologues aux gènes codant les transporteurs bactériens connus l'acide sialique. Dans cette étude, nous avons identifié le transporteur de l'acide sialique par criblage de souches dans une bibliothèque de mutants de transposon aléatoire pour les mutants qui n'ont pas pas ajouter l'acide sialique à LOS contenant du N-acétyllactosamine. Mutants qui réagissent avec l'anticorps monoclonal 3F11, qui reconnaît la structure lactosamine terminal, et manquaient de réactivité avec l'agglutinine d'amurensis Maackia lectine, qui reconnaît des alpha2, l'acide sialique lié à 3, ont été davantage caractérisés pour démontrer qu'ils ont produit un contenant du N-acétyllactosamine LOS par colorés à l'argent de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel électrophorèse et masse analyses par spectrométrie. Les gènes interrompues chez ces mutants ont été cartographiés à une grappe de quatre gènes avec similarité avec des gènes codant les transporteurs ABC bactériennes. Tests d'absorption radiomarquée acide sialique a confirmé que les mutants ont été incapables de transporter de l'acide sialique. Cette étude est le premier rapport des bactéries utilisant un transporteur ABC pour l'absorption de l'acide sialique.

Rapide Purification Et Caractérisation Par Spectrométrie De Masse De Déshydrogénase De NADH Mitochondrique (complexe I) De Cerveau De Rongeur Et Une Ligne De Cellules Neuronales Dopaminergiques

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Jan, 2005  |  Pubmed ID: 15591592

Le stress oxydatif et dysfonctionnement mitochondrial signifient des événements biochimiques importants liés à la perte des neurones dopaminergiques de la maladie de Parkinson (MP). Des études utilisant des modèles in vitro et in vivo de PD ou de tissus provenant de patients malades ont montré une inhibition sélective de la déshydrogénase de NADH mitochondrique (complexe I de la chaîne de transport d'électrons OXPHOS) qui affecte la physiologie mitochondriale normale menant à la mort neuronale. Dans une étude précédente, nous avons démontré que le stress oxydatif en raison de l'appauvrissement en glutathion dans les cellules dopaminergiques, une caractéristique de PD, mène au complexe j'ai inhibition par oxydation de thiol de cystéine (Jha et coll. (2000) J. Biol. Chem. 275, 26096-26101). Complexe I est un environ 980-kDa multimériques enzyme s'étendant sur la membrane mitochondriale interne comprenant au moins 45 sous-unités protéiques. Comme condition préalable à une enquête sur les modifications au complexe I à l'aide d'un modèle de maladie rongeur pour PD, nous avons développé deux rapide indépendant et procédures d'isolement doux basé sur le fractionnement de gradients de sucrose et immunoprécipitation pour isoler le complexe j'ai du cerveau de souris et une ligne de cellules neuronales dopaminergiques mésencéphaliques cultured rat. Les deux protocoles sont capables de purifier complexe j'ai de petites quantités de rongeurs cultures tissulaires et cellulaires. Électrophorèse Native bleu, unidimensionnel et bidimensionnelle SDS-PAGE étaient employés pour évaluer la pureté et la composition du complexe isolé, j'ai suivi par une vaste caractérisation par spectrométrie de masse. Au total, 41 45 rongeur complexe j'ai sous-unités obtenu une couverture séquence SM/SM. À notre connaissance, cette étude fournit la première détaillée analyse par spectrométrie de masse de neuronal complexe j'ai protéines et fournit un moyen d'enquêter sur le rôle de l'oxydation de la cystéine et autres modifications post-traductionnelles dans les pathologies associées à un dysfonctionnement mitochondrial.

Le Protéome Mitochondrial Humain : Le Stress Oxydatif, Modifications Protéiques Et La Phosphorylation Oxydative

The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. May, 2005  |  Pubmed ID: 15743667

Les mitochondries sont l'un des plus complexes des organites subcellulaires et jouent un rôle clé dans de nombreuses fonctions cellulaires, y compris la production d'énergie, métabolisme des acides gras, biosynthèse des pyrimidines, l'homéostasie du calcium et la signalisation cellulaire. Ces dernières années, nous et les autres groupes avons tenté d'identifier l'ensemble des protéines qui sont localisées aux mitochondries humaines comme un moyen de mieux comprendre ses fonctions cellulaires et comment il communique avec l'autre compartiment cellulaire dans les voies de signalisation complexes tels que le stress oxydatif et l'apoptose. En effet, il y a un intérêt croissant pour comprendre les détails moléculaires du stress oxydatif et le rôle mitochondrial dans ce processus, ainsi que l'évaluation de protéines mitochondriales comment devenir endommagés ou modifiés après suite à un important changement dans le statut redox de la cellule. Dans cette revue, nous présentons l'état actuel du protéome mitochondrial humain en mettant l'accent sur la compréhension des protéines mitochondriales comment, surtout les protéines qui composent la chaîne respiratoire ou les enzymes de phosphorylation oxydative (OXPHOS), sont modifiés dans divers modèles de maladies liées au vieillissement comme le cancer et la maladie de Parkinson (MP).

Caractérisation D'une Grappe De Trois Enzymes Glycosyltransferase Essentiels Moraxella Catarrhalis Lipooligosaccharide L'Assemblée

Journal of Bacteriology. May, 2005  |  Pubmed ID: 15838019

Moraxella catarrhalis isole express lipooligosaccharide (LOS) des molécules à leur surface, qui partagent des épitopes semblables à celle des espèces Neisseria et Haemophilus. Ces épitopes communs de LOS ont été impliqués dans les différentes étapes de la pathogenèse pour les différents organismes. Dans cette étude, un groupe de trois gènes de glycosyltransferase LOS (lgt) ont été identifiés dans M. catarrhalis 7169, une souche qui produit un sérotype B LOS. Mutants de ces gènes glycosyltransferase ont été construits et les phénotypes résultants de LOS concordaient avec des degrés de troncation par rapport au type sauvage LOS. Les structures de LOS de chaque mutant lgt étaient n'est plus détectés par un anticorps monoclonal (ACM 4 5) spécifique à un épitope terminal hautement conservé ni par un anticorps monoclonal (MAb 3F7) spécifique au sérotype chaîne latérale B LOS. Spectrométrie de masse de la LOS glycoformes assemblé par deux de ces mutants de lgt a indiqué que lgt1 encode une glucosyltransférase alpha(1-2) et le lgt2 encode un galactosyltransférase beta(1-4). Toutefois, ces études structurales ne pourraient pas délimiter la fonction pour lgt3. Par conséquent, M. catarrhalis lgt3 a été introduit dans un sens beta(1-4) glucosyltransférase Haemophilus ducreyi 35000glu-mutant en trans et anticorps monoclonal analyse a confirmé que Lgt3 a complété le défaut de LOS. Ces données suggèrent que lgt3 encode une glucosyltransférase impliqué dans l'ajout d'un glucose lié à beta(1-4) vers le noyau intérieur. En outre, nous concluons que cette étape enzymatique est essentielle pour l'assemblage de la GLYCOFORME complète de LOS exprimée par M. catarrhalis 7169.

Identification Par Spectrométrie De Masse D'une Phosphorylation Nouveau Site Dans La Sous-unité NDUFA10 Du Complexe Mitochondrique Bovine J'ai

FEBS Letters. Apr, 2005  |  Pubmed ID: 15848193

Complexe mitochondrique je (oxydoréductase de NADH : ubiquinone) se compose d'au moins 46 sous-unités. La phosphorylation de la sous-unité de 42 kDa NDUFA10 a été signalée récemment à l'aide d'une tache de phosphoprotéine roman [Schulenberg et coll. (2003) analyse de la phosphorylation de la protéine de l'équilibre dans les mitochondries en utilisant un colorant roman phosphosensor fluorescent. J. Biol. Chem 278, 27251]. Deux complexe plus petit j'ai phosphoprotéines, EIE et MLAFONT et leurs sites de modification, ont depuis lors été déterminées [Chen et al., (2004) la phosphorylation des sous-unités du complexe j'ai des mitochondries de coeur de bovin. J. Biol. Chem 279, 26036,.]. Ici, nous identifions le site de phosphorylation dans NDUFA10 des mitochondries de coeur de boeuf par spectrométrie de masse. Un phosphopeptide unique couvrant les résidus 47-60 a été identifié et confirmé par la synthèse d'être (47)LITVDGNICSGKpSK(60), établissant des sérine-59 dans le site de phosphorylation.

Caractérisation Fonctionnelle Et Des Bulles De Membrane Purifiée à Partir De Neisseria Sérogroupe Du Meningitidis B

The Journal of Biological Chemistry. Nov, 2005  |  Pubmed ID: 16103114

Avec des agrégats purifiées de l'endotoxine, les études ont révélé l'importance de la protéine liant le lipopolysaccharide (LBP) - extraction dépendant et le transfert des molécules individuelles endotoxine à CD14 en Toll-like receptor 4 (TLR4) - dépendante d'activation de cellules. Endotoxine est normalement incorporé dans la membrane externe des bactéries Gram-négatives intactes et remise des vésicules de la membrane (« bulles »). Toutefois, la capacité de LBP et CD14 pour promouvoir efficacement l'activation des cellules dépendantes TLR4 par l'endotoxine associée à la membrane n'a pas été étudiée intensivement. Dans cette étude, nous avons utilisé un auxotrophe acétate de Neisseria meningitidis du sérogroupe B afin de faciliter le marquage métabolique d'endotoxine bactérienne et comparé les interactions des agrégats d'endotoxine purifiée et d'endotoxine associées aux membranes avec LBP, CD14 et cellules favorisant l'endotoxine. L'endotoxine, phospholipides et composition protéique des bulles récupérés indiquent que les bulles proviennent de la membrane externe bactérienne. Analyse protéomique a révélé un enrichissement inhabituels dans hautement cationiques (pI > 9) protéines. Fois purifié des agrégats d'endotoxine et bulles activent les monocytes et les cellules endothéliales en un LBP - CD14- et fashion TLR4/MD-2-dépendante, mais les bulles étaient de 3 à 10 fois moins puissant lors de leur normalisation pour la quantité endotoxine ajoutée. Différences de puissance en corrélation avec les différences dans l'efficacité de livraison LBP-dépendante et extraction d'endotoxine de CD14. Les phospholipides membranaires et endotoxines sont extraits par LBP/soluble CD14 (sCD14) traitement, mais seulement endotoxin.sCD14 réagit avec MD-2 et active les cellules. Ces résultats indiquent que l'activité pro-inflammatoire de l'endotoxine peut être réglementée, non seulement par les propriétés structurelles intrinsèques de l'endotoxine, mais aussi par son association avec les voisins de molécules dans la membrane externe.

