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Articles by Bradford W. Gibson in JoVE

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Una lectina Método HPLC para enriquecer péptidos selectivamente glicosilada de muestras biológicas complejas


JoVE 1398 10/01/2009

1, 2, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 2, 1, 1

1Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, University of California, San Francisco - UCSF, 2Buck Institute for Age Research, 3Department of Chemistry, Purdue University

Lectina conjugada con perlas de Poros fueron empleados para HPLC. Normas glicopéptido sirvieron como controles positivos y negativos. MARS-14 empobrecido, tripsina digerido plasma humano y se sometió a cromatografía de flujo continuo (FT) y las fracciones recogidas obligado para el análisis de ESI-LC-MS/MS. Glicopéptidos fueron enriquecidos en la fracción unida en comparación con el FT.

Other articles by Bradford W. Gibson on PubMed

Supervivencia Intracelular De Neisseria Gonorrhoeae En Células Epiteliales Uretrales Masculinas: Importancia De Un Lípido De Hexaacyl A

Infection and Immunity. Feb, 2002  |  Pubmed ID: 11796626

Neisseria gonorrhoeae es un patógeno humano estricto que invade y coloniza el tracto urogenital de machos y hembras. Lipooligosaccharide (LOS) se ha demostrado para desempeñar un papel en la patogénesis gonocócica. El acil transferasa MsbB participa en la biosíntesis de los lípidos una porción de LOS. Con el fin de determinar el papel de un lípido intacto una estructura en la patogenesia de N. gonorrhoeae, el gen de la msbB fue clonada y secuenciada, una mutación de eliminación e inserción fue introducida en N. gonorrhoeae, y la cepa mutante fue designada 1291A11K3. Análisis de espectrometría de masa de LOS 1291A11K3 determinan que esta mutación dio lugar a un pentaacyl en lugar de una estructura de lípidos A hexaacyl. Estos análisis también demostraron un aumento en la fosforilación de lípido A y un aumento en la longitud de los oligosacáridos de una especie menor de la msbB LOS. Se examinaron las interacciones de este mutante con células epiteliales uretrales masculinas (uec). Transmisión y microscopía electrónica de barrido estudios indicaron que los mutantes msbB forman asociaciones estrechas con y fueron internalizados por la uec en niveles similares a los de la cepa parental. Análisis de supervivencia de gentamicina con 1291A11K3 y 1291 bacterias demostraron que no hubo diferencias en las capacidades de las dos cepas de adherirse a la uec; sin embargo, significativamente menos bacterias 1291A11K3 que las bacterias de cepa de padres fueron recuperadas de uec tratados con gentamicina. Estos estudios sugieren que la modificación de lípidos de la A en el mutante msbB de N. gonorrhoeae puede hacerla más susceptibles a innata mecanismos intracelulares de la matanza cuando interiorizado por uec.

Cepa De Haemophilus Influenzae Tipo B A2 Tiene Múltiples Sialiltransferasas En Lipooligosaccharide Asimismo

The Journal of Biological Chemistry. Apr, 2002  |  Pubmed ID: 11842084

El lipooligosaccharide (LOS) de Haemophilus influenzae contiene sialylated glicoformas, y un sialyltransferase, Lic3A, se ha identificado previamente. Divulgamos evidencia para dos sialiltransferasas adicionales, SiaA y LsgB, que afectan glicoformas que contienen N-acetyllactosamine. Mutaciones en genes hemos designado siaA y lsgB afectado solamente el glicoformas sialylated que contiene N-acetylhexosamine. Una mutación en el siaA resultó en la pérdida de glicoformas en sialil-N-acetylhexosamine y la aparición de mayor peso molecular glicoformas, que contiene la adición de ácido N-acetilneuramínico, phosphoethanolamine y N-acetilgalactosamina. Complementación cromosómico del mutante siaA dio lugar a la expresión del fenotipo LOS sialylated original. Una mutación en lic3A dio lugar a la pérdida de asimismo solamente en glicoformas carecer de N-acetylhexosamine y no afectó asimismo del terminal del epítopo de N-acetyllactosamine. Un doble mutante en el siaA y lic3A dio lugar a la pérdida completa de asimismo del terminal del epítopo de N-acetyllactosamine y expresión de la mayor peso molecular sialylated glicoformas visto en el mutante siaA. Mutación de lsgB dio lugar a la persistencia de sialylated glicoformas pero una reducción en glicoformas que contienen N-acetyllactosamine. Un triple mutante de siaA, lic3A y lsgB había contenido no glicoformas sialylated. Estos resultados demuestran que el asimismo de las LOS de H. influenzae es un proceso complejo que involucra múltiples sialiltransferasas.

El Racimo Del Gene LbgAB De Haemophilus Ducreyi Codifica Una Beta-1, 4-galactosyltransferase Y Un Alfa-1, 6-DD-heptosyltransferase Implicados En La Biosíntesis De Lipooligosaccharide

Infection and Immunity. Jun, 2002  |  Pubmed ID: 12010972

Todos cepas de Haemophilus ducreyi examinadas contienen un lipooligosaccharide (LOS) que consta de un solo pero oligosacárido rama variable que emana de la primera Heptosa (Hep-I) de un conservado Hep (3)-fosforila 3-deoxy-D-manno-octulosonic ácido-lípidos un núcleo. En un informe anterior, la identificación de genes de tándem, lbgA y lbgB, que están implicadas en la biosíntesis de LOS fue descrito (Stevens et al., Infect. Immun. 65:651-660, 1997). En un estudio separado, fue identificado el mismo racimo del gene y el gen lbgB (losB) fue encontrado para ser requerido para la transferencia del segundo azúcar, D-glycero-D-manno-Heptosa (DD-Hep), de la estructura de la rama principal (Gibson et al., J. Bacteriol. 179:5062-5071, 1997). En este estudio, se identificaron la función del gen vecino río arriba, lbgA y encontró que es necesario agregar el azúcar tercero en la rama de oligosacárido dominante, un beta1 galactosa-ligado--> 4, la DD-Hep. LOS de un mutante de lbgA y un lbgAB doble mutante se aislaron y caracterizaron por electroforesis del gel de poliacrilamida-sulfato de sodio dodecil, análisis de hidratos de carbono, espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Los resultados mostraron que las cepas mutantes sintetizan truncado glicoformas LOS que terminan después de la adición de la primera glucosa (lbgAB) o el disacárido DD-Hepalpha1--> 6Glcbeta1 (lbgA) que se une al núcleo Heptosa. Ambos mutantes muestran una reducción significativa en la capacidad de adherirse a los queratinocitos humanos. Aunque se observaron diferencias menores después de electroforesis bidimensional de proteínas totales de las cepas de tipo salvaje y mutantes, los niveles de expresión de la mayoría de las proteínas eran sin cambios, lo que sugiere que las diferencias en la adhesión e invasión son debido a las diferencias en LOS. Estos estudios se añade a la creciente evidencia de un papel de las estructuras de LOS completos en la fisiopatología de la infección por H. ducreyi.

Caracterización De Lipooligosaccharides De Haemophilus Ducreyi Que Contiene Polylactosamine Repite

Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Jun, 2002  |  Pubmed ID: 12056572

Haemophilus ducreyi, un patógeno humano gram-negativa de la mucoso, es una de las principales causas de enfermedad de la úlcera genital. Los lipooligosaccharides (LOS) de estas bacterias se consideran ser un factor de virulencia importantes y han sido implicados en la adhesión y la invasión de H. ducreyi a varios tipos de células humanas. Una cepa de nocaut isogénicas heptosyltransferase-III (waaQ) fue recientemente construido de cepa de tipo salvaje de H. ducreyi 35000 e inmunoquímica y datos de peso molecular de LOS aislados sugirieron la presencia de poli-N-acetyllactosamine (LacNAc) (Filiatrault et al., Infect. Immun. 2000, 68, 3352-3361). En este estudio presente, las estructuras de estos LOS-glicoformas novela se caracterizaron por desorción/ionización de láser asistida por matriz (MALDI) y espectrometría de masas por electrospray ionización (ESI) en combinación con la digestión exoglycosidase. Toda la información estructural se obtuvo para las porciones de oligosacárido (OS) de estos LOS mostrando entre uno a cinco lineal que lacnac se repite en la terminal no reductores de la rama principal del oligosacárido. Cuando se cultiva en medios sólidos, el organismo produce repeticiones de LacNAc que más se han modificado mediante la adición de ácido siálico. Digestión enzimática con beta-galactosidasa, beta-N-acetylhexosaminidase y neuraminidasa tipo VI-A rendido truncado glicoformas consistente con una estructura de polyLacNAc tope en varios puntos de la final con el ácido siálico. Espectrometría de masas ESI-MS/MS en un instrumento de cuadrupolo-tiempo de vuelo fue particularmente eficaz en la obtención de información estructural detallada sobre el menos abundante, de alta masa glicoformas. Aunque se hayan divulgado LOS que contienen di-LacNAc terminal, esto es la primera vez a nuestro conocimiento que se ha caracterizado una estructura lineal polyLacNAc en bacterias.

Identificación Y Caracterización Del Gen N-acetilglucosamina Glicosiltransferasa De Haemophilus Ducreyi

Infection and Immunity. Oct, 2002  |  Pubmed ID: 12228324

Haemophilus ducreyi es el agente causante del chancroide, una enfermedad ulcerosa de transmisión sexual. En el presente estudio, el Neisseria gonorrhoeae lgtA lipooligosaccharide glicosiltransferasa gene fue utilizado para identificar un homólogo en el genoma de H. ducreyi. Supuesta H. ducreyi glicosiltransferasa gen (señalado lgtA) fue reproducido y insertionally inactiva, y se construyó un mutante isogénicas. Estudios estructurales demostraron que el lipooligosaccharide aislado de la cepa mutante carecía de N-acetilglucosamina y azúcares distales encontradas la lipooligosaccharide producida por la cepa parental. El mutante isogénicas se transformó con un plásmido recombinante que contiene el gen glicosiltransferasa putativos. Esta variedad produce la glicoformas lipooligosaccharide producida por la cepa parental, confirmando que el gen lgtA codifica la glicosiltransferasa N-acetilglucosamina.

Una Estrategia Alternativa Para Determinar El Proteoma Mitocondrial Usando Fraccionamiento Gradiente De Sacarosa Y 1D Página En Mitocondrias De Corazón Humano Altamente Purificado

Journal of Proteome Research. Sep-Oct, 2002  |  Pubmed ID: 12645917

Una estrategia alternativa para proteómica mitocondrial se describe que es complementaria a anteriores investigaciones técnicas 2D de la página. La estrategia consiste en (a) obtener preparaciones altamente purificadas de mitocondrias de corazón humano utilizando gradientes de metrizamide para eliminar las proteínas citosólicas y otros contaminantes subcelular; (b) separación de complejos de la proteína mitocondrial usando gradientes de densidad de sacarosa después de solubilización con n-dodecyl-beta-D-maltoside; (c) electroforesis 1 D de las fracciones de gradiente de sacarosa; (d) proteómica alto rendimiento utilizando robótica del gel la supresión de la banda, digestión en gel, MALDI blanco manchado y adquisición espectral automatizado; y la identificación de proteínas (e) de las mezclas de péptidos trípticos por péptidos de alta precisión masa huellas digitales. Usando esta aproximación, rápidamente se identificaron 82 proteínas mitocondriales bona fide o potenciales, 40 de los cuales no se han divulgado previamente utilizando técnicas de página 2D. Estas proteínas son pequeño complejo I y complejos subunidades IV, así como muy básicos e hidrofóbicas glicoproteínas como la adenina nucleótido translocasa que no se recuperan en geles 2D. La técnica descrita aquí también debe ser útil para la identificación de nuevas asociaciones de proteínas como se ejemplifica en la validación de un complejo recientemente descubierto que consiste en proteínas perteneciente a la familia prohibitin.

Caracterización De La Secuencia Primaria De Catestatin Intermedios Y Péptidos Define Sitios De Clivaje Proteolítico Utilizados Para Convertir Chromogranin Un En Catestatin Activa Secretada De Células Cromafines Neuroendocrinas

Biochemistry. Jun, 2003  |  Pubmed ID: 12795588

Catestatin es un péptido activo de 21-residuo había derivado de la cromogranina un precursor (CgA), y catestatin es secretada de células cromafines neuroendocrinas como regulador de la liberación de catecolaminas de nicotina-estimulado autocrina. El objetivo de este estudio fue caracterizar las secuencias principales de catestatin de masa molecular alta intermedios y péptidos para definir los sitios de clivaje proteolítico en CgA que son utilizados en la biosíntesis de catestatin. Polipéptidos que contienen Catestatin, demostrado por las manchas blancas /negras occidentales de anti-catestatin, de 54-56, 17, 32 y 50 kDa contiene secuencias de NH 2-terminal péptido que indican divisiones proteolíticas del precursor del CgA en flecha KK, flecha KR, flecha R y sitios Web de residuo básica de flecha KR, respectivamente. Se definieron los términos COOH de estos intermedios de catestatin por la presencia de los péptidos trípticos COOH-terminal del precursor del CgA, correspondiente a los residuos 421-430, que fue identificada por espectrometría de masas MALDI-TOF. Resultados también demostraron la presencia de 54-56 y 50 kDa catestatin productos intermedios que contienen la NH(2) terminal de CgA. Secreción de productos intermedios del catestatin de células cromafines estuvo acompañada por el cosecretion de catestatin (CgA(344)(-)(364)) y formas de la variante del péptido (CgA(343)(-)(368) y CgA(332)(-)(361)). Estos determinados sitios escote predijeron que la producción de productos intermedios del catestatin de masa molecular alta requiere escote a los lados del COOH-terminal de residuos básicos emparejados, es compatible con las especificidades del escote de convertasas del prohormona CP1 y CP2. Sin embargo, es notable que la producción de catestatin sí mismo (CgA(344)(-)(364)) utiliza sitios más inusuales del escote a los lados de la terminal 2 de NH de flecha R y sitios de residuos básicos flecha RR, consistentes con las especificidades de la hendidura de la proteasa de cisteína de gránulos cromafines "PTP" que participa en el proceso de proenkephalin. Estos resultados demuestran que la producción de catestatin implica ruptura de CgA en residuos básicos y monobásicos emparejados, las medidas necesarias para la regulación de péptido catestatin de liberación de catecolaminas inducida por colinérgicos nicotínicos.

MS2Assign, Automatizar La Asignación Y Nomenclatura De La Espectrometría De Masas De Tándem De Químicamente Reticulado Péptidos

Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 12892908

En un informe anterior (Young et al., Proc. nacional Acad. Sci U.S.A. 2000, 97, 5802-5806.), proporcionamos un prueba-de-principio para reconocimiento de doblez de proteínas mediante un reactivo de reticulación química específica de Amina homobifunctional en combinación con análisis de espectrometría de masas y modelado de la homología. En este trabajo actual, se propone una nomenclatura para describir los tipos de péptidos que se generan después de la proteólisis de las proteínas de reticulado, su fragmentación por espectrometría de masas en tándem y un algoritmo automatizado para asignación espectral MS/MS, llamado "MS2Assign." Se proporcionan varios ejemplos de péptidos de reticulado y proteínas incluyendo VIH-integrasa, citocromo c, ribonucleasa A, mioglobina, N-acetilneuramínico ácido sintetasa de citidina 5-monofosfato y el péptido timopentina. Espectros de masas tándem se obtuvieron varios péptidos de reticulado con post fuente decaimiento MALDI-TOF y disociación de colisión inducida en un instrumento de cuadrupolo-TOF, junto con su interpretación automatizada usando MS2Assign. Una variedad de posibles resultados se describen y clasifican en función del número de lisinas modificadas y/o cadenas de péptidos implicadas, así como la presencia de residuos de lisina (callejón sin salida) modificado por separado. Además, se presentan la proteólisis y condiciones cromatográficas necesarias para la recuperación de péptido reticulado optimizado.

Proteólisis De Phosphospecific Para El Mapeo De Sitios De Fosforilación De La Proteína

Nature Biotechnology. Sep, 2003  |  Pubmed ID: 12923550

Fosforilación de la proteína es un mecanismo dominante de la transferencia de información en las células, y una meta importante de los esfuerzos actuales de la proteómica es generar un mapa de nivel de sistema que describe todos los sitios de fosforilación de la proteína. Esfuerzos recientes se han centrado en el desarrollo de tecnologías para enriquecer y cuantificación de fosfotoproteida. Identificación de los sitios de fosforilación por lo general se basa en espectrometría total en tándem a péptidos individuales de la secuencia. Aquí describimos un método para asignación de fosfopéptidos que permite interrogar una secuencia directamente con una proteasa que reconoce sitios de fosforilación de la proteína. La clave de este enfoque es la transformación química selectiva de residuos de Fosfoserina y fosfotreonina en análogos de la lisina (aminoethylcysteine y beta-methylaminoethylcysteine, respectivamente). Modificado Aminoethylcysteine péptidos son luego troceados con una proteasa específica de lisina para mapear sitios de fosforilación. Un paso bloqueo permite solo sitio escote, y facilita la adaptación de esta reacción a la fase sólida fosfopéptidos enriquecimiento y modificación en un solo paso.

El Mutante MsbB De Neisseria Meningitidis Cepa NMB Tiene Un Defecto En La Asamblea De La Lipooligosaccharide Y El Transporte a La Membrana Externa

Infection and Immunity. Feb, 2003  |  Pubmed ID: 12540541

Una mutación de la canceladura-inserción en msbB, un gen que codifica una Aciltransferasa lípido A, fue introducida en encapsulado Neisseria meningitidis serogrupo B NMB y un mutante de acapsular de la misma cepa. Estos mutantes fueron señalados NMBA11K3 y NMBA11K3cap, respectivamente. Lipooligosaccharide (LOS) ni el lípido A podría ser aislado de NMBA11K3 aunque se trató de una serie de técnicas, pero ambos fueron fácilmente extraídos de NMBA11K3cap-. La microscopia de immunoelectron usando 6B4 del anticuerpo monoclonal (MAb), que reconoce el terminal Galbeta1-4GlcNAc de LOS, demostró que NMB, NMBcap y NMBA11K3cap - expresaran LOS circunferencial, mientras MAb 6B4 no ató a la superficie del NMBA11K3. Sin embargo, la tinción citoplásmica de NMBA11K3 con MAb 6B4 fue una constante observación. Análisis de espectrometría de masa demostraron que las cantidades relativas de los lípidos específicos A C12: 0 3-OH y C14: 0 3-OH presentes en las preparaciones de membrana (MP) de NMBA11K3 disminuyeron sustancialmente (25 - y 23-fold, respectivamente) en comparación con la cantidad de MP de la cepa parental, NMB. Análisis de Western blot de MP de NMBA11K3 demostraron que los niveles de porin en la membrana externa de NMBA11K3 fueron también considerablemente disminuidos. Estos estudios sugieren que el defecto de la Acilación de lípido A en encapsulado NMBA11K3 influye en la Asamblea del lípido A y, en consecuencia, la incorporación de porin en la membrana externa.

Caracterización Del Proteoma Mitocondrial Corazón Humano

Nature Biotechnology. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12592411

Para obtener una mejor comprensión del papel fundamental de mitocondrias en función de la célula, hemos recopilado un amplio catálogo del proteoma mitocondrial usando altamente purificadas de las mitocondrias del tejido del corazón humano normal. Centrifugación de gradiente de sacarosa fue empleada para resolver parcialmente complejos de la proteína cuyos componentes individuales de la proteína se separaron por página unidimensional. Total en gel procesamiento y posterior detección por espectrometría de masas y análisis bioinformático riguroso rindieron un total de identificaciones 615 proteína distinta. Estuvieron representados todos los valores de proteína pI, rangos de peso molecular y hydrophobicities. La cobertura de las subunidades conocidas de la maquinaria de la fosforilación oxidativa en la membrana mitocondrial interna era > 90%. Una proporción significativa de las proteínas identificadas están implicados en la señalización, transporte iónico de ARN, ADN y la síntesis de proteínas y metabolismo de los lípidos. Las funciones bioquímicas del 19% de las proteínas identificadas no han sido definidas. Esta base de datos de proteínas proporciona un recurso integral para el descubrimiento de nuevas funciones mitocondriales y vías.

Metabólico Incorporación De Antinaturales ácidos Siálicos Haemophilus Ducreyi Lipooligosaccharides

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12615992

Los lipooligosaccharides (LOS) de Haemophilus ducreyi son altamente sialylated, una modificación que se ha implicado en la resistencia a la defensa del huésped y en la virulencia. En trabajos anteriores, hemos demostrado que H. ducreyi limpia el ácido siálico desde el medio extracelular e incorpora los residuos en LOS. Aquí divulgamos que H. ducreyi puede utilizar antinaturales los ácidos siálicos teniendo grupos de N-acil alargados de tres a siete átomos de carbono en longitud, dando por resultado la presentación de la membrana externa de sialil-LOS antinatural. La variante artificial compone de aproximadamente 90% de células superficiales sialosides cuando sustratos exógenos se agregan a los medios de comunicación en concentraciones micromolar, a pesar de la disponibilidad de ácido siálico natural en los medios de crecimiento. Aunque representan la mayoría de sialosides de superficie celular, análogos con más grupos de N-acil disminuyen el nivel general de LOS Asimismo, culminando en la inhibición completa de LOS asimismo por el ácido siálico de N-octanoyl. Así, asimismo de H. ducreyi LOS puede ser modulada con respecto a la estructura de los residuos terminales de ácido siálico y la medida a la que se modifica el aceptador de LOS proveyendo las bacterias con varios análogos del ácido siálico.

Identificación De Un Operón Biosintético ácido 3-deoxy-D-manno-octulosonic En El Análisis De Un Mutante Isogénicas KdsA Deficientes Y Moraxella Catarrhalis

Infection and Immunity. Nov, 2003  |  Pubmed ID: 14573664

Lipooligosaccharide (LOS), un componente predominante de la superficie expuesta de la membrana externa, se ha implicado como un factor de virulencia en la patogenesia de Moraxella catarrhalis infecciones. Sin embargo, los pasos críticos implicados en la biosíntesis y Asamblea de M. catarrhalis permanecen LOS undefined. En este estudio, utilizamos mutagénesis al azar transposon para identificar un operón biosintético de ácido 3-deoxy-D-manno-octulosonic (KDO) en M. catarrhalis con la orden del gen pyrG-kdsA-eno. La molécula de lípido A-KDO sirve como aceptor en el que una variedad de glicosil transferasas secuencialmente añadir las extensiones de oligosacárido núcleo y rama para la molécula de LOS. KdsA, el KDO-8-fosfato sintasa, cataliza el primer paso de la biosíntesis KDO y es una enzima esencial en bacterias entéricas Gram negativas para el mantenimiento de la viabilidad bacteriana. Divulgamos la construcción de un mutante de kdsA de catarrhalis isogénicas M. en cepa 7169 por intercambio alélica. Nuestros datos indican que una molécula de LOS únicamente de lípido A y carecer de KDO glicosilación es suficiente para mantener la supervivencia de M. catarrhalis in vitro. Además, análisis comparativos de crecimiento y susceptibilidad se realizaron para evaluar la sensibilidad de 7169kdsA11 comparada con la de la cepa parental. Los resultados de estos estudios demuestran que la molécula de LOS nativa es un factor importante para mantener la integridad de la membrana externa y sugieren que LOS es un componente crítico en la capacidad de M. catarrhalis para resistir la actividad bactericida del suero humano.

Proteoma De Haemophilus Ducreyi Por 2D SDS-PAGE Y Espectrometría De Masas: Cepa Expresión Variación, Virulencia Y Carbohidratos

Journal of Proteome Research. Sep-Oct, 2003  |  Pubmed ID: 14582649

Hemos analizado el proteoma de varias cepas de Haemophilus ducreyi por electroforesis bidimensional (2-DE) y espectrometría de masas. 122 Distintas proteínas se identificaron y analizaron más de 100 puntos de las fracciones de proteína soluble e insoluble de la 35000HP de tensión del prototipo. Funciones de aproximadamente el 80% de las 122 proteínas se dedujeron por identificación con homólogos cercanas de Haemophilus influenzae. Cuatro tipo de salvaje adicional y tres cepas mutantes también analizaron que varían en sus estructuras de lipooligosaccharide de virulencia y/o membrana externa. En general, los mapas 2-DE gel del tipo salvaje y estirpes mutantes eran similares a la cepa 35000HP, sugiriendo la poca diversidad de proteoma en relación con la expresión de hidratos de carbono y/o virulencia. Una excepción fue la cepa Kenia 33921 que contenían diferencias significativas en su mapa de 2-DE proteoma y también sintetiza una inusual LOS con una estructura de bifurcación trisacárido. Esta cepa africana puede representar un prototipo de un segundo grupo clónico de H. ducreyi.

La Proteína De Unión De Plaquetas Streptococcus Gordonii GspB Pasa Por Glicosilación Independientemente De Exportación

Journal of Bacteriology. Feb, 2004  |  Pubmed ID: 14729688

La Unión de las bacterias y las plaquetas puede desempeñar un papel central en la patogenia de la endocarditis infecciosa. Unión de plaquetas por cepa de Streptococcus gordonii M99 predominante está mediada por la proteína de anclaje de pared celular de 286-kDa GspB. Esta proteína inusualmente grande carece de un péptido señal típica de amino-terminal y se transloca del citoplasma mediante un sistema de transporte dedicado. Un segmento de 14 kb justo abajo de gspB codifica SecA2 y SecY2, sistema de transporte de dos componentes de la GspB-específica. El segmento descendente también codifica varias transferasas de supuesta glicosil que pueden ser responsables de la modificación postraduccional de GspB. En este estudio, comparamos las capacidades M99 y dos estirpes mutantes de GspB(-) para enlazar diferentes lectinas. GspB fue encontrado para tener afinidad con lectinas que unen N-acetilglucosamina. También se analizaron formas de GspB que carecen de un dominio carboxi-terminal de anclaje pared celular y por lo tanto son libres de enlace covalente de peptidoglicano de la pared celular. Como GSPB nativo, estas proteínas truncadas parecen ser muy glucosilada, según lo evidenciado por la migración durante la electroforesis del gel de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida con una masa molecular aparente > 100 kDa por encima de la masa predicha, insignificante tinción con manchas de proteína convencional y reactividad con siguiente hidrazida periodato de oxidación. Además, el análisis del carbohidrato asociado con las variantes de GspB por cromatografía de intercambio aniónico alto pH reveló la presencia de aproximadamente 70 a 100 monosacárido residuos por GspB polipéptido (principalmente glucosa y N-acetilglucosamina). Análisis de GspB en protoplastos de estirpes mutantes secA2 o secY2, que no exportan GspB, indica que el GspB es glicosilada en el citoplasma de estas cepas. Los datos combinados sugieren que el nativo de GspB es una glicoproteína y que puede ser glucosilada antes a exportación.

Proteómica Y Caracterización Inmunoquímica De Un Papel Estatmina En La Neurogénesis Adulta

FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. Feb, 2004  |  Pubmed ID: 14769823

Estatmina es una proteína citosólica desarrollo regulada expresada en altos niveles en el cerebro. Electroforesis en gel de diferencial bidimensional y espectrometría de masas de las proteínas expresadas diferencialmente en cultivos inmaduros y maduros de rata embrionario corteza cerebral identificada estatmina entre varios expresan proteínas, consistentes con un posible papel en la neurogénesis. Inmunohistoquímica de estatmina en el cerebro adulto de roedor reveló la expresión prominente en zonas neuroproliferative y las vías de la migración neuronal, un patrón que se asemeja a la expresión de doublecortin, que está implicada en la migración neuronal. Estatmina inmunoreactividad también se asoció con las neuronas en migración ectópica de la cadena en el striatum isquémica y corteza cerebral tras la isquemia cerebral focal. Reducción de la expresión de estatmina o doublecortin con un oligonucleótido antisentido inhibe la migración de neuronas nuevas de la zona subventricular en el bulbo olfatorio a través de la corriente migratoria rostral. Estos resultados sugieren un papel estatmina en la migración de neuronas recién en el cerebro adulto.

Explotando La Proteómica En El Descubrimiento De Fármacos Daño Oxidativo Mitocondrial De Destino

Science of Aging Knowledge Environment : SAGE KE. Mar, 2004  |  Pubmed ID: 15028863

Para entender cómo el estrés oxidativo contribuye a enfermedades del envejecimiento y vejez y evaluar mejor el efecto terapéutico de fármacos antioxidantes, sería deseable tener una lectura completa y detallada de los tipos de daño oxidativo que se producen a las proteínas a nivel global o proteoma. En esta perspectiva, examino cómo proteómica, definida aquí como la ciencia de examinar todas las proteínas en un organelo, célula o tejido en el contexto de fenómenos biológicos, puede utilizarse para proporcionar detalles moleculares del daño oxidativo de la proteína mitocondrial. Específicamente, discutir enfoques que combinan conocimiento del proteoma mitocondrial con nuevas técnicas basadas en espectrometría de masa que son capaces de identificar sitios de modificación oxidativa y proteínas en forma de alto rendimiento.

Cobertura Ampliada Del Proteoma Mitocondrial Del Corazón Humano Con La Cromatografía Líquida Multidimensional Juntada Con Espectrometría De Masas En Tándem

Journal of Proteome Research. May-Jun, 2004  |  Pubmed ID: 15253431

La evidencia reciente sugiere que las mitocondrias están estrechamente relacionadas con el proceso de envejecimiento y trastornos degenerativos como la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson. Así, se ha aumentado interés en la catalogación de proteomas mitocondrial para identificar potenciales dianas diagnósticas y terapéuticas. Hemos divulgado previamente los resultados de una cromatografía unidimensional electroforesis/líquido MS/MS estudio para caracterizar el proteoma de mitocondrias de corazón humano normal (Taylor et al., NAT Biotechnol. 2003, 21, 281-286). Ahora Divulgamos dos estudios posteriores donde multidimensional de la cromatografía líquida MS/MS fue investigada como una alternativa para la caracterización de la misma muestra.