Transporteur De L'acide Sialique Roman D'Haemophilus Influenzae

Infection and Immunity. Sep, 2005  |  Pubmed ID: 16113244

Nontypeable Haemophilus influenzae est un pathogène opportuniste et une cause fréquente d'otites chez l'enfant et de la bronchite chronique et pneumonie chez des patients atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Les lipooligosaccharides, une composante majeure de la membrane externe de H. influenzae, jouent un rôle important dans la pathogénicité et virulence microbienne. Acide N-acétylneuraminique (acide sialique) peut être incorporé dans les lipooligosaccharides comme un terminal sucre non-réducteurs. Même si une grande partie de la voie d'incorporation de l'acide sialique dans lipooligosaccharides est comprise, le transporteur responsable de l'absorption acide N-acétylneuraminique à H. influenzae doit encore être caractérisée. Dans cet article, nous démontrons que ce transporteur est un transporteur de sucre roman de la famille de périplasmique transporteur ATP-indépendante tripartite. En l'absence de ce transporteur, H. influenzae ne peut pas incorporer l'acide sialique dans son lipooligosaccharides, rendant l'organisme incapable de survivre lorsqu'ils sont exposés au sérum humain et causant réduit la viabilité en croissance de biofilm.

Analyse Protéomique De La Succinate Déshydrogénase Et L'ubiquinol-cytochrome C Réductase (complexe II Et III) Isolée Par Immunoprécipitation Des Mitochondries De Coeur De Bovin Et De La Souris

Biochimica Et Biophysica Acta. Feb, 2006  |  Pubmed ID: 16120479

Le système de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) comprend cinq complexes multi-enzyme Complexes I et V et est un élément clé de la fonction mitochondriale relatives à la production d'énergie, stress oxydatif, la signalisation cellulaire et l'apoptose. Défauts ou une réduction de l'activité dans les divers éléments qui composent les enzymes OXPHOS peut provoquer des maladies graves, y compris les maladies neuro-dégénératives et divers troubles métaboliques. Notre objectif est de développer des techniques capables d'analyse rapide et approfondie de tous les complexes OXPHOS cinq. Nous décrivons ici un immunoisolation douce, micro-entreprises et masse spectrométrie protéomique/méthode pour la caractérisation du complexe II (succinate déshydrogénase) et le complexe III (ubiquinol-cytochrome c réductase) des mitochondries de coeur de bovin et les rongeurs. Couverture de séquence des protéines est obtenue après immunocapture, 1D analyse spectrométrique séparation et masse de SDS PAGE pour la majorité des sous-unités 4 et 11, respectivement, qui forment des Complexes II et III. L'identification de plusieurs modifications post-traductionnelles, y compris la modification covalente de FAD de sous-unité flavoprotéine 1 du complexe II, n'a pas été possible en raison de la couverture de séquence par spectrométrie de masse élevée.

Stable Isotope Labeling Métabolique De Neisseria Meningitidis Lipooligosaccharides

Journal of Endotoxin Research. 2006  |  Pubmed ID: 16690012

Le lipooligosaccharide (LOS) d'un auxotrophe acétate de Neisseria meningitidis a été métaboliquement étiqueté avec soit [2-13C]-acétate de sodium ou [1, 2-13 C 2]-acétate de sodium. Dans cette étude, nous avons démontré que ce marqueur a été efficacement incorporé dans les deux moitiés d'acyl les lipide A, et les deux N-acetylglucosamines présents dans la branche d'oligosaccharides du LOS. L'élaboration du présent protocole d'étiquetage efficace devrait s'avérer utiles à l'avenir structural studies analyser les interactions entre protéines LOS et hôte.

Sites De Phosphorylation De La Huntingtine Mappés Par Spectrométrie De Masse. Modulation De Clivage Et De Toxicité

The Journal of Biological Chemistry. Aug, 2006  |  Pubmed ID: 16782707

La huntingtine (Htt) est une grosse protéine de 3144 acides aminés, dont la fonction et règlement n'ont pas été bien définies. Expansion de polyglutamine (polyQ) à l'extrémité N terminale de Htt provoque la neurodégénératives trouble de la maladie de Huntington (MH). La cytotoxicité du mutant Htt est modulée par clivage protéolytique caspases et calpaïnes générer des fragments de polyQ contenant N-terminale. Nous avons émis l'hypothèse que la phosphorylation de la protéine Htt peut moduler le clivage et la cytotoxicité. Dans la présente étude, nous avons cartographié les sites majeurs de la phosphorylation de Htt à l'aide de modèles de culture de cellules (293 t et les cellules PC12) exprimant la pleine longueur Htt myc-tag constructions contenant des répétitions 23Q ou 148Q. Htt purifiée de myc-tag a été soumis à l'analyse par spectrométrie de masse spectrométrie de masse de désorption-ionisation laser assistée par matrice et nano-HPLC tandem mass spectrometry, utilisé en conjonction avec la phosphatase alcaline sur la cible et les digestions de protéase. Nous avons identifié plus de six sites de phosphorylation de sérine roman dans Htt, dont réside dans le domaine de la susceptibilité protéolytique. Trois des sites ont la séquence consensus de phosphorylation ERK1 et ajout de la phosphorylation de ERK1 inhibiteur blocs sur ces sites. Autres sites de phosphorylation observées sont probablement des substrats pour CDK5/CDC2 kinases. Mutation de Ser-536, qui se trouve dans le domaine de la susceptibilité protéolytique, acide aspartique, l'acide aminé inhibe la calpaïne clivage et réduit la toxicité Htt mutante. Les résultats présentés ici représentent la première cartographie détaillée des sites de phosphorylation dans la pleine longueur Htt. Dissection des modifications de la phosphorylation de Htt peut fournir des indices à la pathogenèse de la maladie de Huntington et cibles de développement thérapeutique.

DAF-12-dépendante De Sauvetage De La Formation Dauer Chez Caenorhabditis Elegans Par (25S)-cholestenoic Acide

Aging Cell. Aug, 2006  |  Pubmed ID: 16913876

La densité de population la disponibilité, la température et de la nourriture tous les réguler la formation de la larve Caenorhabditis elegans dauer en modulant les voies de signalisation du système endocrinien. Le récepteur nucléaire orphelin DAF-12 est essentielle pour la décision de former un dauer ou à subir le développement normal de la reproduction. Le DAF-12 ligand a été prévu pour être un stérol qui est métabolisé par DAF-9, un cytochrome P450. Ici, nous caractériser chimiquement des extraits purifiés de nématodes lipophiles et montrent que le ligand pour DAF-12 contient un fragment carboxyle et est susceptible d'être dérivé d'un stérol. L'utilisation d'un ligand candidat approcher, nous constatons que l'acide C27 des acides biliaires cholestenoic (5-cholestén-3beta-ol-(25S)-carboxylique) favorise la croissance reproductive dans dauer-constitutifs mutants dans un daf-9-et daf-12-dépendante manière. En outre, nous constatons que l'acide cholestenoic peut agir comme un DAF-12 ligand en activant DAF-12 dans un essai de transcription à base de cellules. Analyse des dauer-sauvetage extraits lipophiles de nématodes par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse indique la présence de plusieurs régioisomères de l'acide cholestenoic qui sont distincts de Delta (5)-cholestenoic acide et ne sont pas présents dans les extraits de daf-9 mutants. Ces données suggèrent que les stérols carboxylés peuvent être des déterminants clés de l'histoire de vie.

Rôle De LgtC Dans La Résistance Des Nontypeable Haemophilus Influenzae Souche R2866 De Sérum Humain

Infection and Immunity. Nov, 2006  |  Pubmed ID: 16966407

Nous enquêtons sur un nontypeable Haemophilus influenzae (polysaccharides) souche, R2866, isolé à partir d'un enfant atteint de méningite. R2866 est exceptionnellement résistant à tuer par le sérum humain normal. Concentration inhibitrice 50 % (CI50) à sérum pour cette souche est de 18 %, proche de celle d'encapsulé H. influenzae. R3392 est un dérivé de R2866 qui s'est avéré ont augmenté la sensibilité au sérum humain (IC50, 1,5 %). Analyse des régions tétramères de répétition dans les gènes de biosynthèse lipooligosaccharide (LOS) dans les deux souches indique que la lgtC du gène glycosyltransferase était hors du cadre ("off") dans la plupart des colonies de R3392, mais dans le cadre avec son codon de début ("on"), dans la plupart des colonies du parent. Nous avons cherché des preuves biochimiques et antigéniques de modification de la structure de LOS. Dans une cellule entière enzyme-linked immunosorbent assay, souche que r3392 affichée réduit de liaison de la Galalpha1, un anticorps monoclonal spécifique Gal 4 4 4. Analyse de spectrométrie de masse de LOS de la souche R2866 a indiqué que le GLYCOFORME primaire oligosaccharide contenait quatre heptose et quatre résidus hexose, alors que celui de R3392 contenait quatre heptose et trois résidus hexose. Nous concluons que le gène de lgtC de R2866 code un galactosyltransférase impliquées dans la synthèse des 4 4 épitope, comme dans les autres souches et que l'expression de lgtC est associée à la résistance au sérum de haut niveau qui a été observée pour cette souche. Il s'agit de la première description de la base génétique de la résistance au sérum de haut niveau en polysaccharides, ainsi que la première description de la composition de LOS dans une souche de polysaccharides dont la séquence complète du génome a été déterminée.

Nouvelles Voies Associées Au Quinone Induite Par Le Stress Dans Les Cellules Cancéreuses Du Sein

Drug Metabolism Reviews. 2006  |  Pubmed ID: 17145690

Les cancers du sein hormono-dépendant qui surexpriment le facteur de transcription nucléaire de ligands, récepteur des oestrogènes (ER), représentent la forme la plus courante de malignité épithéliales mammaires. Exposition des cellules épithéliales mammaires à une quinone redox-cyclisme et arylants induit la phosphorylation mitogen-activated protein kinase des protéines des filaments du cytosquelette, cytokératine-8, ainsi que de thiol arylation des histones nucléaires H3. Quinones exogènes ou endogènes peuvent également induire translocation nucléaire indépendante du ligand et la phosphorylation de l'ER ; avec l'exposition excessive, ces quinones peuvent arylation ER doigts de zinc, altérant la liant à l'ADN de l'ER et modifier l'expression des gènes inductibles par ER. Enrichissement d'immuno-affinité pour les protéines de faible abondance comme ER, couplée à des techniques de spectrométrie de masse moderne, promet d'améliorer la compréhension des protéines-modifications produites par l'exposition de la quinone endogènes et exogènes et leur rôle dans le développement ou la progression des épithéliales malignes comme le cancer.

Caractérisation Des Patrons D'acylation Lipide A Francisella Tularensis Francisella Novicida Et Francisella Philomiragia à L'aide De La Spectrométrie De Masse De Multiples étapes Et Désorption-ionisation Laser Assistée Par Matrice Sur Un Piège à Ions Intermédiaires Source De Dépression Linéaire

Analytical Chemistry. Feb, 2007  |  Pubmed ID: 17263332

Lipopolysaccharide (LPS) est une composante majeure de la membrane externe des bactéries Gram-négatives. La région de lipide A des LPS stimule le système immunitaire d'une manière dépendante de la structure. Nous avons déjà identifié les deux espèces principales de lipide A de Francisella tularensis comme asymétrique tétrapentamannophosphoinositide structures contenant quatre chaînes acyl longue (16 à 18 atomes de carbone) et un groupe phosphate unique que partiellement modifié par galactosamine (Phillips, n. J. ; Schilling B. ; McLendon, M. K. ; Apicella, M. A. ; Gibson, W. B. infecter. Ont 2004, 72, 5340-5348). Dans la présente étude, nous avons utilisé le laser assistée par matrice désorption-ionisation sur une source de dépression intermédiaire (vMALDI) couplé à un spectromètre de masse linéaire piège ionique (LIT) en mode de fragmentation massive de plusieurs étages (MSn) pour déterminer les structures de plusieurs espèces mineures et peu abondants lipide A dans F. tularensis Francisella novicida et Francisella philomiragia LPS qui n'ont pas été précédemment caractérisées. Études de fragmentation complète vMALDI-MSn nous a permis de déduire la composition et la position des substituants acides gras dans les fractions de lipide A. Contre toute attente, la plupart de ces toute espèce de lipides mineurs se composait de plusieurs espèces isobares chaînes acyles de différentes longueurs. En outre, nous avons constaté qu'une petite partie de ces espèces de lipide A peut-être être modifiée par l'ajout d'un sucre hexose ou hexosamine, en plus de la galactosamine qui a déjà été identifiée. Dans l'ensemble, nous avons constaté que MSn analyse sur la plate-forme vMALDI-allumé-MS a été très efficace et sensible, permettant une analyse approfondie des lipides très mineur une espèce.