Láser Asistida Por Matriz Desorción/ionización-tiempo De Vuelo-espectrometría De Masas De Especies Lipopolisacárido Separados Por Electroforesis Del Gel De Poliacrilamida-losa: Separación De Alta Resolución Y Determinación Del Peso Molecular De Lipooligosaccharides De Vibrio Fischeri Filtrar HMK

Electrophoresis. Jul, 2004  |  Pubmed ID: 15273999

Recientemente hemos demostrado que el uso combinado de lipopolisacárido (LPS) revertir la coloración y técnicas de elución pasiva de alta eficiencia pueden ser utilizadas con éxito como una conveniente interfaz entre LPS losa-gel de separación y electrospray ionización-mass spectrometry (ESI-MS) de oligosacáridos derivados de LPS. Aquí, extendemos nuestra estrategia de micropurification para el análisis de las formas O-desacilada LPS de Vibrio fischeri HMK después de solos bandas de LPS de revés teñido usando recuperación asistida por matriz láser desorción/ionización-tiempo de vuelo-espectrometría de masas (MALDI-TOF-MS). Las cantidades (30-40 microg) obtenidas de las dos bandas de LPS resuelta en gel eran suficientes para permitir la detección de MALDI-TOF-MS de O-desacilada LPS glicoformas en m/z 3767.1, 3890.1 para el alto peso molecular o en m/z 2522.5, 2645.4, 2725.7 y 2848.7 para la banda de LPS de bajo peso molecular. Estas heterogeneidades de banda LPS resultaron no sólo de las variaciones en la región de oligosacáridos de los LPS, sino también de dos Estados de fosforilación de los lípidos de la A (diphosphoryl y diphosphoryl además una substitución de phosphoethanolamine solo). Por otra parte, espectrometría de masas MALDI-TOF de las bandas separadas de LPS muestra había reducido heterogeneidad y aumenta la relación señal / ruído en comparación con los espectros de los LPS no purificados. Además, micropurification de bandas de LPS anteriores MALDI-TOF-MS condujo a una mayor sensibilidad de detección de menos abundantes glicoformas LPS de bajo peso molecular. Tomados en conjunto, esto y nuestro estudio anterior en gel-micropurified LPS con ESI definitivamente muestran cómo uno puede determinar claramente las diferentes especies moleculares dentro de cada banda de LPS gel separados, su abundancia relativa y secuencias de oligosacáridos.

Nueva Modificación Del Lípido A De Francisella Tularensis

Infection and Immunity. Sep, 2004  |  Pubmed ID: 15322031

Hemos investigado el lípido cepa de A de Francisella tularensis subsp. holarctica 1547-57, una cepa de tipo B, mediante espectrometría de masas de ionización-tiempo de vuelo de desorción de láser asistida por matriz, espectrometría de masas de trampa de iones nanoelectrospray cuadrupolo y métodos químicos. Según las estructuras previamente publicadas del lípido A de F. tularensis vivo cepa vacunal (LVS) (ATCC 29684) (E. Vinogradov et al, EUR j Biochem. 269:6112-6118, 2002), todas las formas de lípidos principales A partir de cepa 1547-57 fueron tetraacylated. Como en la cepa LVS, los principales ácidos grasos detectados en el lípido de F. tularensis 1547-57 que una muestra incluyó 3-hydroxyoctadecanoic ácido, ácido 3-hydroxyhexadecanoic, ácido hexadecanoico y ácido tetradecanoico. Sin embargo, varios de los lípidos que a componentes presentan en cepa 1547-57 eran de peso molecular más alto que las estructuras previamente publicados. Un componente importante con un m de 1.666 fue encontrado para contener tres ácidos grasos C(18:0)(3-OH), un ácido graso C(16:0), un grupo fosfato y una molécula de 161-Da. Este 161-Da puede extraerse el lípido A por el tratamiento con ácido fluorhídrico acuoso y fue identificado como galactosamina peracetylation y análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas. Detalladas investigaciones del M (r)-1.666 especies por espectrometría de masas de trampa de iones con múltiples etapas de fragmentación sugirieron que la galactosamina-1-fosfato estaba ligada a la terminal de la reducción de los lípidos A. Similar a la modificación de lípidos A con arabinosamine, especie de lipopolisacáridos de F. tularensis que contiene una galactosamina fosfato-ligado potencialmente podría influir en su supervivencia intracelular por que confieren resistencia a péptidos antimicrobianos.

Regulador Lipofílico De Un Interruptor De Desarrollo En Caenorhabditis Elegans

Aging Cell. Dec, 2004  |  Pubmed ID: 15569358

Resumen En Caenorhabditis elegans, la decisión de convertirse en un adulto reproductivo o arresto como una larva dauer está influenciada por múltiples vías, incluyendo insulina y del factor de crecimiento transformante beta (TGFbeta)-al igual que las vías de señalización. Se ha propuesto que las hormonas lipófilas actuar aguas abajo de estas vías para regular la formación dauer. Un posible objetivo de una hormona es DAF-12, un receptor huérfano hormonal nuclear que interviene en las decisiones de desarrollo y también influye en la vida adulta. Con el fin de encontrar las hormonas lipófilas hemos generado extractos lipofílicos a partir de cultivos en masa de C. elegans y demostrado que rescatar el fenotipo dauer constitutiva de clase 1 daf-2 mutantes señalización de la insulina y la TGFbeta señalización mutantes daf-7. Estos extractos también son capaces de rescatar el fenotipo letal de dauer daf-9 mutantes, que carecen de una hidroxilasa P450 esteroides se cree que participan en la síntesis de la DAF-12 ligando, extractos, sin embargo, no tienen ningún efecto en el DAF-12 ligando mutante dominio de unión que se prevé que sea ligando insensible. La producción de esta hormona parece ser dependiente de DAF-9 como extractos de un daf-9; daf-12 doble mutante, que no presentan esta actividad. Fraccionamiento preliminar de los extractos lipofílicos muestra que la actividad es hidrófobo con algunas propiedades polares, consistente con una hormona lipofílica pequeña. Proponemos que la actividad de rescate dauer es una hormona sintetizada por DAF-9, que actúa a través de DAF-12.

Componentes Moleculares De Un Camino De Muerte Celular Activado Por El Estrés Del Retículo Endoplasmático

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2004  |  Pubmed ID: 14561754

Alteraciones en la homeostasis del Ca2 + y la acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico (ER) causan estrés ER que conduce finalmente a la muerte celular programada. Estudios recientes han demostrado que factores desencadenantes de estrés ER programación muerte celular mediante una alternativa vía intrínseca de la apoptosis que, a diferencia de la vía intrínseca que se ha descrito anteriormente, es independiente de Apaf-1 y citocromo c. En el presente trabajo, hemos utilizado un conjunto de enfoques complementarios, incluyendo electroforesis bidimensional juntada con espectrometría de masas de ionización-tiempo de vuelo de desorción de láser asistida por matriz y nano-líquido cromatografía-electrospray ionization mass spectrometry con espectrometría de masas en tándem, ARN de interferencia, co-inmunoprecipitación, immunodepletion de proteínas de candidato y estudios de la reconstitución, para identificar los mediadores de la vía de la muerte celular inducida por estrés de ER. Nuestros datos identifican dos moléculas, proteína que contiene valosin y apoptosis-ligado gene-2 (ALG-2), que parecen jugar un papel en la mediación de la muerte celular inducida por estrés de ER.

Identificación De Un Transportador De La Novela De ácido Siálico En Haemophilus Ducreyi

Infection and Immunity. Oct, 2005  |  Pubmed ID: 16177350

Haemophilus ducreyi, el agente causante del chancro, produce un lipooligosaccharide (LOS) que termina en N-acetyllactosamine. Esta glucoproteína puede ser ampliado mediante la adición de un único ácido siálico residuo a la molécula de galactosa terminal. H. ducreyi no sintetiza el ácido siálico, que deben adquirirse desde el host durante la infección o de medio de cultivo cuando las bacterias son cultivadas in vitro. Sin embargo, H. ducreyi no tienen genes que son altamente homólogos a los genes que codifican transportadores bacteriana conocida el ácido siálico. En este estudio, se identificaron el transportador de ácido siálico por detección de cepas en una biblioteca de mutantes transposon aleatorio para los mutantes que fueron incapaces de añadir ácido siálico a LOS que contienen N-acetyllactosamine. Mutantes que reaccionaron con el anticuerpo monoclonal 3F11, que reconoce la estructura de la terminal de lactosamine, y carecían de reactividad con la aglutinina de amurensis Maackia lectina, que reconoce alfa2, 3-ligado ácido siálico, caracterizaron más para demostrar que produjeron a LOS N-acetyllactosamine-que contengan gel de electroforesis y masa espectrometría análisis de plata-manchados de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida. Los genes interrumpidos en estos mutantes fueron asignados a un racimo de cuatro genes con semejanza a los genes que codifican transportadores de ABC bacterianas. Ensayos de absorción radiactiva ácido siálico confirman que los mutantes eran incapaces de transportar el ácido siálico. Este estudio es el primer informe de bacterias mediante un transportador ABC para la absorción del ácido siálico.

Rápida Purificación Y Caracterización De Espectrometría De Masa De Mitocondrial NADH Deshidrogenasa (complejo I) De Cerebro De Roedor Y Una Línea De Células Neuronales Dopaminérgicas

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Jan, 2005  |  Pubmed ID: 15591592

Estrés oxidativo y la disfunción mitocondrial significan importantes eventos bioquímicos asociados con la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la enfermedad de Parkinson (EP). Estudios utilizando modelos in vitro e in vivo de PD o tejidos de pacientes enfermos han demostrado una inhibición selectiva de la mitocondrial NADH deshidrogenasa (complejo I de la cadena de transporte de electrones OXPHOS) que afecta a la fisiología mitocondrial normal conduce a la muerte neuronal. En un estudio anterior, hemos demostrado que el estrés oxidativo debido al agotamiento de glutatión en las células dopaminérgicas, un sello distintivo de la EP, conduce a complejo I inhibición mediante oxidación de tioles de cisteína (j Biol Chem. 275, 26096-26101. Jha et al., (2000)). Complejo I es un aproximadamente 980-kDa multimérica enzima que atraviesan la membrana mitocondrial interna que comprende por lo menos 45 subunidades de proteína. Como prerrequisito para investigar modificaciones al complejo utilizando un modelo de roedores de la enfermedad para PD, hemos desarrollado dos rápido independiente y procedimientos de aislamiento suave basado en fraccionamiento gradiente de sacarosa e inmunoprecipitación para aislar el complejo I de cerebro de ratón y una línea de células neuronales dopaminérgicas mesencefálicas cultivadas de rata. Ambos protocolos son capaces de purificar el complejo I de pequeñas cantidades de cultivos de tejidos y células roedores. Electroforesis nativa azul, unidimensional y bidimensional SDS-PAGE se emplearon para evaluar la pureza y la composición del complejo aislado he seguido por amplia caracterización de espectrometría de masa. En total, 41 de 45 roedor complejo me subunidades logrado MS/MS secuencia cobertura. A nuestro conocimiento, este estudio proporciona la primera detallados análisis de espectrometría de masa del complejo neuronal proteínas y proporciona un medio para investigar el papel de la oxidación de la cisteína y otras modificaciones postraduccionales en patologías asociadas con la disfunción mitocondrial.

El Proteoma Mitocondrial Humano: Estrés Oxidativo, Modificaciones De La Proteína Y Fosforilación Oxidativa

The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. May, 2005  |  Pubmed ID: 15743667

Las mitocondrias son uno de los más complejos de organelos subcelulares y juego de roles clave en muchas funciones celulares, incluyendo la producción de energía, metabolismo de ácidos grasos, biosíntesis de la pirimidina, homeostasis del calcio y señalización celular. En los últimos años, nosotros y otros grupos hemos intentado identificar el conjunto completo de proteínas que se localizan a las mitocondrias humanas como una forma de entender mejor sus funciones celulares y cómo se comunica con otro compartimento celular en vías de señalización complejos tales como el estrés oxidativo y apoptosis. De hecho, hay un creciente interés en la comprensión de los detalles moleculares del estrés oxidativo y la función mitocondrial en este proceso, como así como evaluación de proteínas mitocondriales cómo se daña o posttranslationally modificado como consecuencia de un importante cambio en el estado de redox de la célula. En esta revisión, Informe sobre el estado actual del proteoma mitocondrial humano con énfasis hacia la comprensión de cómo mitocondriales proteínas, especialmente las proteínas que conforman la cadena respiratoria o enzimas de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), se modifican en varios modelos de enfermedades relacionadas con la edad como el cáncer y la enfermedad de Parkinson (EP).

Caracterización De Un Racimo De Tres Glicosiltransferasa Enzimas Esenciales Para El Montaje De Moraxella Catarrhalis Lipooligosaccharide

Journal of Bacteriology. May, 2005  |  Pubmed ID: 15838019

Moraxella catarrhalis aísla expresa lipooligosaccharide (LOS) moléculas en su superficie, que comparten epítopes similar a la de las especies de Neisseria y Haemophilus. Estos epitopos de LOS comunes se han implicado en varios pasos de la patogenesia de los diferentes organismos. En este estudio, un grupo de tres genes de glicosiltransferasa LOS (lgt) identificaron en M. catarrhalis 7169, una cepa que produce un serotipo B LOS. Se construyeron mutantes en estos genes glicosiltransferasa y los fenotipos de LOS resultantes eran constantes con diversos grados de truncamiento en comparación con LOS de tipo salvaje. Las estructuras de LOS de cada mutante de la lgt no fueron detectadas por un anticuerpo monoclonal (MAb 4 5) específico a un epitopo terminal altamente conservado ni por un anticuerpo monoclonal (MAb 3F7) específico para el serotipo cadena lateral de LOS B. Espectrometría de masas de la glicoformas de LOS ensamblados por dos de estos mutantes lgt indicó que PGT1 codifica una glucosiltransferasa de alpha(1-2) y el PGT2 codifica una galactosyltransferase de la Unión. Sin embargo, estos estudios estructurales no podrían delinear la función para PGT3. Por lo tanto, M. catarrhalis PGT3 fue introducido en una glucosiltransferasa Unión definida Haemophilus ducreyi 35000glu-mutante en el transporte, y el anticuerpo monoclonal análisis confirmó que PGT3 complementa el defecto de LOS. Estos datos sugieren que PGT3 codifica una glucosiltransferasa involucrado en la adición de una glucosa de beta(1-4)-ligado al núcleo interno. Por otra parte, concluimos que este paso enzimático es esencial para el montaje de la glucoproteína completa de LOS expresado por M. catarrhalis 7169.

Identificación De Espectrometría De Masa De Una Novela Fosforilación Web En La Subunidad NDUFA10 De Bovino Mitocondrial Del Complejo I

FEBS Letters. Apr, 2005  |  Pubmed ID: 15848193

Mitocondrial del complejo I (oxidorreductasa NADH: Ubiquinona) consiste de al menos 46 subunidades. Fosforilación de la subunidad de 42 kDa NDUFA10 recientemente se ha informado mediante una tinción fosfoproteína novela [Schulenberg et al (2003) Análisis de fosforilación de la proteína de estado estacionario en la mitocondria utilizando un tinte de novela phosphosensor fluorescente. J Biol Chem 278, 27251]. Dos complejos más pequeños me fosfoproteínas, ESSS y MWFE y sus sitios de modificación, ya que se han determinado [Chen et al (2004) la fosforilación de las subunidades del complejo I de mitocondrias de corazón bovino. J Biol Chem 279, 26036]. Aquí identificamos el sitio de fosforilación en NDUFA10 de las mitocondrias de corazón bovino por espectrometría de masas en tándem. Una sola fosfopéptidos que abarcan residuos 47-60 fue identificado y confirmado por la síntesis que (47)LITVDGNICSGKpSK(60), establecimiento de serina-59 como el sitio de fosforilación.

Caracterización Bioquímica Y Funcional De Las Ampollas De Membrana Purificada De Neisseria Meningitidis Serogrupo B

The Journal of Biological Chemistry. Nov, 2005  |  Pubmed ID: 16103114

Estudios con agregados purificados de la endotoxina han puesto de manifiesto la importancia de la proteína fijadora de lipopolisacárido (LBP) - dependiente de extracción y transferencia de las moléculas individuales de la endotoxina a CD14 en Toll-like receptor 4 (TLR4) - dependiente de la activación de la célula. La endotoxina es normalmente incrustado en la membrana externa de las bacterias gramnegativas intactas y arrojar vesículas de membrana ("ampollas"). Sin embargo, la capacidad de ETB y CD14 eficientemente promover la activación de la célula de TLR4-dependiente por la endotoxina asociada a membrana no se ha estudiado extensivamente. En este estudio, se utilizó un auxotroph acetato de Neisseria meningitidis del serogrupo B para facilitar el etiquetado metabólico de la endotoxina bacteriana y en comparación con las interacciones de agregados de endotoxina purificada y de la endotoxina asociada a membrana con LBP, CD14 y células sensibles endotoxina. La endotoxina, fosfolípido y composición proteica de las ampollas recuperadas indican que las ampollas se derivan de la membrana bacteriana externa. Análisis proteómico revelaron un inusual enriquecimiento en altamente catiónico (pI > 9) proteínas. Ambos purificaron agregados de endotoxina y ampollas activan los monocitos y las células endoteliales en un LBP-, CD14 y forma TLR4/MD-2-dependiente, pero las ampollas fueron 3-10 veces menos potente cuando normalizado por la cantidad de endotoxinas añadido. Diferencias en potencia correlacionada con las diferencias en la eficacia de entrega LBP-dependiente y extracción de la endotoxina por CD14. Los fosfolípidos de la membrana y de la endotoxina se extraen por CD14 soluble/LBP (sCD14) el tratamiento, pero sólo endotoxin.sCD14 reacciona con MD-2 y estimula a las células. Estos resultados indican que la potencia proinflamatorias de endotoxina podría estar regulada no sólo por las propiedades estructurales intrínsecas de la endotoxina, sino también por su asociación con los vecinos de las moléculas en la membrana externa.

Transportador De La Novela De ácido Siálico De Haemophilus Influenzae

Infection and Immunity. Sep, 2005  |  Pubmed ID: 16113244

Nontypeable Haemophilus influenzae es un patógeno oportunista y una causa común de la otitis media en niños y de bronquitis y neumonía en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Los lipooligosaccharides, un componente importante de la membrana externa de H. influenzae, juega un papel importante en la patogenicidad y virulencia microbiana. Ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) puede ser incorporado en el lipooligosaccharides como un azucarillo nonreducing terminal. Aunque gran parte de la vía de la incorporación de ácido siálico en lipooligosaccharides se entiende, el transportista responsable de la absorción de ácido N-acetilneuramínico en H. influenzae aún tiene que definirse. En este trabajo demostramos que este transportador es un transportador de azúcar de novela de la familia de transportador periplasmic tripartita de ATP-independiente. En ausencia de este transportador, H. influenzae no puede incorporar ácido siálico en su lipooligosaccharides, haciendo el organismo incapaz de sobrevivir cuando se expone al suero humano y causando reduce la viabilidad en el crecimiento del biofilm.

Análisis Proteómico De La Succinato Deshidrogenasa Y Ubiquinol-citocromo C Reductasa (complejo II Y III) Aislada Por Inmunoprecipitación De Mitocondrias De Corazón De Bovino Y El Ratón

Biochimica Et Biophysica Acta. Feb, 2006  |  Pubmed ID: 16120479

El sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) consiste en cinco complejos de la Multi-enzima, complejos I a V y es un componente clave de la función mitocondrial relativos a la producción de energía, el estrés oxidativo, la señalización celular y la apoptosis. Defectos o una reducción en la actividad en diversos componentes que conforman las enzimas OXPHOS puede causar enfermedades graves, como enfermedades neurodegenerativas y diversos trastornos metabólicos. Nuestro objetivo es desarrollar técnicas que son capaces de análisis rápido y profundo de los cinco complejos OXPHOS. Aquí, describimos un suave, micro escala immunoisolation y método de espectrometría/proteómica masa para la caracterización del complejo II (succinato deshidrogenasa) y el complejo III (ubiquinol-citocromo c reductasa) de mitocondrias de corazón bovino y roedores. Cobertura de secuencia extensa proteína se obtuvo después de Inmunocaptura, 1D análisis espectrométrico SDS PAGE separación y masa para la mayoría de las subunidades de 4 y 11, respectivamente, que forman complejos II y III. La identificación de varias modificaciones post-traduccionales, incluyendo la modificación covalente de la FAD de subunidad flavoproteína 1 del complejo II, fue posible debido a la alta cobertura de espectrometría de masa de la secuencia.

Estable Isótopo Etiquetado Metabólico De Neisseria Meningitidis Lipooligosaccharide

Journal of Endotoxin Research. 2006  |  Pubmed ID: 16690012

El lipooligosaccharide (LOS) de un auxotroph de acetato de Neisseria meningitidis metabólicamente fue etiquetado con cualquiera de los dos [2-13C]-acetato de sodio o [1, 2-13 C 2]-acetato de sodio. En este estudio demostramos que esta etiqueta se incorporó eficientemente tanto los bandos de acil de lípido A y las dos N-acetylglucosamines presente en la rama de oligosacáridos de LOS. El desarrollo de este protocolo etiquetado eficiente resulta útiles estudios estructurales en el futuro, analizar las interacciones entre proteínas LOS y anfitrión.

Sitios De Fosforilación De Huntingtina Asignados Por Espectrometría De Masas. Modulación De Escote Y Toxicidad

The Journal of Biological Chemistry. Aug, 2006  |  Pubmed ID: 16782707

Huntingtina (Htt) es una proteína grande de 3144 aminoácidos, cuya función y regulación no han sido definidas. Expansión de poliglutaminas (poliQ) en la terminal N de Htt provoca la neurodegenerativas trastorno enfermedad de Huntington (EH). La citotoxicidad del mutante Htt es modulada por clivaje proteolítico con caspasas y generando N-terminal poliQ que contienen fragmentos de calpains. Presumimos que la fosforilación de Htt puede modular escote y citotoxicidad. En el presente estudio, nos hemos trazado los sitios principales de la fosforilación de Htt utilizando modelos de cultivo celular (293T y células PC12) expresando integral Htt myc-etiquetado construye con repeticiones 23Q o 148Q. Purificada Htt myc-etiquetadas se sometió a análisis de espectrometría de masa como espectrometría de masas desorción/ionización láser asistida por matriz y espectrometría total en tándem nano-HPLC, utilizado en conjunción con fosfatasa alcalina en meta y digestiones de proteasa. Hemos identificado más de seis sitios de fosforilación de serina novela dentro de Htt, uno de los cuales se encuentra en el dominio de susceptibilidad proteolítica. Tres de los sitios tienen la secuencia consenso de ERK1 fosforilación y adición de fosforilación de bloques de inhibidor de ERK1 en esos sitios. Otros sitios de fosforilación observada posiblemente son sustratos para quinasas CDC2/CDK5. Mutación de aminoácido Ser-536, que se encuentra en el dominio de la susceptibilidad proteolítica, ácido aspártico, inhibida calpain escote y reduce la toxicidad de Htt mutante. Los resultados presentados aquí representan los primeros mapas detallados de los sitios de fosforilación en cuerpo entero Htt. disección de modificaciones de la fosforilación en Htt puede dar pistas a la patogénesis de la enfermedad de Huntington y objetivos para el desarrollo terapéutico.

DAF-12-dependiente De Rescate De La Formación Dauer En Caenorhabditis Elegans Por (25S)-ácido Cholestenoic

Aging Cell. Aug, 2006  |  Pubmed ID: 16913876

Disponibilidad de la densidad de población, la temperatura y la comida durante todo el regular la formación de la larva dauer Caenorhabditis elegans por la modulación de las vías de señalización endocrina. El receptor nuclear huérfano DAF-12 es fundamental para la decisión de formar un dauer o para seguir el desarrollo reproductivo normal. El DAF-12 ligando se ha previsto para ser un esterol que se metaboliza por DAF-9, un citocromo P450. Aquí químicamente caracterizar purificado extractos lipofílicos de nematodos y muestran que el ligando para DAF-12 contiene un resto carboxilo y es probable que se deriva de un esterol. El uso de un ligando candidato acercarse nos encontramos con que el ácido C27 de ácidos biliares cholestenoic (5-colesten-3beta-ol-(25S)-carboxílico) promueve el crecimiento reproductivo en dauer-constitutivos mutantes en un daf-9-y daf-12-dependiente manera. Además, encontramos que el ácido cholestenoic puede actuar como un ligando de DAF-12 mediante la activación de DAF-12 en un ensayo de transcripción basado en células. Análisis de dauer-salvamento extractos lipofílicos de nematodos por cromatografía de gases-espectrometría de masas indica la presencia de varios regioisómeros de ácido cholestenoic que son distintos de delta (5)-cholestenoic ácido y no están presentes en extractos de daf-9 mutantes. Estos datos sugieren que los esteroles carboxilados pueden ser determinantes clave de la historia de la vida.

Papel De LgtC En La Resistencia De No Tipificable Haemophilus Influenzae Cepa R2866 En Suero Humano

Infection and Immunity. Nov, 2006  |  Pubmed ID: 16966407

Estamos investigando un no tipificable cepa de Haemophilus influenzae (NTHI), R2866, aislado de un niño con meningitis. R2866 es excepcionalmente resistente a la matanza por el suero humano normal. El suero 50% concentración inhibitoria (IC50) para esta variedad es de 18%, de encapsulado H. influenzae. R3392 es un derivado de R2866 que se encontró que han aumentado la sensibilidad al suero humano (IC50, 1,5%). Análisis de las regiones de repetición tetramérica dentro de genes biosintéticos de lipooligosaccharide (LOS) en ambas cepas indican que el glicosiltransferasa genes lgtC marco ("off") en la mayoría de las colonias de R3392 pero en marco con su codón de inicio ("on") en la mayoría de las colonias de los padres. Se buscaron pruebas antigénicas y bioquímicos para la modificación de la estructura de LOS. En un célula entera enzyme-linked immunosorbent assay, cepa que r3392 muestra reduce atascamiento de la Galalpha1, anticuerpo monoclonal de específico de Gal 4 4 4. Análisis de espectrometría de masas de LOS de cepa R2866 indicó que la glucoproteína oligosacárido primaria contenía Heptosa cuatro y cuatro residuos de hexosa, mientras que la de R3392 contuvo cuatro Heptosa y tres residuos de hexosa. Concluimos que el R2866 lgtC gen codifica una galactosyltransferase implicados en la síntesis de los 4 4 epitope, como en otras cepas y esa expresión de lgtC se asocia con la resistencia de alto nivel del suero que se ha observado para esta variedad. Se trata de la primera descripción de la base genética de la resistencia de alto nivel del suero en NTHI, así como la primera descripción de la composición de LOS en una variedad NTHI para que se ha determinado la secuencia completa del genoma.

Novela Vías Asociadas Con El Estrés De Quinona-inducida En Células De Cáncer De Mama

Drug Metabolism Reviews. 2006  |  Pubmed ID: 17145690

Cánceres hormono-dependientes que sobreexpresan el factor de transcripción nuclear-ligando, el receptor de estrógeno (ER), representan la forma más común de neoplasia epitelial de la mama. Exposición de células epiteliales de mama a un ciclo redox y arylating quinona induce la fosforilación de cinasa de proteína quinasa activada de la proteína del citoesqueleto filamentos, citoqueratina-8, junto con cetonas tiol de histonas nucleares H3. Quinones exógenos o endógenos también pueden inducir la translocación nuclear independiente del ligando y fosforilación de ER; con la exposición excesiva, estos quinonas pueden arylate ER dedos de cinc, alterar el ADN de ER y alterar la expresión del gen ER-inducible. Enriquecimiento de inmunoafinidad para proteínas de baja abundancia como ER, juntada con técnicas de espectrometría de masas moderno, promete mejorar la comprensión de las proteína-modificaciones producidas por la exposición de la quinona endógenos y exógenos y su papel en el desarrollo o la progresión de Neoplasias epiteliales como cáncer de mama.

Caracterización De Patrones De Acilación De Lípido A Francisella Tularensis, Francisella Novicida Y Francisella Philomiragia Usando Espectrometría De Múltiples Etapas Y Láser Asistida Por Matriz Desorción/ionización En Una Trampa De Iones Lineal Intermedia Fuente De Vacío

Analytical Chemistry. Feb, 2007  |  Pubmed ID: 17263332

Lipopolisacárido (LPS) es un componente importante de la membrana externa de las bacterias gramnegativas. La región del lípido A del LPS estimula el sistema inmunológico en una forma dependiente de la estructura. Previamente hemos identificado las dos especies principales lípido A de Francisella tularensis como estructuras tetraacylated asimétrica que contiene cuatro cadenas acil largo (16 y 18 carbonos) y un grupo fosfato solo que se modifica parcialmente por galactosamina (Phillips, N. J.; Schilling B.; McLendon, M. K.; Apicella, M. A.; Gibson, B. W. infectar. Immun. 2004, 72, 5340-5348). En el presente estudio, utilizamos láser asistida por matriz desorción/ionización en una fuente de vacío intermedia (vMALDI) acoplada a un espectrómetro de masas de trampa de iones lineal (LIT) en modo de fragmentación total de gradación múltiple (MSn) para determinar las estructuras de varias especies menores y baja abundante lípido A presentes en Francisella philomiragia LPS que no han sido previamente caracterizados, Francisella novicida y F. tularensis. Estudios de fragmentación de vMALDI integral-MSn permitieron deducir la composición y la posición de los sustituyentes de ácidos grasos en los bandos del lípido A. Inesperadamente, la mayoría de estas una especie de lípido menores consistió en múltiples especies isobáricos con cadenas acil de varias longitudes. Por otra parte, encontramos que una pequeña porción de estas especies de lípido A puede modificarse mediante la adición de un azúcar hexosa o hexosamina, además de la galactosamina que fue identificada previamente. En general, encontramos que el análisis de MSn en la plataforma vMALDI-LIT-MS era altamente eficiente y sensible, lo que permite un análisis exhaustivo de lípidos muy menor una especie.

Cuantificación De La Oxidación De La Cisteína En Receptor De Estrógeno Humano Por Espectrometría De Masas

Analytical Chemistry. Apr, 2007  |  Pubmed ID: 17373775

Modificaciones de redox-dependiente de grupos sulfidrilo dentro de los dos dedos de cinc Cys4 del resultado del dominio (ER-DBD) de estrógeno receptor ADN daños estructurales y pérdida de función de unión al ADN de ER, que es paralelo a la situación observada en muchos cánceres de mama ER-positivos. Cuantificación del estado redox de tioles de la cisteína en ER-DBD empleados específicos de cisteína oxidantes para inducir diversos grados de oxidación en ER recombinante, seguido por alquilación diferencial con los reactivos etiquetados isotópicos estables [12 C 2] - ácido iodoacetic y [13C 2] - ácido Bromoacético. Posterior proteólisis con LysC/Asp-N genera péptidos diagnósticos que el péptido C-terminal del segundo dedo de cinc se detecta más fuertemente por espectrometría de masas (MS) y sirve como marcador adecuado del estado redox de ER-DBD. Se recogieron datos de dos diferentes instrumentos de MALDI-MS: un tiempo de vuelo y una trampa de iones lineal (vMALDI-LIT). Un péptido sintético análogo pero más grande tratado con tres variantes isotópicas del reactivo alquilante modelado traslapos isotópicos que podrían complicar la cuantificación relativa de la oxidación de la cisteína. A pesar de los solapes isotópicos, logró excelente cuantificación relativa de MS datos obtenidos de ambos instrumentos. Esto también era cierto de datos de MS/MS de tándem de los vMALDI oscuros, que deben facilitar el control de la reacción seleccionada. Cuantificación relativa por MS también muy igualados datos de métodos inmunoquímicos.