Quantification De L'oxydation De La Cystéine Dans Les Récepteurs Des œstrogènes Humains Par Spectrométrie De Masse

Analytical Chemistry. Apr, 2007  |  Pubmed ID: 17373775

Modifications du rédox dépendants des groupes sulfhydryles dans les deux doigts de zinc Cys4 du résultat domaine (ER-DBD) oestrogène récepteur liaison à l'ADN des dommages structuraux et perte de fonction de liaison à l'ADN de l'ER, parallèle à la situation observée dans nombreux cancers du sein de ER-positif. Quantification de l'état redox des cystéinyl thiols dans ER-DBD employées oxydants de cystéine spécifique pour induire des degrés d'oxydation en recombinant ER, suivie d'une alkylation différentielle avec les réactifs de marquage isotopiques stables [12C 2] - acide iodoacétique et [13C 2] - acide bromoacétique. Protéolyse subséquente avec LysC/Asp-N généré des peptides diagnostiques dont le peptide C-terminal de la second doigt de zinc est plus fortement détecté par spectrométrie de masse (MS) et sert de marqueur approprié du statut redox ER-DBD. Données ont été recueillies auprès de deux différents instruments de MALDI-MS: un temps de vol et un piège à ions linéaire (vMALDI-éclairé). Un peptide synthétique analogue mais plus grand traité avec trois variantes isotopiques du réactif alkylant modélisé des chevauchements isotopiques qui pourraient compliquer la quantification relative de l'oxydation de la cystéine. Malgré les chevauchements isotopiques, excellente quantification relative a été réalisée à partir de MS données obtenues par les deux instruments. Cela est également vrai des données de MS/MS en tandem de le vMALDI éclairé, qui devraient faciliter le suivi de la réaction sélectionnée. Quantification relative par MS aussi étroitement les données des méthodes immunochimiques appariées.

Petite Immunopurification De Cytochrome C Oxydase Pour Une Analyse De Multiplexage Haut Débit De L'activité Enzymatique Et Le Montant

Biotechnology and Applied Biochemistry. Dec, 2007  |  Pubmed ID: 17508937

COX (cytochrome c oxydase) carence est l'une des principales causes de la maladie génétique mitochondriale et présente avec plusieurs phénotypes, selon si la mutation causative existe dans un gène mitochondrial ou nucléaire et si elle implique une composante structurelle ou catalytique altérée ou un facteur d'assemblage pour cette membrane incorporé 13-sous-unité complexe enzymatique. Déficience en COX est couramment observé dans AD (maladie d'Alzheimer), bien qu'il y a débat pour savoir si c'est un causatif ou une conséquence secondaire de la maladie. Niveaux altérés de COX et de capacité de phosphorylation oxydative réduite ont été signalés dans d'autres maladies courantes, y compris le cancer et sont considérés comme des effets secondaires indésirables dans un certain nombre de traitements médicamenteux, en particulier avec des traitements antirétroviraux et antibiotique. Ici, nous introduisons un protocole de plaque à 96 puits simple, rapide et à haut débit qui utilise une approche multiplexe pour déterminer la quantité et l'activité de la COX, qui devrait trouver l'utilisation répandue pour évaluer les maladies ci-dessus et dans les études d'innocuité de médicaments. Ce qui est important, la méthode utilise de très petites quantités de matériel cellulaire ou tissulaire et ne nécessite pas l'isolation des mitochondries. Nous montrons l'utilité de cette approche par l'exemple de l'analyse de fibroblastes de patients atteints de déficit de l'activité COX et l'effet de la ddC de médicaments antirétroviraux (2', 3'-didesoxycytidine) sur la biogenèse de l'enzyme.

Projet Seconde Classe De Haemophilus Ducreyi Souches Montrent Protéine Altérée Et Les Lipooligosaccharides Profils

Proteomics. Sep, 2007  |  Pubmed ID: 17676659

Haemophilus ducreyi est l'agent étiologique du chancre mou, un ulcérations génitales sexuellement transmissibles. Précédemment, nous avons montré que les profils protéiques et les lipooligosaccharides (LOS) structures de diverses souches d'h sont généralement bien conservées. Des études antérieures ont démontré qu'au moins une souche, 33921, a un profil protéique variant et la structure de LOS. Dans cette étude, tant le lysat de cellules entières et les protéines de la membrane de la souche 33921 encore examinées et par rapport à la souche prototype de 35000HP par 2-DE et de la 16-BAC (chlorure de benzyldimethyl-n-hexadecylammonium) / système de deux-détergent SDS-PAGE, respectivement. Ces comparaisons ont démontré qu'un certain nombre de protéines qui pourraient s'ajouter des deux souches avait modifié des positions sur les gels, tant dans leur poids moléculaire et des valeurs pI comprises. Souche 33921 a été suggérée d'être membre d'une classe de seconde des souches, appelées souches de classe II. Dans cette étude, les profils de la protéomique et les structures de LOS des cinq souches de II classe possibles examinées et jugées semblables à la souche 33921.

Analyse Protéomique De La Membrane Plasmique Et Vésicules Sécrétrices De Neutrophiles Humains

Proteome Science. 2007  |  Pubmed ID: 17692124

Polynucléaires neutrophiles (PMN) constituent une composante essentielle de cellulaire de défense de l'hôte innée contre l'invasion microbienne et présentent un large éventail de réponses à la fois à des stimuli particulaires et solubles. Comme les cellules recrutement plus tôt au cours de l'inflammation aiguë, PMN réagir rapidement et à libérer une variété de puissants agents cytotoxiques dans les minutes suivant l'exposition à des microbes ou de leurs produits. PMN s'appuient sur la redistribution des protéines fonctionnellement importantes, des compartiments intracellulaires de la membrane plasmique et le phagosome, comme le moyen permettant de répondre rapidement. Pour déterminer la gamme des protéines membranaires disponibles pour un recrutement rapid lors de l'activation de PMN, nous avons analysé les protéines dans les fractions subcellulaires, enrichies de la membrane plasmique et récupérés de la fraction légère de membrane de repos PMN après centrifugation en gradient de Percoll et purification d'électrophorèse de libre circulation à l'aide de méthodes basé sur la spectrométrie de masse protéomique des vésicules sécrétrices.

Identification De LpxL, Une Acyltransférase Fin De Francisella Tularensis

Infection and Immunity. Nov, 2007  |  Pubmed ID: 17724076

Lipopolysaccharide (LPS) est une composante majeure de la membrane externe des bactéries Gram-négatives, et la région de lipide A des LPS intervient dans la stimulation du système immunitaire d'une manière dépendante de la structure. À la différence du LPS de nombreuses autres bactéries Gram-négatives, le LPS de Francisella tularensis isolée de cultures in vitro n'est pas pro-inflammatoires. Cela observé manque de prouesses pro-inflammatoires peut-être refléter les caractéristiques structurelles du lipide A, comme le nombre et la longueur des chaînes acyles et le groupe de single-phosphate. Pour mieux comprendre ce phénotype, nous avons commencé à élucider la biosynthèse de LPS dans F. tularensis. Nous présentons une complémentarité, mutation, et des données chimiques montrant que F. tularensis FTT0232c encode une enzyme fonctionnelle, acyltransférase fin avec une spécificité similaire à celle de l'Escherichia coli LpxL orthologue. Expression de cette acyltransférase fin complétée la sensible à la température et phénotypes hypoacylated lipides A un mutant d'e. coli lpxL, expression de la FTT0232c est augmentée au cours de la croissance intracellulaire par rapport à celle au cours de la croissance in vitro, et enfin, LPS obtenus d'un mutant de F. tularensis manque FTT0232c ont montré une espèce de lipide A triacyl abondant après analyse par spectrométrie de masse, compatible avec la perte d'une acyltransférase fin LpxL.

Règlement De Transport De L'acide Sialique Et Le Catabolisme De Haemophilus Influenzae

Molecular Microbiology. Oct, 2007  |  Pubmed ID: 17880422

Virulence de nontypeable Haemophilus influenzae (polysaccharides) dépend de la décoration des lipooligosaccharides avec de l'acide sialique. Ce sucre doit être dérivé de l'hôte, comme polysaccharides ne peut pas synthétiser des acides sialiques. Polysaccharides peuvent également utiliser l'acide sialique comme source de carbone. Les gènes codant pour le transporteur de l'acide sialique et les gènes codant les activités cataboliques sont localisés respectivement à deux opérons transcrits de façon divergente, l'opéron siaPT et l'opéron nan. Dans cette étude, nous avons identifié SiaR comme un répresseur de transport de l'acide sialique et le catabolisme en polysaccharides. Inactivation du siaR a entraîné l'expression non réglementée des gènes dans les deux opérons. Non réglementée de catabolisme de l'acide sialique chez le mutant siaR entraîné une réduction de sialylation de surface et une augmentation de sensibilité du sérum. En plus de répression médiée par SiaR, CRP, la protéine de récepteur cAMP, s'est avéré activer l'expression de l'opéron siaPT mais pas l'opéron nan. Les auteurs décrivent un modèle dans lequel SiaR et CRP oeuvrent pour moduler les niveaux intracellulaires d'acide sialique. Nos résultats démontrent l'importance de la régulation SiaR un équilibre entre l'exigence de sialylation de surface et l'accumulation toxique de l'acide sialique intracellulaire.

Identification De Gènes Impliqués Dans L'expression Des Structures Lipooligosaccharide Atypique D'une Classe De Seconde De Haemophilus Ducreyi

Infection and Immunity. Jan, 2007  |  Pubmed ID: 17030566

Haemophilus ducreyi est une bactérie Gram-négative qui est l'agent responsable du chancre mou. La souche 35000HP a été bien caractérisée et est représentatif de la majorité des souches de H. ducreyi. Souche 35000HP produit un lipooligosaccharide (LOS) qui contient D-glycéro-D-manno-heptose dans l'extension de chaîne oligosaccharidique principal ; le gène lbgB a été démontré pour coder le DD-heptosyltransférase. Le gène de lbgB se trouve dans un groupe de gènes ainsi que le gène lbgA pour la galactosyltransférase j'ai. Ces deux gènes sont flanquées de gènes deux domestiques, rpmE et xthA, codant pour la protéine ribosomale L31 et l'exonucléase III, respectivement. Récemment, un deuxième groupe de souches de H. ducreyi ont été identifiées. Souche 33921, un représentant des souches classe II, produit un LOS qui n'a pas de DD-heptose au passage de son LOS oligosaccharide. Pour mieux comprendre la biosynthèse de la LOS en DD-heptose 33921, nous avons cloné et séquencé la région génomique correspondante de lbgAB de souche 33921. Semblable à la souche 35000HP, 33921 génome contient xthA et rpmE. Toutefois, entre ces deux gènes nous avons identifié des gènes codant pour deux glycosyltransférases putatifs qui n'étaient pas très homologues aux gènes de la lbgAB 35000HP. Dans cette étude, nous démontrons que le produit de l'un de ces gènes encode un galactosyltransférase. En outre, hybridation dot déterminé que 3 de 35 souches testées avaient les transférases atypiques présents, comme l'a fait 4 souches caractérisées comme étant des souches de classe II par l'autre critère. Ces données indiquent que les gènes lbgAB peuvent servir comme indicateur de la classification des souches de H. ducreyi.