Immunopurification En Pequeña Escala De La Citocromo C Oxidasa Para Un Análisis De Multiplexación De Alto Rendimiento De La Actividad Enzimática Y La Cantidad

Biotechnology and Applied Biochemistry. Dec, 2007  |  Pubmed ID: 17508937

COX (citocromo c oxidasa) deficiencia es una de las principales causas de enfermedad genética mitocondrial y presenta varios fenotipos, dependiendo de si la mutación causal existe en un gen mitocondrial o nuclear y si se trata de un componente catalítico o estructural alterado o un factor de la Asamblea para esta enzima 13-subunidad embebido en membrana compleja. Deficiencia COX se observa habitualmente en AD (la enfermedad de Alzheimer), aunque hay un debate continuo sobre si esto es causativo o una consecuencia secundaria de la condición. Niveles alterados de COX y fosforilación oxidativa reducida capacidad se han divulgado en otras enfermedades, incluyendo cáncer y se consideran los efectos secundarios no deseados en un número de tratamientos de drogas, particularmente con los tratamientos antirretrovirales y antibiótico. Aquí, presentamos un protocolo de placa de 96 pocillos simple, rápido y de alto rendimiento que utiliza un enfoque múltiple para determinar la cantidad y la actividad de COX, que debe encontrar un uso generalizado en la evaluación de las enfermedades arriba y en estudios de seguridad de medicamentos. Lo importante, el método utiliza cantidades muy pequeñas de material de la célula o tejido y no requiere el aislamiento de las mitocondrias. Les mostramos la utilidad de este enfoque por ejemplo del análisis de los fibroblastos de pacientes con deficiencia de la actividad COX y el efecto de la ddC de drogas antirretrovirales (2', 3'-dideoxycytidine) en la biogénesis de la enzima.

Propuesta Segunda Clase De Cepas De Haemophilus Ducreyi Mostrar Proteína Alterada Y Perfiles De Lipooligosaccharide

Proteomics. Sep, 2007  |  Pubmed ID: 17676659

Haemophilus ducreyi es el agente etiológico del chancroide, una enfermedad de transmisión sexual úlcera genital. Previamente hemos demostrado que los perfiles de proteínas y lipooligosaccharide (LOS) estructuras de varias cepas de H. ducreyi generalmente son muy bien conservadas. Estudios anteriores han demostrado que al menos una cepa, 33921, tiene un perfil de la variante de la proteína y estructura de LOS. En este estudio, tanto el lisado de células enteras y las proteínas de la membrana de cepa 33921 fueron más examinadas y comparadas con la cepa prototipo 35000HP 2-DE y el 16-BAC (cloruro de bencildimetil-n-hexadecylammonium cloruro) / sistema de dos-detergente SDS-PAGE, respectivamente. Estas comparaciones demostraron que una serie de proteínas que podrían ser identificados de ambas cepas modificó posiciones en los geles, tanto en su peso molecular aparente y valores de pI. Cepa 33921 ha sugerido para ser miembro de una clase de segundo de cepas, como cepas de clase II. En este estudio, los perfiles proteómicos y las estructuras de LOS de las cinco cepas potenciales de II clase fueron examinadas y encontradas para ser similar a la cepa 33921.

Análisis Proteómico De La Membrana Plasmática Y Vesículas Secretoras De Neutrófilos Humanos

Proteome Science. 2007  |  Pubmed ID: 17692124

Los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) constituyen un componente esencial de celular de defensa del huésped innata contra invasión microbiana y exhiben una amplia gama de respuestas a estímulos solubles y particuladas. Como las células reclutaron más temprano durante la inflamación aguda, PMN responder rápidamente y lanzar una variedad de agentes citotóxicos potentes en cuestión de minutos de exposición a microbios o sus productos. PMN se basan en la redistribución de las proteínas funcionalmente importantes, de compartimientos intracelulares a la membrana plasmática y fagosoma, como el medio por el cual responder rápidamente. Para determinar el rango de proteínas de membrana disponibles para contratación rápida durante la activación de PMN, se analizaron las proteínas en fracciones subcelulares enriquecidos para la membrana plasmática y vesículas secretoras se recuperó de la fracción ligera de membrana de PMN en reposo después de la centrifugación de gradiente de Percoll y purificación de electroforesis de flujo libre usando métodos de espectrometría de masa basada en proteómica.

Identificación De LpxL, Una Tarde Aciltransferasa De Francisella Tularensis

Infection and Immunity. Nov, 2007  |  Pubmed ID: 17724076

Lipopolisacárido (LPS) es un componente importante de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, y la región del lípido A del LPS media estimulación del sistema inmune de una manera dependiente de la estructura. A diferencia de los LPS de muchas otras bacterias Gram-negativas, el LPS de Francisella tularensis aislado de cultivos in vitro no es proinflamatorias. Este observó falta de destreza proinflamatorias puede reflejar las características estructurales de los lípido A, como el número y longitud de las cadenas acil y el grupo de single-fosfato. Para entender mejor este fenotipo, comenzamos a dilucidar la biosíntesis de LPS en F. tularensis. Os presentamos la complementación, mutacional, y datos químicos demostrando F. tularensis FTT0232c codifica una enzima funcional de Aciltransferasa finales con especificidad similar a la del ortólogo de Escherichia coli LpxL. Expresión de este último Aciltransferasa complementa los sensibles a la temperatura y fenotipos de A hypoacylated lípidos de un mutante de e. coli lpxL, expresión de FTT0232c se incrementa durante el crecimiento intracelular con respecto a durante el crecimiento in vitro, y finalmente, LPS obtenidas de un mutante de F. tularensis carecer FTT0232c mostraron una especie de lípido A triacyl abundante después de análisis de espectrometría de masa, consistente con la pérdida de una Aciltransferasa final de LpxL.

Reglamento De Transporte De ácido Siálico Y Catabolismo En Haemophilus Influenzae

Molecular Microbiology. Oct, 2007  |  Pubmed ID: 17880422

Virulencia de Hemophilus-influenzae no tipificable (NTHi) depende de la decoración de lipooligosaccharide con el ácido siálico. Este azúcar debe derivarse del anfitrión, como NTHi no puede sintetizar ácidos siálicos. NTHi también puede utilizar el ácido siálico como fuente de carbono. Los genes que codifican el transportador de ácido siálico y los genes que codifican las actividades catabólicas se localizan dos operones divergently transcritos, el operón siaPT y el operón de nan, respectivamente. En este estudio, se identificaron SiaR como represor de transporte de ácido siálico y catabolismo en NTHi. Inactivación de siaR dio lugar a la expresión no regulada de los genes en ambos operones. Catabolismo no reglamentada de ácido siálico en el mutante siaR resultó en la reducción de superficie asimismo y un aumento en la sensibilidad del suero. Además de represión mediada por SiaR, CRP, la proteína del receptor de campo, fue demostrado para activar la expresión del operón siaPT pero no el operón de nan. Describimos un modelo en el cual SiaR y CRP trabajan para modular los niveles intracelulares de ácido siálico. Nuestros resultados demuestran la importancia de la regulación mediada por SiaR para equilibrar el requisito de superficie asimismo y la acumulación tóxica de intracelular de ácido siálico.

Identificación De Genes Implicados En La Expresión De Las Estructuras Lipooligosaccharide Anormal De Una Segunda Clase De Haemophilus Ducreyi

Infection and Immunity. Jan, 2007  |  Pubmed ID: 17030566

Haemophilus ducreyi es una bacteria gramnegativa que es el agente causante del chancroide. Cepa 35000HP se ha caracterizado bien y es representante de la mayoría de cepas de H. ducreyi. Cepa 35000HP produce un lipooligosaccharide (LOS) que contiene D-glycero-D-manno-Heptosa en la extensión de la cadena del oligosacárido principal; el gen lbgB se ha demostrado para codificar el DD-heptosyltransferase. El gen lbgB se encuentra en un clúster de gene junto con el gen lbgA, que codifica para la galactosyltransferase yo. Estos dos genes están flanqueados por genes de dos limpieza, rpmE y xthA, codificación de la proteína ribosomal L31 y la exonucleasa III, respectivamente. Recientemente, se han identificado un segundo grupo de cepas de H. ducreyi. Cepa 33921, un representante de las cepas de clase II, produce un LOS que carece de la porción del oligosacárido de su LOS DD-Heptosa. Para entender mejor la biosíntesis de LOS DD-Heptosa-deficient 33921, hemos clonado y secuenciado la región genómica correspondiente de lbgAB de cepa 33921. Similar a la cepa 35000HP, el genoma 33921 contiene xthA y rpmE. Sin embargo, entre estos dos genes se identificaron los genes que codifican glicosiltransferasas putativos dos que no fueron altamente homólogas a los genes de lbgAB de 35000HP. En este estudio demostramos que el producto de uno de estos genes codifica una galactosyltransferase. Además, hibridación de dot blot determinó que 3 de 35 cepas probadas tenían las transferasas anormales presentes, igual 4 cepas caracterizadas como cepas de clase II por otro criterio. Estos datos indican que los genes de lbgAB pueden servir como un indicador de la clasificación de cepas de H. ducreyi.

Caracterización Del Sitio De Unión a ácido N-acetyl-5-neuramínico Del Receptor Soluto Extracitoplásmicos (SiaP) De No Tipificable Haemophilus Influenzae Cepa 2019

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2008  |  Pubmed ID: 17947229

Nontypeable Haemophilus influenzae es un patógeno humano oportunista causando otitis media en niños y la bronquitis crónica y neumonía en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La membrana externa de no tipificable H. influenzae está dominada por la lipooligosaccharides (LOS), muchos de los cuales incorporan ácido siálico como un azucarillo nonreducing terminal. Ácido siálico ha demostrado ser un factor importante en la supervivencia de las bacterias dentro del entorno de host. H. influenzae es incapaz de sintetizar ácido siálico y depende de la compactación de ácido siálico libre desde el entorno de host. Para lograr esto, H. influenzae utiliza un transportador periplasmic tripartito de ATP-independiente. En este estudio, caracterizamos el sitio de unión del receptor extracitoplásmicos soluto (SiaP) de la cepa de influenzae no tipificable H. 2019. Una estructura cristalina de ácido N-acetyl-5-neuramínico (Neu5Ac)-SiaP consolidado se determinó a 1.4A resolución. Caracterización termodinámica de Neu5Ac enlace muestra que esta interacción enthalpically se conduce con una sustancial contribución desfavorable de entropía. Se espera porque el atascamiento de SiaP a Neu5Ac está mediado por numerosos enlaces de hidrógeno y tiene varias moléculas de agua enterrada. Mutaciones puntuales dirigidas a aminoácidos específicos fueron introducidas en el sitio de Unión putativos. Complementación con las construcciones de siaP mutados resultó en total, parcial o no complementación, dependiendo de la función de residuos específicos. Análisis de espectrometría de masas de LOS O-desacilada de la mutación de punto R127K confirman la observación reducida incorporación de Neu5Ac en LOS. La disminución de la capacidad de H. influenzae a importación de ácido siálico tuvo efectos negativos sobre la resistencia a la matanza de complemento-mediada y viabilidad de biofilms in vitro, lo que confirma la importancia del transporte de ácido siálico a la bacteria.

Caracterización De Mutantes HtrB Y MsbB Del órgano Luminoso Simbionte Vibrio Fischeri

Applied and Environmental Microbiology. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18065606

Bacteriana lípido A es un mediador importante de las interacciones de la bacteria huésped, y secundario acylations HtrB y MsbB puede ser crítico para la colonización y virulencia en las infecciones por patógenos. Por el contrario, lípidos de Vibrio fischeri A estimula los procesos de desarrollo normales en host mutualistas de esta bacteria, scolopes Euprymna, aunque la importancia de los lípidos una estructura en esta simbiosis se desconoce. Para examinar más V. fischeri lípido A y su función simbiótica, se identificaron dos paralogs de htrB (señalado htrB1 y htrB2) y un gen de la msbB en V. fischeri ES114 y demostró que estos genes codifican aciltransferasas secundaria lípido A. htrB2 y msbB se encuentran en el cromosoma 1 de la "Limpieza" de Vibrio y se conservan en otras especies de Vibrio. Mutaciones en htrB2 y msbB no afecten negativamente a colonización simbiótica pero provocado alteraciones fenotípicas en la cultura, incluyendo había reducida movilidad y mayor luminiscencia. Estas mutaciones también afectaron la sensibilidad a la polimixina, consistente con los cambios en la permeabilidad de la membrana, dodecil sulfato de sodio y kanamicina. Por el contrario, htrB1 se encuentra en el cromosoma 2 del vibrio más pequeño, más variable, y un mutante de htrB1 fue salvaje-tipo-como en la cultura pero apareció atenuado en la iniciación de la simbiosis y competencia 2.7-fold durante la colonización, cuando se mezcla con el padre. Estos datos sugieren que htrB2 y msbB juegan papeles generales conservados en biología de vibrio, mientras htrB1 juega un papel más específicas de simbiosis en V. fischeri.

Acetilación Parcial De Residuos De Lisina Mejora Intraprotein Cross-linking

Analytical Chemistry. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18201069

Cross-linking intramolecular junto con espectrometría de masa identificación de aminoácidos reticulados es un método rápido para dilucidar las estructuras terciarias de la proteína de baja resolución o familias de doblez. Sin embargo, estudios previos de cross-linking en proteínas del modelo, como el citocromo c y ribonucleasa A, identifican con un número limitado de enlaces cruzados de péptido que está sesgado hacia algunos de los residuos de lisina potencialmente reactivos. Aquí, Divulgamos un acercamiento para mejorar la diversidad de proteínas intramolecular a partir de una cuantificación sistemática de la reactividad de los residuos de lisina de una proteína modelo del cross-linking, reactividades de lisina relativa bovina citocromo c. entre los 18 residuos de lisina del citocromo c se determinaron mediante la relación de grupos d0 y acetil-d3 en cada lisina después de acetilación parcial con acetato de sulfosuccinimidyl seguido de desnaturalización y acetilación cuantitativa de permanecer sin modificar lisinas con anhídrido acético-d6. Estos reactividades lisina entonces fueron comparadas con pKa teóricamente derivada y valores superficiales relativa accesibilidad solvente. Para determinar si n-acetilación parcial de los residuos de lisina más reactivos antes de cross-linking puede redirigir y aumentar el observable Lys-Lys aglutina, parcialmente acetilado bovina citocromo c reticulado con el reactivo específico de Amina, bis-funcional, bis (sulfosuccinimidyl) suberate. Después de la proteólisis y análisis de espectrometría de masas, acetilación parcial fue demostrada para incrementar significativamente el número de péptidos observables que contienen enlaces cruzados de Lys-Lys, cambiando el patrón de los residuos de lisina más reactivos a los menos reactivos. Más importante aún, estos péptidos reticulados adicionales contenían información novela de reticulación de Lys-Lys no visto en la proteína no-acetilado y fijó límites de distancia adicional que concordaban con la estructura cristalina y facilitaron la identificación del doblez de la proteína adecuada.