Caractérisation Du Site N-acétyl-5-neuraminique Acid-binding Du Récepteur Soluté Extracytoplasmique (ISAP) De Nontypeable Haemophilus Influenzae Souche 2019

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2008  |  Pubmed ID: 17947229

Nontypeable Haemophilus influenzae est un pathogène humain opportuniste, causant une otite chez les enfants et la bronchite chronique et pneumonie chez des patients atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. La membrane externe de nontypeable H. influenzae est dominée par les lipooligosaccharides (LOS), dont beaucoup incorporent l'acide sialique en un terminal sucres non-réducteurs. L'acide sialique a démontré être un facteur important dans la survie des bactéries dans l'environnement hôte. H. influenzae est incapable de synthétiser l'acide sialique et dépendent de nettoyage acide sialique libre de l'environnement hôte. Pour ce faire, H. influenzae utilise un transporteur périplasmique tripartite de ATP-indépendante. Dans cette étude, nous caractériser le site de liaison du récepteur soluté extracytoplasmique (ISAP) de la souche de nontypeable H. influenzae 2019. Une structure cristalline de l'acide N-acétyl-5-neuraminique (Neu5Ac)-ISAP lié était déterminé à 1,4 a résolution. Caractérisation thermodynamique de liaison Neu5Ac montre que cette interaction est un conduit avec une contribution substantielle défavorable de l'entropie. C'est prévu, car la liaison de l'ISAP à Neu5Ac est médiée par les nombreuses liaisons hydrogènes et a plusieurs molécules d'eau enterrées. Les mutations ponctuelles ciblant des acides aminés spécifiques ont été introduites dans le site de liaison putatif. Complémentarité avec les constructions de l'ISAP muté a entraîné soit complète, partielle, ou aucune complémentation, selon le rôle des résidus spécifiques. Analyse de spectrométrie de masse du O-désacétylé LOS de la mutation de point R127K a confirmé l'observation d'une incorporation réduite de Neu5Ac dans le LOS. La diminution de la capacité de H. influenzae à importer de l'acide sialique a eu des effets négatifs sur la résistance au meurtre médiée par le complément et la viabilité des biofilms in vitro, qui confirme l'importance du transport de l'acide sialique à la bactérie.

Caractérisation De Mutants HtrB Et MsbB De L'orgue Lumineux Symbiont Vibrio Fischeri

Applied and Environmental Microbiology. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18065606

Lipide bactérien A est un médiateur important des interactions hôte-bactérie et acylations secondaires ajoutées par HtrB et MsbB peut être critiques pour la colonisation et la virulence des infections pathogènes. En revanche, lipide de Vibrio fischeri A stimule les processus de développement normales dans d'accueil mutualiste de cette bactérie, Euprymna scolopes, bien que l'importance des lipides, une structure dans cette symbiose est inconnue. Pour examiner davantage V. fischeri lipide A et sa fonction symbiotique, nous avons identifié deux paralogues htrB (appelés les htrB1 et htrB2) et un gène msbB chez V. fischeri ES114 et démontré que ces gènes codent lipide A acyltransférases secondaire. htrB2 et msbB sont trouvent sur le chromosome de Vibrio « ménage » 1 et sont conservées chez d'autres espèces de Vibrio. Mutations htrB2 et msbB ne portait pas atteinte à la colonisation symbiotique, mais a entraîné des modifications phénotypiques dans la culture, y compris réduit la motilité et augmenté la luminescence. Ces mutations affecte également la sensibilité de dodécyl sulfate de sodium, kanamycine et polymyxine, cohérent avec les changements dans la perméabilité de la membrane. À l'inverse, htrB1 est situé sur le chromosome 2 de vibrio plus petits, plus variable, et un mutant htrB1 était sauvage-type comme en culture mais semblait atténuée en initiant la symbiose et fluocompactes heures pendant la colonisation, lorsqu'il est mélangé avec le parent. Ces données suggèrent que les htrB2 et msbB jouent un rôle général conservé en biologie de vibrio, tandis que htrB1 joue un rôle plus spécifique à la symbiose dans V. fischeri.

Acétylation Partielle Des Résidus Lysine Améliore La Réticulation D'intraprotein

Analytical Chemistry. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18201069

Réticulation intramoléculaire couplée à une identification par spectrométrie de masse des aminoacides réticulés est une méthode rapide pour élucider des structures tertiaire de la protéine basse résolution ou familles de pli. Toutefois, des études antérieures de réticulation des protéines de modèle, tels que le cytochrome c et de la ribonucléase A, identifié un nombre limité des réticulations peptide qui est biaisée vers seulement quelques-uns des résidus lysine potentiellement réactifs. Ici, nous présentons une approche pour améliorer la diversité des protéines intramoléculaire réticulation commençant par un dosage systématique de la réactivité des résidus lysine d'une protéine modèle, bovine cytochrome c. lysine Relative réactivités parmi les 18 résidus lysine du cytochrome c ont été déterminées par le rapport des groupes de d0 et acétyl-d3 à chaque lysine après acétylation partielle avec l'acétate de sulfosuccinimidyl suivie de dénaturation et acétylation quantitative de demeurer non modifié lysines avec l'anhydride acétique-d6. Ces réactivités de la lysine ont ensuite comparées avec pKa théoriquement dérivée et les valeurs de surface relative accessibilité solvant. Afin de déterminer si N-acétylation partielle des résidus lysine plus réactifs avant réticulation peut rediriger et augmenter l'observable Lys-Lys cross-links, bovine partiellement acétylés du cytochrome c a été réticulé avec le réactif spécifique amine, BRI-fonctionnel, subérate de bis (sulfosuccinimidyl). Après la protéolyse et analyse par spectrométrie de masse, l'acétylation partielle s'est avérée augmenter significativement le nombre de peptides observables contenant des liens croisés Lys-Lys, déplaçant le modèle dans les résidus de lysine plus réactives à ceux moins réactif. Plus important encore, ces peptides réticulés supplémentaires contenaient des informations de réticulation Lys-Lys roman pas vu dans la protéine non acétylée et fourni des contraintes de distance supplémentaire qui étaient compatibles avec la structure cristalline et a facilité l'identification de la bergerie de protéine appropriée.

Un Site De Phosphorylation De Sérine Roman Détecté Dans Le Domaine N-terminal Du Récepteur Des Oestrogènes Isolé Des Cellules Cancéreuses Du Sein Humain

Journal of the American Society for Mass Spectrometry. May, 2008  |  Pubmed ID: 18367407

Récepteur des oestrogènes activés (ERalpha) joue un rôle essentiel dans le développement du cancer du sein et est un important objectif pour le traitement de la toxicomanie. Phosphorylation de la sérine dans le domaine N-terminal (NTD) contribue à l'activation de ERalpha et peut également provoquer une résistance aux médicaments. Précédente identification biochimique des résidus de ERalpha phosphorylés se limitait à la protéine surexprimée artificiellement dans les cellules transfectées. Nous rapportons des méthodes par spectrométrie de masse qui ont permis l'identification d'un nouveau site au sein de l'ATN de ERalpha isolées de cellules cancéreuses humaines cultivées. Immunoprécipitation, digestion trypsique et analyse par nano-LC-ESI-MS/MS (Q-STAR, MDS Sciex) et vMALDI-MS(n) (LTQ Finnigan, Thermo-Electron) identifié peptides contenant 8 des 14 résidus sérine au sein de l'ATN, un étant partiellement phosphorylée Ser-167, connu mais n'a pas été signalée par la chymotrypsine MS. digestion a révélé d'autres sites connus à Ser-102/104/106 et 118. Tandem méthodes mises au point pour le peptide contenant Ser-118 et l'utilisation des expériences sur des hypothèses--c'est-à-dire l'hypothèse qu'un phosphopeptide intact ne montrant aucun ion moléculaire pourrait donner des ions fragments, y compris la perte de l'acide phosphorique dans vMALDI-MS/MS--a permis d'identifier un nouveau site à Ser-154. Dosage en surveillant la réaction sélectionnée démontré augmentations 6 fois et 2.5-fold Ser-154 phosphorylation dans les cellules et EGF-traités à l'estradiol, respectivement, comparativement aux témoins, confirmés par immunotransfert avec un anticorps polyclonal de lapin roman. Ainsi, l'isolement de la protéine et MS stratégies décrites ici peuvent faciliter la découverte des sites de phosphorylation nouveaux au sein de faible abondance, cliniquement important objectifs du cancer comme ERalpha et peuvent ainsi contribuer à notre compréhension du rôle de la phosphorylation dans le développement du cancer du sein.

Cartographie Systématique Des Modifications Post-traductionnelles Au Récepteur Des œstrogènes Humains Alpha En Mettant L'accent Sur Les Sites De Phosphorylation Roman

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Mar, 2009  |  Pubmed ID: 18984578

On rapporte une étude systématique des modifications post-traductionnelles de récepteur estrogénique isolée de la lignée de cellules cancéreuses du sein MCF-7. Protéolyse avec plusieurs enzymes, spectrométrie de masse et spectrométrie de masse obtenu une couverture très élevée de séquence pour la protéine endogène de pleine longueur 66 kDa de cultures cellulaires traités à l'estradiol. Les résidus sérine phosphorylée neuf ont été identifiés, dont trois ont été antérieurement et dont aucune n'avaient été observés auparavant par spectrométrie de masse par un autre laboratoire. Deux résidus sérine modifiés supplémentaires ont été identifiés dans la protéine recombinante, on signalé auparavant mais pas observé ici en protéines endogènes et les autres, jusqu'alors inconnu. Bien que l'accent a été placé sur l'identification de nouveaux sites de phosphorylation, perte de la N-terminale de la méthionine accompagnée d'acétylation amine et une lysine côté chaîne acétylation (ou peut-être triméthylation) ont aussi été détectés. L'utilisation de HPLC-ESI et MALDI interfacé aux différents analyseurs de mass ont couvert plu de séquence et identifié les sites plus que pourrait être atteint par chaque méthode seule. Le récepteur d'oestrogène est essentiel dans le développement et la progression du cancer du sein. Auparavant, un inédit site de phosphorylation identifié ici s'est avéré être dépendent fortement de l'estradiol, confirmant son importance potentielle pour le cancer du sein. Une meilleure connaissance de ce tableau des modifications post-traductionnelles du récepteur des oestrogènes, en particulier la phosphorylation, augmenteront notre compréhension des processus qui conduisent à l'estradiol induite par l'activation de cette protéine et peut favoriser le développement de stratégies thérapeutiques pour le traitement du cancer du sein hormono-dépendant.

IDPicker 2.0: Assemblée Protéine Améliorée Avec La Haute Identification Peptide Discrimination Filtrage

Journal of Proteome Research. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19522537

Tandem protéomique de masse de fusil de chasse par spectrométrie de est devenu une technologie largement répandue d'analyse de mélanges complexes de protéines. Un certain nombre d'algorithmes de base de données de recherche ont été mis au point pour attribuer des séquences peptidiques à des spectres de masse en tandem. Assemblage des identifications peptidiques des protéines, cependant, est une question difficile, car de nombreux peptides sont partagés entre de multiples protéines. IDPicker est un outil open-source de protéines de montage qui dérive d'une liste minimale en protéines des identifications peptidiques filtrés à un taux de fausses découvertes spécifié. Ici, nous mettons à jour IDPicker d'augmenter les identifications peptidiques confiants en combinant les scores multiples produites par des outils de recherche de bases de données. En séparant les identifications pour les peptides d'un seuil en utilisant à la fois l'état de charge de précurseur et le nombre d'extrémités tryptiques, IDPicker récupère plus de peptides pour l'assemblage des protéines. La nouvelle version est plus robuste contre les fausses protéines positives, en particulier dans les recherches à l'aide de bases de données multi-espèces, en exigeant de nouveaux peptides supplémentaires dans le processus de parcimonie. IDPicker a été conçu pour être incorporé dans les flux d'identification de nombreux par l'addition d'une interface utilisateur graphique et la capacité de lire les identifications à partir du format pepXML. Ces IDPicker position de progrès pour la discrimination peptide haute et l'assemblage de protéines fiable dans des études de protéomique à grande échelle. Le code source et les binaires pour la dernière version de IDPicker sont disponibles à partir http://fenchurch.mc.vanderbilt.edu/.

Multi-site D'évaluation De La Précision Et La Reproductibilité Multiples Réaction De Surveillance Des Mesures Basées Sur Des Protéines Dans Le Plasma

Nature Biotechnology. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19561596

Vérification des biomarqueurs candidats s'appuie sur des analyses quantitatives spécifiques, optimisés pour la détection sélective de protéines cibles, et il est de plus en plus considérée comme une étape cruciale dans le pipeline de découvertes que la découverte de biomarqueurs ponts impartiale à la validation préclinique. Bien que les laboratoires individuels ont démontré que le suivi de réactions multiples (MRM) couplée à la spectrométrie de masse des isotopes de dilution permet de quantifier des biomarqueurs protéiques candidats dans le plasma, la reproductibilité et la transférabilité de ces dosages entre les laboratoires n'ont pas été démontrées. Nous décrivons une étude multilaboratoires pour évaluer la reproductibilité, la récupération, la gamme dynamique linéaire et les limites de détection et de quantification des multiplexées, MRM-titrages effectués par le NCI-CPTAC. L'utilisation de matériaux communs et des protocoles normalisés, nous démontrons que ces tests peuvent être hautement reproductible au sein et entre les laboratoires et les plates-formes d'instruments, et sont sensibles à de faibles concentrations de protéines mug / ml dans le plasma non fractionnée. Nous fournissons des données et repères par rapport auxquels les laboratoires individuels peuvent comparer leurs performances et évaluer les nouvelles technologies pour la vérification des biomarqueurs dans le plasma.

Calpaïne-1 Fend Et Active Caspase-7

The Journal of Biological Chemistry. Sep, 2009  |  Pubmed ID: 19617626

Caspase-7 est un bourreau caspase qui joue un rôle clé dans l'apoptose, cancer et un certain nombre de maladies neurodégénératives. Le mécanisme d'activation de la caspase-7 par granzyme B et de la caspase-3 a été bien caractérisé. Toutefois, si les autres protéases tels que calpaïnes activer ou inactivent caspase-7 ne sait pas. Ici, nous présentons cette recombinant caspase-7 est directement clivé par la calpaïne-1 au sein de la grande sous-unité de caspase-7 pour produire deux nouveaux produits, la grande sous-unité p18 et p17. Cette nouvelle forme de caspase-7 a une augmentation de 6 fois en V(max) par rapport à la forme p20/p12 précédemment caractérisée. Zymographie ont révélé que le plus petit produit de caspase-7 (p17) ont plus actif que le produit de caspase-3 clivée (p20) ou le plus grand produit calpaïne-1 de caspase-7 (p18). Spectrométrie de masse et de mutagenèse identifié les calpaïne sites de clivage au sein de la grande sous-unité de caspase-7 à 36 et 45/47 d'acides aminés. Ces événements de protéolyse se produiront in vivo, comme indiqué par l'accumulation de caspase-7 p18 et p17 sous-unités dans des neurones corticaux, subissant une dysrégulation Ca(2+). En outre, clivage aux acides aminés 45/47 de caspase-7 par la calpaïne entraîne une réduction de localisation nucléaire en comparaison avec le produit de clivage de la caspase-3 de caspase-7 (p20). Nos études suggèrent que la forme activée calpaïne de caspase-7 a unique activité enzymatique, de localisation et d'affinité de liaison par rapport à la forme de caspase-activé.

Nitration Préférentiellement Une Augmentation De L'alpha-synucléine Tyrosine-39 Dans Un Modèle Cellulaire Oxydatif De La Maladie De Parkinson

Analytical Chemistry. Sep, 2009  |  Pubmed ID: 19697948

Alpha-synucléine est une composante importante du corps de Lewy, les inclusions de proteinacious qui sont une caractéristique majeure de la maladie de Parkinson (MP). Corps de Lewy contiennent des niveaux élevés de résidus de tyrosine nitrée tel que déterminé par les anticorps spécifiques pour les 3-nitrotyrosine (3NT) et par spectrométrie de masse (MS). Nous avons développé une réaction plusieurs méthode de spectrométrie de masse (MRM) pour doser avec sensibilité les niveaux 3NT des résidus tyrosine alpha-synucléine spécifiques de suivi. Nous avons constaté une permis augmentation (par rapport aux témoins) niveaux de 3NT à Tyr-39 de l'alpha-synucléine dans un inductible transgéniques modèle cellulaire de la maladie de Parkinson dans lequel la monoamine oxydase B (MAO-B) est surexprimé et qui émule plusieurs fonctionnalités de nitration PD. augmentation de Tyr-39 sur alpha-synucléine endogène par l'élévation des niveaux de MAO-B pourrait être abrogée par l'addition de déprényl, un inhibiteur spécifique de la MAO-B. L'augmentation des niveaux de 3NT était sélective pour Tyr-39 car aucune hausse significative des niveaux 3NT ont été détectés aux autres résidus tyrosine présents dans les protéines (Tyr-125, Tyr-133 et Tyr-136). C'est le premier rapport des niveaux 3NT accrue d'une tyrosine spécifique dans un modèle de PD et de la première utilisation de la spectrométrie de masse de MRM pour quantifier les changements 3NT modifications à des sites spécifiques au sein d'une protéine cible.

Le Mycobacterium Bovis Bacille Calmette-Guérin Phagosome Proteome

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 19815536

Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin (BCG) modifient la maturation de leurs phagosomes et résident dans un compartiment qui résiste à l'acidification et la fusion avec les lysosomes. Pour définir la composition moléculaire de ce compartiment, nous avons mis au point une nouvelle méthode pour l'obtention des phagosomes hautement purifiées de macrophages humains infectés par le BCG et analysé les phagosomes par immunobuvardage de type Western et basé sur la spectrométrie de masse protéomique. Notre procédure de purification a révélé que le BCG cultivé sur un milieu artificiel devienne moins dense après une croissance dans les macrophages. Par immunobuvardage de type Western, LAMP-2, protéine de Niemann-Pick C1 et syntaxine 3 étaient facilement détectables sur le phagosome BCG mais à des niveaux inférieurs sur le phagosome perle au latex ; Flotillin-1 et l'ATPase vacuolaire étaient à peine détectable sur le phagosome BCG mais hautement enrichissent sur le phagosome perle au latex. Études d'immunofluorescence a confirmé la rareté des flotillin sur les phagosomes BCG et a démontré une corrélation inverse entre l'activité métabolique bactérienne et flotillin sur les phagosomes de M. tuberculosis. Par spectrométrie de masse, 447 hôte humain protéines ont été identifiées sur les phagosomes BCG, et un ensemble partiellement superposés de 289 protéines humaines sur les phagosomes de billes de latex a été identifié. Fait intéressant, la plupart des protéines identifiées systématiquement sur les préparatifs du phagosome BCG a également identifiée sur les phagosomes perle latex, indiquant un degré élevé de chevauchement dans la composition en protéines de ces deux compartiments. Il est probable que beaucoup de différences dans la composition en protéines est quantitatives plutôt que qualitatives en nature. Malgré le chevauchement remarquable dans la composition en protéines, nous avons identifié systématiquement un certain nombre de protéines sur les phagosomes BCG qui ne figuraient pas dans aucune de nos préparatifs du phagosome perle latex, y compris les protéines impliquées dans le trafic de membrane et de transduction de signal, comme la protéine Ras GTPase-activation-comme IQGAP1 et de protéines de fonction inconnue, telles que FAM3C. Notre méthode de purification phagosome et les analyses protéomique initial ouvert la voie à une analyse comparative quantitative des protéomes phagosome talon mycobactérienne et latex.

Performance Metrics Pour Chromatographie En Phase Liquide En Tandem Systèmes De Spectrométrie De Masse Dans Les Analyses Protéomiques

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19837981

Un besoin majeur non satisfait dans les analyses protéomiques LC-MS/MS-based est un ensemble d'outils pour l'évaluation quantitative des performances du système et l'évaluation de la variabilité technique. Nous décrivons ici 46 indicateurs de performance du système de suivi des performances chromatographiques, la stabilité source électrospray, MS1 et MS2 signaux, échantillonnage dynamique d'ions pour MS / MS, et l'identification des peptides. Appliqué à des ensembles de données provenant d'analyses LC-MS/MS répétés, ces mesures cohérentes, affiché des réponses raisonnables aux perturbations contrôlées. Les indicateurs généralement affiché des variations de moins de 10% et peut donc révéler des différences subtiles dans la performance même des composants du système. Les analyses des données provenant d'études interlaboratoires menées dans le cadre d'une procédure d'exploitation standard commun identifiés données aberrantes et ont fourni des indices à des causes spécifiques. En outre, la variation interlaboratoire reflétée par les indicateurs qui indique les composants du système varient le plus entre les laboratoires. L'application de ces mesures permet rationnelle, l'évaluation quantitative de la qualité pour la protéomique et LC-MS/MS d'autres applications analytiques.