Un Sitio De Fosforilación De Serina Novela Detectado En El Dominio N-terminal Del Receptor De Estrógeno Aislado De Las Células De Cáncer De Mama Humano

Journal of the American Society for Mass Spectrometry. May, 2008  |  Pubmed ID: 18367407

Receptor de estrógeno activado (ERalpha) juega un papel fundamental en el desarrollo de cáncer de mama y es un blanco importante para el tratamiento de drogas. Fosforilación de la serina dentro del dominio N-terminal (NTD) contribuye a la activación de ERalpha y también puede causar resistencia a los medicamentos. Previa identificación bioquímica de residuos de ERalpha fosforilados se limitaba a proteína que artificial se sobreexpresa en líneas celulares transfected. Divulgamos métodos espectrometría de masa que han permitido la identificación de un nuevo sitio en la NTD de ERalpha aislado de las células de cáncer de mama humanas cultivadas. Inmunoprecipitación, digestión tripsina y análisis por nano-LC-ESI-MS/MS (Q-STAR, MDS Sciex) y vMALDI-MS(n) (LTQ Finnigan, Thermo Electron) identificado péptidos que contienen 8 de 14 residuos de serina en el NTD, uno de ellos parcialmente fosforila Ser-167, conocido pero no previamente reportados por MS. Chymotrypsin digestión reveló otros sitios conocidos en Ser-102/104/106 y 118. Tándem métodos desarrollados para el péptido que contiene el Ser-118 y el uso de experimentos basados en hipótesis--es decir, la suposición de que un fosfopéptidos intacta no mostrando ión molecular podrían producir iones fragmento incluyendo la pérdida de ácido fosfórico en vMALDI-MS/MS--permitida la identificación de un sitio nuevo en Ser-154. Cuantificación mediante el control de la reacción de las demostró aumentos 2.5-fold y seis en la fosforilación de la Ser-154 en células tratadas con estradiol y EGF, respectivamente, en comparación con controles, confirmados por immunoblotting con un anticuerpo policlonal de conejo novela. Así, el aislamiento de la proteína y MS estrategias descritas aquí pueden facilitar el descubrimiento de sitios de fosforilación novela dentro baja abundancia, clínicamente importante objetivos de cáncer como ERalpha y pueden contribuir a la comprensión del papel de la fosforilación en el desarrollo del cáncer de mama.

Mapeo Sistemático De Modificaciones Postraduccionales En Receptor De Estrógenos Humanos-alfa Con énfasis En Los Sitios De Fosforilación De Novela

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Mar, 2009  |  Pubmed ID: 18984578

Se divulga un estudio sistemático de modificaciones postraduccionales de los receptores de estrógeno, aislados de la línea de celular de cáncer de mama humanas MCF-7. Proteólisis con múltiples enzimas, espectrometría de masas y espectrometría de masas en tándem consigue cobertura muy alta de la secuencia de la proteína endógena de larga duración 66 kDa de cultivos celulares tratados con estradiol. Se identificaron nueve residuos de serina fosforilada, tres de los cuales fueron previamente no denunciado y ninguno de los cuales fueron observado previamente por espectrometría de masas por cualquier otro laboratorio. Dos residuos de serina modificado adicionales fueron identificados en proteína recombinante, uno divulgado previamente pero no observada aquí en la proteína endógena y la otra previamente desconocida. Aunque el mayor énfasis se colocaron en la identificación de nuevos sitios de fosforilación, pérdida del N-terminal de metionina acompañado por acetilación amino y una acetilación de cadena lateral lisina (o posiblemente trimetilación) también fueron detectados. El uso de HPLC-ESI tanto MALDI interconectado a diferentes analizadores de masas dieron mayor cobertura de la secuencia y había identificado más sitios que pudiera lograrse mediante cualquier método solo. El receptor del estrógeno es fundamental en el desarrollo y progresión del cáncer de mama. Uno no previamente declarada sitio de fosforilación identificado aquí mostró ser fuertemente dependiente de estradiol, confirmando su potencial importancia para el cáncer de mama. Mayor conocimiento de este conjunto de modificaciones postraduccionales de receptor de estrógeno, particularmente la fosforilación, aumentará nuestra comprensión de los procesos que conducen a estradiol inducida por la activación de esta proteína y puede ayudar en el desarrollo de estrategias terapéuticas para el manejo del cáncer de mama hormonodependiente.

IDPicker 2.0: Asamblea Proteína Mejorada Con Identificación De Péptidos De Alta Discriminación De Filtrado

Journal of Proteome Research. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19522537

Espectrometría de masas basados ​​en la proteómica escopeta se ha convertido en una tecnología generalizada para el análisis de mezclas complejas de proteínas. Una serie de algoritmos de búsqueda de base de datos han sido desarrollados para asignar secuencias de péptidos a los espectros de masas en tándem. Montaje de las identificaciones de péptidos de las proteínas, sin embargo, es un asunto difícil porque muchos péptidos son compartidos entre múltiples proteínas. IDPicker es una herramienta de proteínas de fuente abierta de la Asamblea que se deriva una lista mínimo de proteínas del péptido identificaciones filtrados a un falso descubrimiento tasa especificada. En este caso, nos ponemos al día IDPicker para aumentar las identificaciones seguras de péptidos mediante la combinación de resultados producidos por múltiples herramientas de búsqueda de bases de datos. Por segregar péptido identificaciones de umbralización utilizando tanto el estado de carga precursor y el número de terminales trípticos, IDPicker recupera más péptidos para el ensamblaje de proteínas. La nueva versión es más robusto frente a las proteínas de falsos positivos, especialmente en las búsquedas que utilizan bases de datos múltiples, exigiendo nuevos péptidos adicionales en el proceso de parsimonia. IDPicker ha sido diseñado para su incorporación a los flujos de trabajo de identificación de muchos por la adición de una interfaz gráfica de usuario y la capacidad de leer las identificaciones del formato pepXML. Estos avances IDPicker la posición de la discriminación y el conjunto de péptidos de alta proteína confiable en estudios a gran escala proteómica. El código fuente y los binarios para la versión más reciente de IDPicker están disponibles en http://fenchurch.mc.vanderbilt.edu/.

Multi-sitio De Evaluación De La Precisión Y La Reproducibilidad De Los Múltiples De Reacción a Base De Monitoreo-Las Mediciones De Proteínas En El Plasma

Nature Biotechnology. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19561596

La verificación de biomarcadores candidatos se basa en los ensayos cuantitativos específicos optimizados para la detección selectiva de las proteínas diana, y está cada vez más como un paso crítico en el descubrimiento de nuevas que el descubrimiento de biomarcadores puentes imparcial para la validación preclínica. A pesar de los distintos laboratorios han demostrado que la monitorización de reacción múltiple (MRM) acoplada a espectrometría de masas por dilución isotópica puede cuantificar biomarcadores candidatos de proteínas en el plasma, la reproducibilidad y la transferibilidad de estas pruebas entre los laboratorios no han sido demostrados. Se describe un estudio de varios laboratorios para evaluar la reproducibilidad, la recuperación, rango dinámico lineal y los límites de detección y cuantificación de MRM multiplexadas, a base de ensayos, llevados a cabo por el NCI CPTAC. El uso de materiales comunes y protocolos estandarizados, se demuestra que estos ensayos pueden ser altamente reproducible dentro y fuera de los laboratorios y plataformas de instrumentos, y son sensibles a bajas concentraciones de proteína taza / ml en plasma no fraccionada. Se aportan datos y puntos de referencia contra el cual los distintos laboratorios pueden comparar su desempeño y evaluar nuevas tecnologías para la verificación de biomarcadores en el plasma.

Calpain-1 Hiende Y Activa La Caspasa-7

The Journal of Biological Chemistry. Sep, 2009  |  Pubmed ID: 19617626

Caspase-7 es un verdugo caspase que desempeña un papel clave en la apoptosis, cáncer y un número de enfermedades neurodegenerativas. El mecanismo de activación de la caspasa-7 por granzyme B y caspasa-3 ha sido bien caracterizado. Sin embargo, no se sabe si otras proteasas como calpains activan o desactivar la caspasa-7. Aquí, presentamos eso recombinante caspasa-7 directamente es dividido por el calpain-1 dentro de la subunidad grande del caspase-7 para producir dos productos novedosos, la subunidad grande p18 y p17. Esta nueva forma de caspasa-7 tiene un aumento de seis en V(max) en comparación con la forma de p20/p12 previamente caracterizada. Zimografía reveló que el producto más pequeño caspasa-7 (p17) es /por más activo que el producto de caspasa-3-troceados (p20) o el mayor producto de calpain-1 de caspasa-7 (p18). Espectrometría de masas y mutagénesis sitio-dirigida identificados los sitios de escote de calpain dentro de la subunidad grande de caspasa-7 en el aminoácido 36 y 45/47. Estos eventos de proteólisis ocurren en vivo como se indica por la acumulación de caspasa-7 subunidades p18 y p17 en neuronas corticales que experimentan dysregulation de CA. Además, escote en el aminoácido 45/47 de caspasa-7 por calpain provoca una reducción en la localización nuclear en comparación con el producto de la caspasa-3 escote de caspasa-7 (p20). Nuestros estudios sugieren que la forma activada calpain de caspasa-7 tiene actividad enzimática única, localización y afinidad en comparación con la forma de caspasa activada.

Nitración Preferencial Aumentada De Alfa-sinucleína En Tirosina-39 En Un Modelo Celular Oxidativo De La Enfermedad De Parkinson

Analytical Chemistry. Sep, 2009  |  Pubmed ID: 19697948

Alfa-sinucleína es un componente importante de los cuerpos de Lewy, inclusiones de proteinacious que son un importante sello de la enfermedad de Parkinson (EP). Los cuerpos de Lewy contienen altos niveles de residuos de tirosina será determinado por anticuerpos específicos para 3-nitrotirosina (3NT) y a través de espectrometría de masas (MS). Hemos desarrollado una reacción múltiples monitoreo método de espectrometría de masas (MRM) para cuantificar sensiblemente los niveles de 3NT de residuos de tirosina específica alfa-sinucleína. Encontramos un aumento de 9-fold (en relación con los controles) en niveles de 3NT a Tyr-39 de alfa-sinucleína en una inducible transgénicos modelo celular de la enfermedad de Parkinson en que monoamino oxidasa B (MAO-B) se sobre expresa y que emula varias características de la nitración de PD. aumento de Tyr-39 en alfa-sinucleína endógeno mediante elevaciones en los niveles de MAO-B podría derogarse por la adición de deprenyl, un inhibidor específico de la MAO-B. Los niveles crecientes de 3NT fue selectivo para Tyr-39 como no aumentos significativos en los niveles de 3NT fueron detectados en otros residuos tirosina presentes en la proteína (Tyr-125, Tyr-133 y Tyr-136). Este es el primer informe de 3NT crecientes niveles de una tirosina específica en un modelo de PD y el primer uso de la espectrometría de masas de MRM cuantificar cambios en 3NT modificaciones en sitios específicos dentro de una proteína diana.

El Proteoma De Fagosoma Mycobacterium Bovis Bacille Calmette-Guerin

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Jan, 2010  |  Pubmed ID: 19815536

Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin (BCG) alteran la maduración de los fagosomas y residieran en un compartimiento que resiste la acidificación y la fusión con los lisosomas. Para definir la composición molecular de este compartimiento, se desarrolló un nuevo método para la obtención de fagosomas altamente purificadas de macrófagos humanos infectados con BCG y analizaron los fagosomas immunoblotting occidental y proteómica basadas en espectrometría de masa. Nuestro procedimiento de purificación reveló que BCG cultivado en un medio artificial llega a ser menos denso después de crecimiento en los macrófagos. Por immunoblotting occidental, LAMP-2, proteína de Niemann-Pick C1 y sintaxina 3 eran fácilmente perceptibles en el fagosoma BCG pero a niveles que eran más bajos que en el fagosoma látex grano; flotillin-1 y la ATPasa vacuolar eran apenas perceptibles en el fagosoma BCG pero altamente enriquecieron en el fagosoma látex grano. Estudios de inmunofluorescencia confirmaron la escasez de flotillin en los fagosomas de BCG y demostraron una correlación inversa entre la actividad metabólica bacteriana y flotillin en los fagosomas de M. tuberculosis. Por espectrometría de masa, 447 proteínas del huésped humano fueron identificadas en los fagosomas de BCG, y se identificó un conjunto parcialmente superpuesto de 289 proteínas humanas en fagosomas látex grano. Curiosamente, la mayoría de las proteínas identificadas constantemente sobre los preparativos de fagosoma BCG fueron identificada también en fagosomas látex grano, indicando un alto grado de coincidencia en la composición de estos dos compartimientos. Es probable que muchas diferencias en la composición de la proteína son cuantitativos que cualitativos en la naturaleza. A pesar de la notable coincidencia en composición proteica, constantemente se identificaron una serie de proteínas en los fagosomas de BCG que no fueron identificados en cualquiera de nuestros preparados de fagosoma látex grano, incluyendo las proteínas implicadas en el tráfico de membrana y transducción de la señal, tales como proteína Ras GTPasa-activar-como IQGAP1 y proteínas de función desconocida, como FAM3C. Nuestro procedimiento de purificación del fagosoma y análisis inicial de la proteómica prepararon el terreno para un análisis comparativo cuantitativo de micobacterias y látex grano fagosoma proteomas.

Métricas De Rendimiento Para Los Sistemas De Líquidos En Tándem Cromatografía-espectrometría De Masas En El Análisis De Proteómica

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19837981

Una gran necesidad no satisfecha en el análisis de proteómica LC-MS/MS-based es un conjunto de herramientas para la evaluación cuantitativa del rendimiento del sistema y la evaluación de la variabilidad técnica. Aquí se describen 46 indicadores de desempeño del sistema para monitorear el desempeño cromatográfico, la estabilidad fuente de electrospray, MS1 y MS2 señales, el muestreo dinámico de iones de MS / MS, y la identificación de péptidos. Aplicado a los conjuntos de datos de los análisis LC-MS/MS repetidas, estas cifras muestran respuestas coherentes y razonables a las perturbaciones controladas. Las métricas típicamente muestran variaciones menos de 10% y por lo tanto puede revelar diferencias incluso sutiles en el rendimiento de los componentes del sistema. Los análisis de los datos de los estudios interlaboratorios realizadas en el marco de un procedimiento operativo estándar común identificar los datos atípicos y proporcionó pistas sobre las causas específicas. Por otra parte, la variación entre laboratorios se refleja en los indicadores indica que los componentes del sistema varían más entre los laboratorios. La aplicación de estos indicadores permite la evaluación racional, de calidad cuantitativa de la proteómica y la LC-MS/MS otras aplicaciones analíticas.