Étude Interlaboratoires Caractérisation D'une Norme De Performance Pour La Performance De Levure Plate-forme D'analyse Comparative LC-MS

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19858499

Une performance optimale des plates-formes LC-MS/MS est essentiel pour générer de haute qualité des données de protéomique. Bien que les laboratoires ont mis au point des échantillons de contrôle de qualité, il n'y a aucune norme de rendement largement disponibles de la complexité biologique (et ensembles de données associées de référence) pour l'étalonnage des performances plate-forme pour l'analyse des protéomes complexes biologiques dans des laboratoires différents dans la communauté. Préparations individuelles de la levure Saccharomyces cerevisiae protéome ont été largement utilisés par les laboratoires dans la communauté protéomique pour caractériser la performance plate-forme LC-MS. Le protéome de la levure est unique attrayant en tant que norme de rendement, car il est le plus largement caractérisé protéome biologique complexe et la seule associée avec plusieurs études à grande échelle d'estimation de l'abondance de toutes les protéines détectables. Dans cette étude, nous décrivons un protocole d'exploitation standard pour la production à grande échelle de la norme de rendement de la levure et des aliquotes offre à la communauté par l'intermédiaire du National Institute of Standards et de la technologie où le protéome de la levure est en cours de développement en tant que matériau de référence certifié pour répondre à long terme besoins de la communauté. En utilisant une série de paramètres qui caractérisent LC-MS performances, nous fournissons un ensemble de données de référence établies démontrant la performance typique de plates-formes d'ions couramment utilisés dans les laboratoires d'instruments piège d'experts, les résultats fournissent une base pour les laboratoires de comparer leurs propres performances, à améliorer les méthodes actuelles , et à évaluer les nouvelles technologies. En outre, nous montrons comment la référence de la levure, enrichi avec des protéines humaines, peut être utilisé pour comparer la puissance des plates-formes en protéomique pour la détection de protéines différentiellement exprimés à différents niveaux de concentration dans une matrice complexe, fournissant ainsi une métrique pour évaluer et minimiser les pré- variation analytique et analytique dans les expériences de protéomique comparative.

Répétabilité Et De Reproductibilité Dans Identifications Protéomiques Par Spectrométrie De Liquide Chromatographie De Masse En Tandem

Journal of Proteome Research. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19921851

La complexité de l'instrumentation pour la protéomique LC-MS/MS introduit de nombreuses sources possibles de la variabilité. Dépendant des données d'échantillonnage des peptides constitue un élément stochastique au cœur de la protéomique découverte. Bien que cette variation affecte l'identification des peptides, des identifications protéomiques sont loin d'être complètement aléatoire. Dans cette étude, nous avons analysé les ensembles de données interlaboratoires du NCI évaluation des technologies de protéomique clinique pour le cancer afin d'examiner répétabilité et de reproductibilité dans des peptides et des protéines identifications. Les données incluses duré 144 expériences LC-MS/MS sur quatre Thermo LTQ et quatre instruments Orbitrap. Les échantillons inclus lysat de levure, le NCI-20 définie mélange dynamique des protéines gamme, et l'onduleur Sigma 1 mix défini protéines équimolaire. Certains de nos résultats renforcé la sagesse conventionnelle, tels que la répétabilité et la reproductibilité étant plus élevée pour les protéines que pour les peptides. La plupart des leçons à partir des données, toutefois, sont plus subtiles. Orbitraps prouvé capable de répétabilité et de reproductibilité élevée, mais la performance aberrante parfois effacé ces gains. Même les plus simples digestions de protéines a donné plus d'ions peptidiques que LC-MS/MS pu identifier au cours d'une expérience unique. Nous avons observé que les listes de paires de peptides technique répétitions chevauché par 35-60%, ce qui donne une gamme pour le peptide niveau répétabilité dans ces expériences. Complexité de l'échantillon ne semble pas affecter la répétabilité identification de peptides, de même que le nombre de spectres identifiés modifiés par un ordre de grandeur. L'analyse statistique des chiffres de protéines spectrales ont révélé une plus grande stabilité à travers technique répétitions pour Orbitraps, ce qui les rend supérieurs aux instruments pour la découverte de LTQ candidat biomarqueur. Les peptides les plus reproductibles sont ceux correspondant à des sites de clivage traditionnelles tryptiques, ceux qui produit intenses signaux MS, et celles qui ont résulté de protéines génératrices de nombreux peptides distincts. La reproductibilité entre les différents instruments du même type en retard répétabilité des techniques réplique sur un seul instrument de quelques pour cent. Ces résultats renforcent l'importance d'évaluer la répétabilité comme une caractéristique fondamentale des technologies analytiques.

Adoucir Le Pot: Ajout Glycosylation à L'équation Découverte De Biomarqueurs

Clinical Chemistry. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19959616

Le cancer a des effets profonds sur l'expression génique, y compris les machines de glycosylation d'une cellule. Ainsi, les tumeurs produisent des glycoprotéines qui transportent des oligosaccharides avec des structures qui sont nettement différentes de la même protéine produite par une cellule normale. Une seule protéine peut avoir plusieurs sites de glycosylation qui a grandement amplifier les signaux qu'ils génèrent par rapport à leurs squelettes protéiques.

Utilisant La Voie De Biosynthèse De O-antigène Lipopolysaccharide Escherichia Coli Pour Interroger Les Spécificités De Substrat Exogène Glycosyltransferase Gènes Dans Une Approche Combinatoire

Glycobiology. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20208062

Dans de précédents travaux, notre laboratoire a généré roman chimériques lipopolysaccharides (LPS) chez Escherichia coli transformées avec un plasmide contenant des gènes de synthèse de lipooligosaccharide exogène (lsg) d'Haemophilus influenzae. Analyse de ces chimères roman oligosaccharide-LPS a permis la caractérisation des structures glucides générées par plusieurs gènes putatifs glycosyltransférase dans le locus lsg. Ici, nous avons adapté cette stratégie pour construire une approche modulaire pour étudier les propriétés synthétiques des glycosyltransférases individuels exprimés, seuls ou en combinaisons. À cette fin, un ensemble d'expression vecteurs contenant les gènes putatifs glycosyltransferase 1 à 4 du locus lsg, lsgC-F, ont été transformées en e. coli K12 (XL-1) qui est défectueux dans la biosynthèse de l'antigène O LPS. Cette stratégie s'est appuyée sur l'inclusion de la H. influenzae gène produit lsgG dans chaque construction plasmidique, qui partiellement sauve le défaut de la biosynthèse de LPS d'e. coli en amorçant l'uridine diphosphate-undecaprenyl dans la voie synthétique de l'antigène O WecA dépendant avec la N-acétyl-glucosamine (GlcNAc). Cette GlcNAc-undecaprenyl a ensuite servi comme un substrat accepteur pour la prorogation de glucides par des glycosyltransférases transformés. Les résultantes LPS-chimériques glycanes ont été isolés de leurs constructions d'e. coli et caractérisent par spectrométrie de masse, l'analyse de la méthylation et enzyme-linked immunosorbent assays. Ces données structurelles ont permis la spécificité des glycosyltransférases divers à attribuer sans ambiguïté aux gènes individuels. LsgF s'est avéré terminal GlcNAc à transférer un galactose (Gal). LsgE a été trouvé pour transférer GlcNAc à Gal-GlcNAc et LsgF tant LsgD trouvées pour transférer le Gal GlcNAc-Gal-GlcNAc mais avec différentes spécificités de linkage. Cette méthode peut être généralisée et facilement adaptée pour étudier la spécificité de substrat d'autres glycosyltransférases putatifs ou indéterminés.

Ciblées De Quantification De L'oxydation De La Cystéine in Situ Dans Des Protéines Endogènes à L'aide D'une Différentielle Alkylation Et Réaction Multiples Suivi L'approche De La Spectrométrie De Masse

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20233844

Espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont les deux intermédiaires physiologiques dans la signalisation cellulaire et les médiateurs de stress oxydatif. La cystéine spécifique redox-sensibilité des protéines peut faire la lumière sur comment les ROS sont réglementés et la fonction, mais la faible sensibilité a limité la quantification de l'état redox de nombreux régulateurs cellulaires fondamentaux dans un contexte cellulaire. Nous décrivons ici une approche d'analyse hautement sensible et reproductible de l'oxydation (OxMRM) qui combine la purification des protéines, alkylation différentielle avec des isotopes stables et la réaction multiples suivi de spectrométrie de masse qui peut être appliquée de manière ciblée à pratiquement n'importe quel cystéine ou protéine. En utilisant cette approche, nous quantifiée de l'état d'oxydation in situ de cystéine de p53 endogène pour la première fois et a constaté que les Cys182 à l'interface de dimérisation du domaine de liaison de l'ADN est particulièrement sensible à l'oxydation diamide intracellulairement. OxMRM permet d'analyser sulfinique et niveaux d'oxydation acide sulfonique, qui nous validons en évaluant l'oxydation de le Cys215 catalytique de la protéine tyrosine phosphatase-1 b sous de nombreuses conditions oxydantes. OxMRM complète également les études de découverte protéomique rédox impartiale comme un outil de vérification par le biais de sa haute sensibilité, exactitude, précision et débit.

Trafic ErbB2 Et Dégradation Associée K48 Et K63 Polyubiquitination

Cancer Research. May, 2010  |  Pubmed ID: 20406983

Le récepteur ErbB2/HER2 surexprimée est une cible de cancer cliniquement validés dont surfaces localisation et internationalisation les mécanismes restent mal compris. Diminution de l'expression du récepteur ErbB2 surexprimée 185 kDa est rapide (2 à 6 heures) induite par la HSP90 chaperon inhibiteur geldanamycine (GA), tandis que sa diminution de l'expression et la dégradation lysosomale sont plus lentement (24 heures) induites par l'inhibiteur du protéasome bortézomib/PS341. Dans les cellules traitées PS341 SK-BR-3, surexprimé ErbB2 coprecipitates avec l'E3 ubiquitine ligase c-Cbl ainsi qu'avec l'enzyme deubiquitinating USP9x ; en outre, siARN downregulation de USP9x améliore downregulation induite par PS341 ErbB2. Parce que polyubiquitine liens par l'intermédiaire de lysine 48 (K48) ou 63 (K63) peuvent différentiellement protéines adresse pour dégradation de protéasome 26 s ou endosome trafic vers le lysosome, réaction multiples (MRM) de surveillance / spectrométrie de masse (MS) et des anticorps spécifiques linkage polyubiquitine servaient à suivre quantitativement K48-liés et liés-K63 polyubiquitination ErbB2 après traitement GA ou PS341 de cellules SK-BR-3. MRM/MS a révélé que, contrairement à la rapide, modeste (4 fois à 8 fois), et l'induction GA synchrone de K48 et K63 polyubiquitinée ErbB2, PS341 produit une dramatique (20 fois à 40 fois) augmentation séquentielle polyubiquitinée ErbB2 compatible avec K48 polyubiquitination suivie K63 édition. Imagerie microscopique de fluorescence a confirmé que PS341, mais pas de GA, induit la co-localisation de K48 liés et polyubiquitine K63 liés à périnucléaires lysosome-séquestré ErbB2. Ainsi, surexpression de surface ErbB2 et recyclage semblent dépendre de ses polyubiquitination et déubiquitination ; ainsi, les effets contrastés de PS341 et GA sur la localisation du récepteur ErbB2 polyubiquitination et dégradation pointent remplaçant cytoplasmique traite probablement réglementées par différent polyubiquitine K48 et K63 édition des mécanismes.

Identification, Caractérisation Et Immunogénicité D'un Polysaccharide Capsulaire De L'antigène O De Francisella Tularensis

PloS One. 2010  |  Pubmed ID: 20625403

Les polysaccharides capsulaires sont des facteurs importants dans la pathogenèse bactérienne et ont été la cible d'un certain nombre de vaccins efficaces. Francisella tularensis a été examiné pour exprimer un antigène capsulaire, mais aucun n'a été isolé ou caractérisée. Nous avons développé un anticorps monoclonal, 11B7, qui reconnaît le polysaccharide capsulaire de F. tularensis migration sur Western blot comme une bande diffuse entre 100 kDa et 250 kDa. La capsule taches mal sur SDS-PAGE, avec la tache argentée, mais peut être visualisée à l'aide de tache de glycoprotéine ProQ émeraude. La capsule semble être hautement conservée chez les souches de F. tularensis comme anticorps 11B7 lié à la capsule de 14 de 14 F. tularensis souches de type A et B sur la tache occidentale. Le matériel capsulaire peut être essentiellement gratuit isolé de LPS, est précipitable phénol et la protéinase K résistant, d'éthanol et ne pas dissocier de dodécyl sulfate de sodium. Immunomicroscopie électronique avec l'or colloïdal montre 11B7 sur sa circonférence à la coloration de la surface de F. tularensis, qui est typique d'une capsule polysaccharidique. Spectrométrie de masse, analyse de la composition et RMN indiquent que la capsule est composée d'un polymère de la répétition de tétrasaccharide, 4) - alpha - D - GalNAcAN-(1-> 4) - alpha - D - GalNAcAN-(1-> 3) - bêta - D - QuiNAc-(1-> 2) - bêta - D - Qui4NFm-(1-, qui est identique à la décrit précédemment F. tularensis sous-unité de l'antigène O. Cela indique que la capsule de F. tularensis peut être classifiée comme un polysaccharide capsulaire de l'antigène O. Nos études indiquent que F. tularensis mutants glycosyltransferase antigène O ne font pas une capsule. Un F. tularensis acyltransférase et un mutant de polymérase d'antigène O n'avaient aucune preuve d'un O-antigène, mais exprime un antigène capsulaire. Immunisation passive des souris BALB/c avec 75 microgrammes de 11B7 protégé contre un 150 plier létal de F. tularensis LVS. L'immunisation active des souris BALB/c avec 10 microg de capsule a montré un niveau de protection similaire. Ces études démontrent que la F. tularensis produit une capsule de l'antigène O qui peut-être constituer la base d'un futur vaccin.

Identification De Nouveaux Modulateurs Et Altérations De Protéine Non-apoptotique De La Mort Cellulaire Programmée

Journal of Cellular Biochemistry. Dec, 2010  |  Pubmed ID: 20830744

Cette étude décrit la première analyse protéomique de paraptosis--une forme non-apoptotique de mort cellulaire programmée. Comme avec l'apoptose, la première description de paraptosis était fondée sur des critères morphologiques. Puisqu'il n'y a aucun marqueur connu pour paraptosis, le but de cette étude était de disséquer les changements dans le profil de proteome survenant au cours de la paraptosis. Aide - et bi-dimensionnelle SDS-PAGE, analyse occidentale et spectrométrie de masse, nous montrent qu'au cours de la paraptosis, les changements se produisent principalement dans les protéines du cytosquelette, les protéines de transduction de signal, protéines mitochondriales et certaines protéines métaboliques. Nous rapportons également l'identification de: (1) un inhibiteur de la paraptosis, protéine de liaison de la phosphatidyléthanolamine (PEBP-1) et (2) un candidat médiateur de paraptosis, prohibitin. Identification des changements spécifiques paraptotic aboutira à des outils pour détecter ce type de mort cellulaire programmée dans des systèmes in vivo et de permettre sa une caractérisation plus poussée.

Quantitative Cartographie Du Complexe Mitochondrique Réversible J'oxydation De La Cystéine Dans Un Modèle De Souris De La Maladie De Parkinson

The Journal of Biological Chemistry. Mar, 2011  |  Pubmed ID: 21196577

Oxydation de la cystéine différentielle complexe mitochondrique j'ai a été quantifié dans un modèle de stress oxydatif in vivo de la maladie de Parkinson. Nous avons développé une stratégie qui intègre la purification rapide et efficace d'immuno-affinité du complexe, j'ai suivi par alkylation différentielle et détection quantitative utilisant des techniques de spectrométrie de masse sensible. Cette méthode nous a permis de quantifier l'état d'oxydation de cystéine réversible de 34 résidus cystéine distinctes sur un total de 130 présents dans murin complexe I. Six complexes je cystéine résidus trouvées pour afficher une augmentation de l'oxydation par rapport aux témoins dans les cerveaux de souris subissant l'appauvrissement en glutathion in vivo. Trois de ces résidus ont été trouvés à résider dans les clusters fer-soufre du complexe I, ce qui laisse supposer que leur état d'oxydoréduction peut-être affecter la fonction de transport des électrons.

Le Lipide A Des Lipopolysaccharides De Vibrio Fischeri : Une Structure Unique Portant Une Portion Phosphoglycerol

The Journal of Biological Chemistry. Jun, 2011  |  Pubmed ID: 21498521

Vibrio fischeri, une bactérie marine bioluminescente, existe dans une relation symbiotique exclusive avec le calmar de bobtail hawaïen, Euprymna scolopes, dont elle colonise l'organe lumineux. Auparavant, il a été démontré que le lipopolysaccharide (LPS) ou libre lipidique A de V. fischeri peut déclencher des changements morphologiques dans l'orgue lumineux de la seiche juvénile qui se produisent lors de la colonisation. Afin d'étudier les caractéristiques structurelles qui pourraient être responsables de ce phénomène, le lipide A de V. fischeri ES114 LPS a été isolé et caractérisé par spectrométrie de masse à plusieurs étapes (MS(n)). Un mélange de microhétérogènes de mono - et diphosphorylated diglucosamine disaccharides a été observé avec la variables États d'acylation allant de tétra - octaacylated formes. Toutes les espèces de lipide A, toutefois, contenaient un ensemble de chaînes acyl primaire conservée consistant en une C14:0(3-OH) N-liés à la position 2 et deux acides gras C12:0(3-OH) O-liés dans les 3-3'-positions et un insolite C14:1(3-OH) N-liés à la position 2'. Les acides gras trouvés dans l'acylation secondaire étaient beaucoup plus variable, avec une C12: 0 ou C16: 1 en position 2, C14: 0 ou C14:0(3-OH) à la 2'-position et C12: 0 ou aucun substituant en position 3'. Plus surprenante était la présence d'une série inhabituelle de modifications sur le site de l'acylation secondaire de position 3 consistant en phosphoglycerol (GroP), l'acide lysophosphatidique (GroP roulement C12: 0, C16: 0 ou C16: 1) ou l'acide phosphatidique (GroP portant soit C16: 0 + C12: 0 ou C16: 0 + C16: 1). Compte tenu de leur caractère inhabituel, il est possible que ces caractéristiques de la lipide de fischeri V. A pourraient expliquer la capacité d'e. scolopes de reconnaître son partenaire symbiotique.

Identification Confiante De Nitrotyrosine-3 Modifications Dans Les Données De Spectrométrie De Masse Sur Plusieurs Plateformes à La Spectrométrie De Masse

Journal of Proteomics. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21514405

3-nitrotyrosine (3NT) est une modification post-traductionnelle oxydative associée à de nombreuses maladies. Déterminer les sites spécifiques de cette modification reste un défi en raison de la faible stoechiométrie de modifications 3NT dans des échantillons biologiques. Basé sur la spectrométrie de masse protéomique est un outil puissant pour identifier les adaptations 3NT, mais plusieurs rapports identifiant 3NT sites ont été démontrés par la suite incorrecte, en soulignant que la précision et l'efficacité de ces flux de travail doivent être améliorés. Pour faire progresser notre compréhension des propriétés chromatographiques et spectrales des peptides 3NT contenant, nous avons adapté une procédure simple et reproductible pour générer un grand nombre de peptides 3NT par nitration chimique d'un mélange de 48 protéines définie, disponible dans le commerce. Deux plates-formes complémentaires de la LC-MS/MS, un QTOF (QSTAR Elite) et un spectromètre de masse pression double piège ionique (LTQ Velos), nous avons détecté plus de 200 validé 3NT contenant des peptides avec chevauchement significatif dans les peptides détectée par les deux systèmes. Nous avons étudié les propriétés de LC-MS/MS pour chaque peptide manuellement à l'aide de critères définis et ensuite évalué leur utilité pour confirmer que le peptide 3NT modifiée. Ce vaste ensemble de validés 3NT contenant des peptides peut être utilisé pour optimiser l'instrumentation par spectrométrie de masse et stratégies d'extraction de données ou développer 3NT peptide enrichissement stratégies pour cette modification post-traductionnelle biologiquement importante, oxydative.

N-acylethanolamine Signalisation Intervient Dans L'effet De L'alimentation Sur La Durée De Vie Chez Caenorhabditis Elegans

Nature. May, 2011  |  Pubmed ID: 21562563

Restriction alimentaire est un moyen fiable de prolonger la durée de vie adulte et report de maladie liée à l'âge chez de nombreuses espèces, y compris les levures, les vers nématodes, les mouches et les rongeurs. Études des conditions génétiques pour la prorogation de la durée de vie d'une restriction alimentaire chez le nématode Caenorhabditis elegans ont mis en cause un certain nombre de molécules clés dans ce processus, y compris l'objectif de détection des éléments nutritifs de la voie de la rapamycine (TOR) et le facteur de transcription de Foxa PHA-4 (Réf. 7). Cependant, on connaît les signaux métaboliques que coordonnent les interventions organismique restriction alimentaire et de maintiennent l'homéostasie lorsque les nutriments sont limités. Le système endocannabinoïde est un excellent candidat pour un tel rôle, compte tenu de sa participation dans la régulation de l'équilibre énergétique et de l'apport en éléments nutritifs. Malgré cela, un rôle direct d'endocannabinoid signalisation dans la détermination de restriction ou de la durée de vie alimentaire doit encore être prouvée, en partie en raison de l'absence apparente d'endocannabinoid signalisation des voies dans les organismes modèles qui se prêtent à l'analyse de la durée de vie. N-acylethanolamines (NAEs) sont lipides dérivés signalisation des molécules, incluent l'éther d'arachidonoyl de mammifères endocannabinoïde. Ici, nous identifions NAEs chez c. elegans, montrent que l'abondance des NAE est réduit en vertu de la restriction alimentaire et que carence NAE est suffisant pour prolonger la durée de vie grâce à un mécanisme de restriction alimentaire nécessitant une PHA-4. À l'inverse, dietary supplementation with l'éther le nématode NAE eicosapentaenoyl de non seulement inhibe l'extension induite par la diététique-restriction de durée de vie dans les vers de type sauvage, mais supprime également l'extension de la durée de vie dans un mutant de voie de TOR. Cela démontre un rôle pour les NAE signalisation en vieillissement et indique que NAEs représentent un signal qui coordonne l'état nutritif avec des changements métaboliques qui déterminent en fin de compte la durée de vie.