Estudio Interlaboratorios Caracterización De La Norma De Desempeño Levadura De Rendimiento De La Plataforma De Evaluación Comparativa De LC-MS

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19858499

El rendimiento óptimo de las plataformas de LC-MS/MS es fundamental para generar altos de calidad de datos proteómicos. A pesar de los distintos laboratorios han desarrollado muestras de control de calidad, no hay ninguna norma de rendimiento ampliamente a disposición de la complejidad biológica (y los conjuntos de datos de referencia) para la evaluación comparativa del rendimiento de la plataforma para el análisis de proteomas complejos biológicos a través de los diferentes laboratorios de la comunidad. Preparaciones individuales de la levadura Saccharomyces cerevisiae proteoma han sido ampliamente utilizados por los laboratorios de la comunidad de la proteómica para caracterizar LC-MS rendimiento de la plataforma. El proteoma de levadura es un atractivo singular como un estándar de rendimiento, ya que es el más ampliamente caracterizado proteoma complejo biológico y el único asociado con varios estudios a gran escala de estimación de la abundancia de todas las proteínas detectables. En este estudio, se describe un protocolo de funcionamiento estándar para la producción a gran escala de la norma de desempeño de la levadura y las alícuotas ofrecer a la comunidad a través del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología en el proteoma de levadura se encuentra en desarrollo como un material de referencia certificado para satisfacer a largo plazo necesidades de la comunidad. Utilizando una serie de indicadores que caracterizan el desempeño de LC-MS, ofrecemos un conjunto de datos de referencia establecidos que demuestra el rendimiento típico de plataformas de uso común del instrumento de trampa de iones en laboratorios especializados, los resultados proporcionan una base para que los laboratorios de referencia de su propio desempeño, para mejorar los métodos actuales , y para evaluar las nuevas tecnologías. Además, se demuestra cómo la referencia levadura, enriquecida con proteínas humanas, se puede utilizar para comparar la potencia de las plataformas de proteómica para la detección de proteínas expresadas diferencialmente en los diferentes niveles de concentración en una matriz compleja, proporcionando así una métrica para evaluar y minimizar pre- variación analítica y analítica en los experimentos de proteómica comparativa.

La Repetibilidad Y La Reproducibilidad En Las Identificaciones Proteómico Por Cromatografía Líquido-espectrometría De Masas En Tándem

Journal of Proteome Research. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19921851

La complejidad de la instrumentación de proteómica para la LC-MS/MS presenta muchas posibles fuentes de variabilidad. Dependiente de los datos de muestreo de péptidos constituye un elemento estocástico en el centro de la proteómica descubrimiento. Aunque esta variación afecta a la identificación de los péptidos, las identificaciones proteómicos están lejos de ser completamente al azar. En este estudio, analizamos los conjuntos de datos entre laboratorios del Instituto Nacional del Cáncer Clínica de Evaluación de Tecnologías para el cáncer de Proteómica para examinar la repetibilidad y la reproducibilidad en péptidos y las identificaciones de proteínas. Los datos incluidos abarcó 144 experimentos LC-MS/MS en cuatro Thermo LTQ Orbitrap y cuatro instrumentos. Las muestras incluyeron lisado de levadura, el NCI-20 se define el rango dinámico de mezcla de proteínas, y el SAI Sigma una mezcla definida de proteínas equimolar. Algunos de nuestros hallazgos reforzado sabiduría convencional, tal como repetibilidad y reproducibilidad siendo mayor para las proteínas que para péptidos. La mayoría de las lecciones de los datos, sin embargo, eran más sutiles. Orbitraps demostrado ser capaz de una mayor repetibilidad y la reproducibilidad, pero el rendimiento aberrante de vez en cuando borrar esas ganancias. Incluso los más simples las digestiones de proteínas dado más iones de péptidos que LC-MS/MS pudo identificar en un solo experimento. Hemos observado que las listas de péptidos a partir de pares de repeticiones técnica solapado por 35-60%, dando un rango para el péptido a nivel de repetición en estos experimentos. Complejidad de muestra no parece afectar a la repetibilidad de identificación de péptidos, aún cuando el número de espectros identificado cambiado por un orden de magnitud. El análisis estadístico de los recuentos de las proteínas del espectro reveló una mayor estabilidad a través de repeticiones técnica de Orbitraps, haciéndolas superiores a los instrumentos LTQ para el descubrimiento de biomarcadores candidatos. Los péptidos más repetibles eran los correspondientes a los sitios de escisión convencionales trípticos, aquellas que producen intensas señales MS, y aquellos que resultan de las proteínas que generan muchos péptidos distintos. Reproducibilidad entre diferentes instrumentos del mismo tipo rezagado repetibilidad de técnicos repeticiones en un solo instrumento por varios puntos porcentuales. Estos resultados refuerzan la importancia de evaluar la repetibilidad como una característica fundamental de las tecnologías de análisis.

La Edulcoración De La Mezcla: Adición De Glucosilación De La Ecuación De Descubrimiento De Biomarcadores

Clinical Chemistry. Feb, 2010  |  Pubmed ID: 19959616

El cáncer tiene profundos efectos en la expresión de genes, incluida la maquinaria de glicosilación de una célula. Por lo tanto, los tumores producen glicoproteínas que llevan oligosacáridos con estructuras que son muy diferentes de la misma proteína producida por una célula normal. Una sola proteína puede tener muchos sitios de glicosilación que grandemente amplificar las señales que generan en comparación con espinas dorsales de sus proteínas.

Utilizando La Ruta De Biosíntesis O Antígeno Lipopolisacárido En Escherichia Coli Para Interrogar a La Especificidad De Sustrato De Genes Exógenos Glicosiltransferasa En Un Enfoque Combinatorio

Glycobiology. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20208062

En trabajos anteriores, nuestro laboratorio generó novela quiméricas lipopolisacáridos (LPS) en Escherichia coli transformadas con un plásmido que contiene genes de síntesis de lipooligosaccharide exógeno (lsg) de Haemophilus influenzae. Análisis de estas quimeras novela oligosacárido-LPS permitió la caracterización de las estructuras de hidratos de carbono generados por varios genes putativos glicosiltransferasa en el locus de lsg. Aquí, adaptamos esta estrategia para construir un enfoque modular para estudiar las propiedades sintéticas de glicosiltransferasas individual expresado solo y en combinaciones. Para ello, un conjunto de expresión vectores con genes de glicosiltransferasa putativos de uno a cuatro desde el locus lsg, lsgC-F, se transformaron en e. coli K12 (XL-1) que es defectuoso en la biosíntesis de LPS O antígeno. Esta estrategia se basó en la inclusión de la H. influenzae gene producto lsgG en cada construcción de plásmido, que rescata parcialmente el defecto de biosíntesis de LPS de E. coli por cebado Uridina difosfato-undecaprenyl en el camino de WecA-dependiente O antígeno sintético con n-acetil-glucosamina (GlcNAc). Este GlcNAc-undecaprenyl luego sirvió como un sustrato aceptor para más extensión de carbohidratos por glicosiltransferasas transformada. Los glicanos quiméricos LPS-ligado resultantes fueron aislados de sus construcciones de e. coli y caracterizan por espectrometría de masas, análisis de metilación y enzyme-linked immunosorbent assays. Estos datos estructurales permitieron la especificidad de varios glicosiltransferasas asignarse inequívocamente a genes individuales. LsgF fue encontrado para transferir una galactosa (Gal) para terminal GlcNAc. LsgE fue encontrado para transferir GlcNAc a Gal-GlcNAc, y tanto LsgF como LsgD se encontraron para transferir Gal GlcNAc-Gal-GlcNAc pero con diferentes especificidades de acoplamiento. Este método puede ser generalizado y fácilmente adaptado para estudiar la especificidad de sustrato de otras glicosiltransferasas putativos o desacostumbrado.

Cuantificación Específica De Oxidación De Cisteína Site-specific En Proteínas Endógenas Usando Una Alquilación Diferencial Y Seguimiento De Enfoque De Espectrometría De Masas De La Reacción Múltiples

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20233844

Especies de oxígeno reactivo (ROS) son ambos intermediarios fisiológicos en la señalización celular y mediadores del estrés oxidativo. La sensibilidad del redox de proteínas específicas de cisteína puede arrojar luz sobre cómo se regulan los ROS y función, pero baja sensibilidad ha limitado la cuantificación del estado redox de muchos reguladores celulares fundamentales en un contexto celular. Aquí describimos un enfoque de análisis altamente sensible y reproducible la oxidación (OxMRM) que combina múltiples reacción monitoreo de espectrometría de masas que se puede aplicar de manera específica a prácticamente cualquier cisteína o proteína, diferencial alquilación con isótopos estables y purificación de proteínas. Usando esta aproximación, cuantifica el estado de oxidación de cisteína site-specific de endógena p53 por primera vez y encontró que Cys182 en la interfaz de dimerización del dominio de unión de ADN es particularmente susceptible a la oxidación de la diamida intracelular. OxMRM permite realizar análisis de sulfinic y los niveles de oxidación de ácido sulfónico, que validamos mediante la evaluación de la oxidación de la Cys215 catalítica de la proteína tirosina fosfatasa-1B en numerosas condiciones oxidantes. OxMRM también complementa los estudios de descubrimiento de proteómica redox imparcial como una herramienta de verificación a través de su alta sensibilidad, exactitud, precisión y rendimiento.

Trata De ErbB2 Y Degradación Asociada Poliubiquitinación K48 Y K63

Cancer Research. May, 2010  |  Pubmed ID: 20406983

El receptor ErbB2/HER2 sobreexpresado es un objetivo de cáncer clínicamente validado cuyos mecanismos de internacionalización y localización superficiales siendo mal entendidos. Downregulation del receptor ErbB2 sobreexpresada 185 kDa es rápidamente (2-6 horas) inducida por la HSP90 chaperone inhibidor geldanamicina (GA), mientras que su regulación a la baja y la degradación lisosomal son más lentamente (24 horas) inducidas por el inhibidor de la proteasoma bortezomib/PS341. En las células tratadas con PS341 SK-BR-3, se sobreexpresa ErbB2 coprecipitates con la ligasa de ubiquitina E3 c-Cbl y también con la enzima deubiquitinating USP9x; por otra parte, siRNA downregulation de USP9x mejora downregulation ErbB2 inducida por PS341. Porque poliubiquitina enlaces desde lisina 48 (K48) o 63 (K63) pueden diferencialmente las proteínas de la dirección de degradación proteasomal de 26S o endosome trata al lisosoma, reacción múltiple (MRM) de seguimiento / espectrometría de masas (MS) y anticuerpos específicos para acoplamiento de poliubiquitina fueron utilizados para realizar un seguimiento cuantitativo K48-K63 vinculados y ErbB2 poliubiquitinación después del tratamiento GA o PS341 de células SK-BR-3. MRM/MS reveló que a diferencia del rápido, modesto (4 veces a ocho veces), y la inducción de GA síncrona de K48 y K63 polyubiquitinated ErbB2, PS341 produce un dramático (solucíon a 40-fold) incremento secuencial polyubiquitinated ErbB2 consistente con K48 poliubiquitinación seguido editando K63. Imágenes microscópicas de fluorescencia confirmaron que PS341, pero no GA, induce la colocalización de K48-ligado y poliubiquitina K63-ligado con perinuclear lisosoma-secuestrado ErbB2. Así, sobreexpresión superficie ErbB2 y reciclaje parecen depender su poliubiquitinación y deubiquitination; así, los efectos contrastantes de PS341 y GA en localización de receptor ErbB2, poliubiquitinación y degradación punto alternativo citoplásmico trata probablemente regulado por diferente poliubiquitina K48 y K63 edición mecanismos.

Identificación, Caracterización Y La Inmunogenicidad De Un Polisacárido Capsular O Antígeno De Francisella Tularensis

PloS One. 2010  |  Pubmed ID: 20625403

Polisacáridos capsulares son factores importantes en la patogenia bacteriana y han sido objeto de una serie de vacunas exitosas. Francisella tularensis se ha considerado para expresar un antígeno capsular pero ninguno ha sido aislado o caracterizado. Hemos desarrollado un anticuerpo monoclonal, 11B7, que reconoce el polisacárido capsular de f el. tularensis migrar en Western blot como una banda difusa entre 100 kDa y 250 kDa. La cápsula manchas mal en SDS-PAGE con plata pero puede visualizarse mediante tinción de glicoproteína ProQ Esmeralda. La cápsula parece ser altamente conservadas entre cepas de F. tularensis como anticuerpo 11B7 había ligada a la cápsula de 14 de 14 F. tularensis tipo A y B cepas en Western blot. El material capsular se puede aislar esencialmente libre de LPS, es fenol y proteinasa precipitable K resistente, etanol y no disociar en dodecil sulfato de sodio. La microscopia de immunoelectron con oro coloidal demuestra 11B7 circunferencial coloración de la superficie de la F. tularensis que es típico de una cápsula de polisacárido. Espectrometría de masas, análisis composicional y RMN indican que la cápsula está compuesta por un polímero de la repetición tetrasacárido, 4) - alfa - D - GalNAcAN-(1-> 4) - alfa - D - GalNAcAN-(1-> 3) - beta - D - QuiNAc-(1-> 2) - beta - D - Qui4NFm-(1-, que es idéntica a la descrita F. tularensis subunidad O antígeno. Esto indica que la cápsula de F. tularensis puede clasificarse como un polisacárido capsular O antígeno. Nuestros estudios indican que la F. tularensis glicosiltransferasa mutantes de antígeno O no hacen una cápsula. Una F. tularensis aciltransferasa y un mutante de polimerasa O antígeno no tenían ninguna evidencia de un antígeno O pero expresaron un antígeno capsular. La inmunización pasiva de ratones BALB/c con 75 microg de 11B7 protegidos contra un 150 doble desafío letal de F. tularensis LVS. La inmunización activa de ratones BALB/c con 10 microg de cápsula demostró un nivel de protección similar. Estos estudios demuestran que la F. tularensis produce una cápsula O antígeno que puede ser la base de una futura vacuna.

Identificación De Moduladores Nuevos Y Alteraciones De La Proteína En No-apoptotic Había Programada Muerte Celular

Journal of Cellular Biochemistry. Dec, 2010  |  Pubmed ID: 20830744

Este estudio describe el primer análisis proteómico de miembros--una forma de no-apoptotic de muerte celular programada. Como con la apoptosis, la primera descripción de miembros se basó en criterios morfológicos. Puesto que no hay ningún marcadores conocidos para miembros, el propósito de este estudio fue disecar los cambios en el perfil de proteoma durante miembros. Utilizando una y dos dimensiones SDS-PAGE, Western análisis y espectrometría de masas, demostramos que durante miembros, alteraciones ocurren principalmente en las proteínas citoesqueléticas, proteínas de transducción de señal, proteínas mitocondriales y algunas proteínas metabólicas. También divulgamos la identificación de: (1) un inhibidor de miembros, proteína de unión de fosfatidiletanolamina (PEBP-1) y (2) un mediador candidato de miembros, prohibitin. Identificación de cambios específicos paraptotic en última instancia conduce a herramientas para detectar este tipo de muerte celular programada en sistemas in vivo y permitir su posterior caracterización.

Cuantitativa Mapeo Del Complejo Mitocondrial Reversible I Oxidación De Cisteína En Un Modelo De Ratón De La Enfermedad De Parkinson

The Journal of Biological Chemistry. Mar, 2011  |  Pubmed ID: 21196577

Oxidación de cisteína diferencial complejo mitocondrial se ha cuantificado en un modelo de estrés oxidativo en vivo de la enfermedad de Parkinson. Hemos desarrollado una estrategia que incorpora purificación de inmunoafinidad rápido y eficaz del complejo he seguido por alquilación diferencial y detección cuantitativa, utilizando técnicas de espectrometría de masas sensibles. Este método permite cuantificar el estado de oxidación de cisteína reversible de residuos de cisteína distintas 34 de un total de 130 presentes en murino complejo I. seis complejos I para mostrar un aumento en la oxidación en relación con los controles en los cerebros de ratones sometidos a depleción del glutatión en vivo se encontraron residuos de cisteína. Tres de estos residuos se encontraron a residir dentro de hierro-azufre grupos del complejo I, sugiriendo que su estado redox puede afectar la función de transporte de electrones.