Identification Par Spectrométrie De Masse Des Sites Acétylation Roman Lysine Dans La Huntingtine

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21685499

La huntingtine (Htt) est une protéine avec un tronçon polyglutamine dans l'extrémité N-terminale et expansion de l'étirement polyglutamine provoque la maladie de Huntington (MH). HTT est une protéine de domaine multiples dont la fonction n'a pas été bien caractérisée. Toutefois, des rapports antérieurs ont montré que des modifications post-traductionnelles de Htt tels que la phosphorylation et l'acétylation modulent la toxicité Htt mutante, de localisation et le trafic vésiculaire. Acétylation de la lysine de Htt est d'une importance particulière en HD comme cette modification réglemente la toxicité et la progression de la maladie. Traitement des modèles de souris avec les inhibiteurs d'histone déacétylase améliore le HD-comme des symptômes et altérations de l'acétylation de Htt favorise le dégagement de la protéine. Compte tenu de l'importance de l'acétylation en HD et d'autres maladies, nous nous sommes concentrés sur l'identification systématique des sites d'acétylation de lysine dans le Htt23Q (1-612) dans un modèle de culture cellulaire à l'aide de la spectrométrie de masse. Htt23Q myc-tag (1-612) surexprimés dans la lignée de cellules HEK 293 t a été immunoprécipitée, séparés par SDS-PAGE, digéré et soumis à l'analyse par SM en tandem par chromatographie liquide haute performance. Cinq sites d'acétylation de lysine ont été identifiés, y compris roman trois sites Lys-178, Lys-236, Lys-345 et deux sites décrits antérieurement Lys-9 et Lys-444. Anticorps spécifiques à trois des sites Htt acétylation ont été produites et confirment les sites d'acétylation dans Htt. Un multiple réaction suivi MS a été développé pour comparer quantitativement le niveau d'acétylation de Lys-178 entre Htt23Q sauvage et le mutant Htt148Q (1-612). Ce rapport représente la première cartographie complète des sites de l'acétylation de lysine dans la région N-terminale de la protéine Htt.

Extension Life Span Via L'inhibition De EIF4G Est Médiée Par Remodeling Posttranscriptionnelle De L'expression Génique Du Stress Réponse Chez C. Elegans

Cell Metabolism. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21723504

Réduire la synthèse des protéines ralentit la croissance et le développement, mais peut augmenter la durée de vie d'adulte. Nous démontrons que knockdown de la 4G traduction facteur eucaryote d'initiation (eIF4G), qui est régulée à la baisse au cours du jeûne et de l'état dauer, les résultats de la traduction différentielle des gènes importants pour la croissance et la longévité chez C. elegans. L'échelle du génome analyse de l'état d'ARNm de traduction a montré que l'inhibition de l'IFG-1, le C. elegans orthologue de eIF4G, se traduit par une augmentation relative de chargement du ribosome et la traduction des gènes de réponse au stress. Certains de ces gènes sont nécessaires pour l'extension durée de vie lorsque l'IFG-1 est inhibée. En outre, le renforcement de chargement ribosomal des ARNm de certaines sur IFG-1 inhibition a été corrélée avec la longueur de l'ARNm accrue. Cette association a été soutenue par des changements dans le protéome dosés par spectrométrie de masse quantitative. Nos résultats suggèrent que l'IFG-1 médie les effets antagonistes sur la croissance et l'entretien somatique par la régulation de la traduction des ARNm ARNm particulières en fonction, en partie, sur une longueur de transcription.

Le Contrôle Réglementaire Ou Dommages Oxydatifs ? Approches Protéomiques D'interroger Le Rôle De L'état D'oxydation De Cystéine Dans Les Processus Biologiques

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22159599

L'oxydation est une épée à double tranchant pour les processus cellulaires et son rôle dans la physiologie normale, cancer et le vieillissement des restes que partiellement compris. Bien que le stress oxydatif peut perturber la fonction biologique, les réactions d'oxydo-réduction (redox) dans une cellule sont souvent étroitement contrôlées et jouent un rôle physiologique essentiel. Cystéines se situent à l'interface entre ces deux extrêmes étant donné que les propriétés chimiques qui rendent les thiols spécifiques exquise redox-sensitive aussi prédisposent à des dommages oxydatifs par des espèces réactives de l'oxygène ou d'azote pendant l'effort. Ainsi, ces modifications peuvent être soit au titre d'un contrôle réglementaire rédox réversibles ou, subsidiairement, un résultat des dommages oxydatifs réversible ou irréversible. Dans les deux cas, il est devenu de plus en plus important d'évaluer l'état redox des thiols protéiques, puisque ces modifications d'impact souvent sur des processus tels que l'activité catalytique, modifications conformationnelles ou liaison métallique. Pour mieux comprendre les changements d'oxydo-réduction qui accompagnent les résidus de cystéine de protéine dans les systèmes biologiques complexes, nouvelles approches expérimentales ont été développés pour identifier et caractériser les modifications de thiol spécifiques et/ou des changements dans leur statut d'oxydo-réduction globale. Dans cette revue, nous décrivons les technologies récentes en protéomique d'oxydo-réduction qui ont repoussé les limites de détection et de quantification des modifications de cystéine redox dans un contexte cellulaire. Alors qu'il n'y a aucune solution analytique unique, nous mettons en évidence la raison d'être, points forts et limites de chaque technologie afin de les appliquer efficacement à des questions biologiques spécifiques. Plusieurs limitations technologiques restent encore non résolues, mais ces approches et les évolutions futures jouent un rôle important dans la compréhension de l'interaction entre le stress oxydatif et redox signaling in health and disease.

Un Flux De Travail D'affinité Sur Lectine De Ciblage Glycosite-spécifiques, Des Structures Glucidiques Liés Au Cancer Dans La Trypsine-digéré Du Plasma Humain

Analytical Biochemistry. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20705048

Glycanes sont un type de cellule-spécifiques, des modifications post-traductionnelles des protéines qui sont modulés au cours des processus de développement et de la maladie. En tant que tel, les glycoprotéines sont des candidats biomarqueurs intéressants. Ici, nous décrivons une spectrométrie de masse à base de workflow qui intègre chromatographie d'affinité lectine à enrichir pour des protéines qui transportent spécifiques structures glycanniques. Comme l'augmentation des sialylation et fucosylation occupent une place importante parmi les associés au cancer modifications, nous nous sommes concentrés sur Sambucus nigra agglutinine (SCN) et Aleuria aurantia lectine (AAL), les lectines qui lient l'acide sialique et le fucose-structures contenant, respectivement. Glycopeptides fucosylées et sialylées de la lactoferrine humaine ont servi de témoins positifs, et de haute-mannose structures de invertase de levure ont servi de témoins négatifs. Les normes ont été chargés dans le Système d'affinité Enlèvement multiples (MARS) de 14 appauvri, la trypsine-digéré plasma humain provenant de donneurs sains. Les échantillons ont été chargés sur des colonnes de lectine, séparés par HPLC en flux continu et fractions liées, et traitées avec le peptide: N-glycosidase F pour éliminer N-glycanes. Les fractions peptidiques déglycosylées ont été interrogés par CLHP-SM/SM ESI. Nous avons identifié un total de 122 glycoprotéines plasmatiques humaines contenant 247 glycosites uniques. Il est important, plusieurs des glycoprotéines observées (par exemple, la cadhérine 5 et des neutrophiles associée à la gélatinase lipocaline) généralement circuler dans le plasma à faible nanogramme par millilitre niveaux. Ensemble, ces résultats fournissent la spectrométrie de masse à base de la preuve de l'utilité d'incorporer la lectine de séparation plates-formes dans les pipelines de biomarqueurs du cancer de découverte.

L'hydrate De Carbone De L'antigène O Et Core De Vibrio Fischeri Lipopolysaccharide: Composition Et Analyse De Leur Rôle Dans La Colonisation Euprymna Scolopes Orgue De Lumière

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2012  |  Pubmed ID: 22247546

Vibrio fischeri existe dans une relation symbiotique avec l'hawaïenne calmars bobtail, Euprymna scolopes, où le calmar offre un foyer pour les bactéries et les bactéries, à leur tour fournissent de camouflage qui permet de protéger le calmar contre les prédateurs nocturnes. Comme d'autres organismes Gram-négatifs, V. fischeri exprime lipopolysaccharide (LPS) sur sa surface cellulaire. La structure de l'antigène O et les composants de base des LPS et leur rôle possible dans la colonisation du calmar n'ont pas encore été déterminée. Dans ces études, un joint-antigène ligase mutante, Waal, a été utilisée pour déterminer les structures de ces composants LPS et leurs rôles dans la colonisation du calmar. Waal ligature de l'antigène O-au cœur des LPS: ainsi, le LPS de mutants Waal manquent O-antigène. Nos résultats montrent que le V. fischeri waal mutant présente un défaut de motilité, est considérablement retardé la colonisation, et il est incapable de rivaliser avec la souche de type sauvage en co-colonisation des dosages. Des analyses comparatives des LPS des souches de type sauvage et du Waal a montré que le LPS de V. fischeri a un seul antigène O répétition composé de yersiniose, la 8-épi-legionaminic et l'acide N-acetylfucosamine. En outre, le LPS de la souche waal a montré que la structure de base se compose de L-glycéro-D-manno-heptose, D-glycéro-D-manno-heptose, le glucose, le 3-désoxy-D-manno-octulosonique (Kdo ), la N-acétylgalactosamine, de l'acide 8-épi-legionaminic, phosphate et phosphoéthanolamine. Ces études indiquent que les insolites V. fischeri O-antigène sucres jouent un rôle dans les premières phases de la colonisation bactérienne du calmar.

Analyse Protéomique Des Modifications De La Fonction De L'âge De Solubilité De La Protéine Identifie Les Gènes Qui Modulent La Durée De Vie

Aging Cell. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22103665

Alors qu'il est généralement reconnu que mauvais repliement des protéines spécifiques peut causer des maladies d'apparition tardive, la contribution de l'agrégation des protéines au processus normal de vieillissement est moins bien connue. Pour résoudre ce problème, une analyse protéomique basé sur la spectrométrie de masse a été réalisée pour identifier les protéines qui adoptent le dodécylsulfate de sodium (SDS)-conformations insolubles au cours du vieillissement chez Caenorhabditis elegans. SDS-insoluble protéines extraites des jeunes et âgés, c. elegans ont été chimiquement étiquetés par marquage isobarique pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) et identifiés par chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse. Deux cent trois protéines ont été identifiées comme étant considérablement enrichi dans une fraction insoluble dans le SDS à nématodes âgés et ont été largement absents d'une fraction de protéines similaires dans les jeunes nématodes. La fraction insoluble dans le SDS chez les animaux âgés contient un large éventail de protéines, dont un grand nombre de protéines ribosomiques. Gène ontologie analyse a révélé des enrichissements hautement significatifs pour les fonctions de production et de la traduction de l'énergie. Expression des gènes codant des protéines insolubles observées chez les nématodes âgés a été renversée à l'aide d'ARNi, et on a mesuré les effets sur la durée de vie. 41 % des gènes testés ont été montré pour prolonger la durée de vie après traitement d'ARNi, comparé à 18 % dans un groupe témoin de gènes. Ces données indiquent que les gènes codant des protéines qui deviennent insolubles avec l'âge sont enrichis pour les modificateurs de durée de vie. Cela montre que les approches protéomiques peuvent servir à identifier les gènes qui modifient la durée de vie. Enfin, ces observations indiquent que l'accumulation de protéines insolubles avec diverses fonctions peut-être être une caractéristique générale du vieillissement.

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