El Lípido A Del Lipopolisacárido De Vibrio Fischeri: Una Estructura única Con Una Molécula De Phosphoglycerol

The Journal of Biological Chemistry. Jun, 2011  |  Pubmed ID: 21498521

Vibrio fischeri, una bacteria Marina bioluminiscente, existe en una relación simbiótica exclusiva con el calamar de bobtail hawaiano, scolopes Euprymna, cuyo órgano luminoso coloniza. Previamente, se ha demostrado que el lipopolisacárido (LPS) o lípidos gratis A de V. fischeri pueden desencadenar cambios morfológicos en órgano luminoso del calamar de la juvenil que se producen sobre la colonización. Para investigar las características estructurales que podrían ser responsables de este fenómeno, el lípido A de V. fischeri ES114 LPS fue aislado y caracterizado por espectrometría de masa gradual (MS(n)). Una mezcla de microheterogeneous de mono - y diphosphorylated diglucosamine disacáridos observó con Estados variables de acilación desde tetra - formas de octaacylated. Todas las especies de lípido A, sin embargo, contienen un conjunto de cadenas de conservado acil primario que consiste en una C14:0(3-OH) N-ligado a la posición 2, un inusual C14:1(3-OH) N-ligado en la posición 2' y dos ácidos grasos C12:0(3-OH) O-ligado a la 3 y 3'-posiciones. Los ácidos grasos encontrados en la Acilación de la secundaria fueron considerablemente más variable, con un C12: 0 o C16: 1 en la posición 2, C14: 0 o C14:0(3-OH) en la 2'-posición y C12: 0 o ningún sustituto en la posición 3'. Más sorprendente fue la presencia de un inusual conjunto de modificaciones en el sitio de la Acilación de la secundaria de la posición 3 de phosphoglycerol (GroP), ácido lisofosfatídico (GroP cojinete C12: 0, C16: 0 y C16: 1) o ácido fosfatídico (GroP teniendo C16: 0 + C12: 0 o C16: 0 + C16: 1). Dada su naturaleza inusual, es posible que estas características de los lípidos de fischeri V. A pueden subyacer a la capacidad de reconocer a su socio simbiótico de E. scolopes.

Segura De Identificación De Modificaciones De 3-nitrotirosina En Masa Espectrales Datos En Múltiples Plataformas De Espectrometría De Masas

Journal of Proteomics. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21514405

3-nitrotirosina (3NT) es una modificación postraduccional oxidativo asociado con muchas enfermedades. Determinar los sitios específicos de esta modificación, sigue siendo un desafío debido a la baja estequiometría de 3NT modificaciones en muestras biológicas. Basadas en espectrometría de masas proteómica es una poderosa herramienta para identificar 3NT modificaciones, sin embargo, varios informes de identificación de sitios 3NT más tarde fueron demostrados ser incorrecto, destacando que la precisión y la eficacia de estos flujos de trabajo requieren mejoras. Para hacer avanzar nuestra comprensión de las propiedades cromatográficas y espectrales de péptidos que contienen 3NT hemos adaptado un procedimiento sencillo y reproducible para generar una gran cantidad de péptidos 3NT por nitración química de una mezcla de 48 proteína definida, comercialmente disponible. Usando dos plataformas complementarias de LC-MS/MS, un QTOF (QSTAR Elite) y el espectrómetro de masas de trampa de iones de presión dual (LTQ Velos), se detectaron más de 200 validado péptidos que contienen 3NT con traslapo significativo en los péptidos detectados por ambos sistemas. Investigamos las propiedades de LC-MS/MS para cada péptido manualmente utilizando criterios definidos y luego evaluar su utilidad para confirmar que el péptido se 3NT modificado. Este amplio conjunto de péptidos que contienen 3NT validados puede ser utilizado para optimizar la instrumentación de espectrometría de masa y estrategias de la minería de datos o desarrollar estrategias de enriquecimiento 3NT péptido para esta modificación postraduccional biológicamente importante, oxidativa.

N-acylethanolamine Señalización Interviene El Efecto De La Dieta Sobre La Vida útil En Caenorhabditis Elegans

Nature. May, 2011  |  Pubmed ID: 21562563

Restricción dietética es un medio sólido de extender la vida adulta y posponer la enfermedad relacionada con la edad en muchas especies, incluyendo levaduras, gusanos nematodos, moscas y roedores. Estudios de las necesidades genéticas de extensión de vida útil por restricción dietética en el nematodo Caenorhabditis elegans han implicado a una serie de moléculas claves en este proceso, incluida la meta de detección de nutrientes de la vía de la rapamicina (TOR) y el factor de transcripción de Foxa PHA-4 (Ref. 7). Sin embargo, poco se sabe sobre las señales metabólicas que coordinan la respuesta del organismo a la restricción dietética y mantienen la homeostasis cuando los nutrientes son limitados. El sistema endocannabinoide es un excelente candidato para esa función dada su participación en la regulación del balance de energía y consumo de nutrientes. A pesar de esto, un papel directo para endocannabinoide en dietética determinación de restricción o vida útil aún tiene que demostrarse, en parte debido a la aparente ausencia de endocannabinoide vías en organismos modelo que son susceptibles al análisis de la vida útil de señalización. N-acylethanolamines (NAEs) son lípidos derivados señalización moléculas, que incluyen los mamíferos endocannabinoide arachidonoyl etanolamida. Aquí identificamos NAEs en C. elegans, que se reduce la abundancia NAE bajo restricción dietética y que la deficiencia de la NAE es suficiente para extender la vida útil a través de un mecanismo de restricción dietética que requieren PHA-4. Por el contrario, la suplementación dietética con el nematodo NAE eicosapentaenoyl etanolamida no sólo inhibe la extensión de vida útil inducida por restricción dietética en gusanos del tipo salvaje, sino que también suprime la extensión de vida útil en un mutante de vía TOR. Esto demuestra un papel para la señalización de NAE en envejecimiento e indica que NAEs representan una señal de que coordina nutrimental con cambios metabólicos que en última instancia determinan la vida útil.

Espectrometría De Masa Identificación De Sitios De Acetilación De Novela De La Lisina En La Huntingtina

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 21685499

Huntingtina (Htt) es una proteína con un tramo de poliglutaminas en el extremo N-terminal y ampliación del tramo poliglutaminas causa la enfermedad de Huntington (EH). HTT es una proteína de dominio múltiples cuya función no ha sido bien caracterizada. Informes anteriores han demostrado, sin embargo, que las modificaciones post-traduccionales de Htt como fosforilación y acetilación modulan toxicidad de Htt mutante, localización y tráfico vesicular. Acetilación de la lisina de Htt es de particular importancia en HD como esta modificación regula la toxicidad y la progresión de la enfermedad. Tratamiento de modelos de ratón con inhibidores de histona deacetilasa mejora HD-como síntomas y alteraciones en la acetilación de Htt promueve la separación de la proteína. Dada la importancia de acetilación en HD y otras enfermedades, nos centramos en la identificación sistemática de sitios de acetilación de lisina en Htt23Q (1-612) en un modelo de cultura de célula mediante espectrometría de masas. MYC-con la etiqueta Htt23Q (1-612) sobreexpresa en la línea de células HEK 293T fue immunoprecipitated, separados por SDS-PAGE, digerido y sometidos a análisis de MS de tándem de cromatografía líquida de alto rendimiento. Se identificaron cinco sitios de acetilación de lisina, incluyendo novela tres sitios Lys-178, Lys-236, Lys-345 y dos sitios previamente descritos Lys-9 y Lys-444. Anticuerpos específicos a tres de los sitios de acetilación de Htt fueron producidos y confirmaron los sitios de acetilación en Htt. Un análisis múltiple de MS vigilancia reacción fue desarrollado para comparar cuantitativamente el nivel de acetilación de Lys-178 entre Htt23Q de tipo salvaje y mutante Htt148Q (1-612). Este informe representa el primer mapeo integral de sitios de acetilación de lisina en la región N-terminal de Htt.

Extensión De La Vida Span Través De La Inhibición EIF4G Está Mediado Por La Remodelación Postranscripcional De La Expresión Génica Respuesta Al Estrés En C. Elegans

Cell Metabolism. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21723504

La reducción de la síntesis de proteínas frena el crecimiento y desarrollo, pero puede aumentar la duración de la vida adulta. Se demuestra que la caída de 4G factor de iniciación de la traducción eucariótica (eIF4G), que es downregulated durante la hambruna y el estado dauer, los resultados de la traducción diferencial de genes importantes para el crecimiento y la longevidad en C. elegans. Genoma toda la traducción del mRNA análisis mostró que la inhibición del estado de IFG-1, el C. elegans ortholog de eIF4G, resulta en un aumento relativo de la carga ribosómico y traducción de los genes de respuesta al estrés. Algunos de estos genes son necesarios para la extensión de la vida lapso cuando IFG-1 se inhibe. Además, la carga mejorada ribosomal de ARNm determinados sobre IFG-1 inhibición se correlacionó con una longitud mayor ARNm. Esta asociación fue apoyada por los cambios en el proteoma analizaron a través de espectrometría de masas cuantitativa. Nuestros resultados sugieren que IFG-1 media los efectos antagonistas sobre el crecimiento y mantenimiento somático mediante la regulación de la traducción del ARNm de mRNAs particulares basa, en parte, de la longitud de la transcripción.

¿Control Reglamentario O Daño Oxidativo? Enfoques Proteómicos Para Cuestionar El Papel Del Estado De Oxidación De Cisteína En Procesos Biológicos

Molecular & Cellular Proteomics : MCP. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22159599

La oxidación es una espada de doble filo para los procesos celulares y su papel en la fisiología normal, restos de cáncer y envejecimiento entendían sólo parcialmente. Aunque el estrés oxidativo puede interrumpir la función biológica, las reacciones de oxidación-reducción (redox) en una celda son a menudo bien reglamentadas y desempeñan funciones fisiológicas esenciales. Cisteínas mienten en la interfase entre estos extremos, ya que las propiedades químicas que hacen específicos tioles exquisitamente sensible a redox también predisponen al daño oxidativo por especies reactivas de oxígeno o de nitrógeno durante el estrés. Así, estas modificaciones pueden ser ya sea bajo control regulador redox reversible o, alternativamente, un resultado del daño oxidativo reversible o irreversible. En cualquier caso, se ha vuelto cada vez más importante evaluar el estado redox de tioles de proteína ya que estas modificaciones afectan a menudo procesos tales como la actividad catalítica, alteraciones conformacionales o enlace metálico. Para comprender mejor los cambios redox que acompañan a residuos de cisteína de proteína en sistemas biológicos complejos, nuevos enfoques experimentales se han desarrollado para identificar y caracterizar tiol específicas modificaciones y/o cambios en su estado general de redox. En esta revisión, se describen las tecnologías recientes en proteómica redox que ha empujado los límites de detección y cuantificación de modificaciones de cisteína redox en un contexto celular. Aunque no existe ninguna solución analítica sin distinciones, destacamos la justificación, las fortalezas y limitaciones de cada tecnología para poder aplicarlos eficazmente a cuestiones biológicas específicas. Varias limitaciones tecnológicas aún permanecen sin resolver, sin embargo, estos enfoques y desarrollos futuros desempeñan un papel importante hacia la comprensión de la interacción entre el estrés oxidativo y redox señalización en salud y enfermedad.

Un Flujo De Trabajo De Afinidad De Lectina Orientación Glycosite Específicos, Relacionados Con El Cáncer Estructuras De Carbohidratos En La Tripsina Digerido Con Plasma Humano

Analytical Biochemistry. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20705048

Los glicanos son las células específicas del tipo de proteína, modificaciones postraduccionales que se modulan en los procesos de desarrollo y de la enfermedad. Como tal, glicoproteínas son candidatos atractivos biomarcadores. A continuación, describimos una espectrometría de masas basado en flujo de trabajo que incorpora la cromatografía de afinidad de lectina para enriquecer las proteínas que transportan determinadas estructuras de glicano. A medida que aumenta en sialilación y fucosilación destacan entre asociados al cáncer modificaciones, nos centramos en Sambucus nigra aglutinina (SNA) y la lectina Aleuria aurantia (AAL), lectinas que se unen con ácido siálico y las estructuras de fucosa que contienen, respectivamente. Glicopéptidos fucosilados y sialilada de lactoferrina humana sirvieron como controles positivos, y alto contenido en manosa estructuras de invertasa de levadura sirvieron como controles negativos. Las normas se disparó en múltiples sistemas de eliminación de afinidad (MARS) de 14 empobrecido, digerido con tripsina plasma humano de donantes sanos. Las muestras se cargaron en columnas de lectina, separados por HPLC en flujo continuo y fracciones enlazados, y tratados con el péptido N-glicosidasa F para eliminar N-glicanos ligados. Las fracciones peptídicas desglicosiladas fueron interrogados por HPLC-MS/MS ESI. Se identificaron un total de 122 glicoproteínas del plasma humano que contienen 247 glycosites únicas. Es importante destacar que varias de las glicoproteínas observados (por ejemplo, cadherina 5 y neutrófilos lipocalina gelatinasa asociada) normalmente circulan en el plasma a baja nanogramos por mililitro niveles. En conjunto, estos resultados proporcionan la espectrometría de masas basada en la evidencia de la utilidad de la incorporación de la separación lectina-plataformas en las tuberías descubrimiento de biomarcadores de cáncer.

Los Hidratos De Carbono Y El Antígeno O-Core De Vibrio Fischeri Lipopolisacárido: Composición Y Análisis De Su Papel En La Colonización De órganos Euprymna Scolopes Luz

The Journal of Biological Chemistry. Jan, 2012  |  Pubmed ID: 22247546

Vibrio fischeri existe en una relación simbiótica con el hawaiano de calamar bobtail, Euprymna scolopes, donde el calamar proporciona un hogar para las bacterias y las bacterias, a su vez proporcionan el camuflaje que ayuda a proteger el calamar de los depredadores nocturnos. Al igual que otros organismos Gram-negativos, V. fischeri expresa lipopolisacárido (LPS) en su superficie celular. La estructura del antígeno-O, y los componentes básicos de los LPS y su posible papel en la colonización de los calamares no han sido previamente determinado. En estos estudios, un antígeno O-ligasa mutante, Waal, se utilizó para determinar las estructuras de estos componentes LPS y su papel en la colonización de los calamares. Waal productos ligados al antígeno O-al núcleo del LPS, por lo que LPS de mutantes Waal carecen de antígeno O-. Nuestros resultados muestran que la V. fischeri waal mutante tiene un defecto de la motilidad, se retrasa significativamente en la colonización, y es incapaz de competir con la cepa de tipo salvaje en los ensayos de colonización cooperación. Análisis comparativo de los LPS de las cepas de tipo salvaje y el Waal mostró que la V. fischeri LPS tiene un único antígeno O-repetición compuesto de yersiniose, ácido 8-epi-legionaminic y N acetylfucosamine. Además, los LPS de la cepa waal mostró que la estructura del núcleo consta de L-glicero-D-mano-heptosa, D-glicero-D-mano-heptosa, glucosa, 3-desoxi-D-mano-octulosonic ácido (KDO ), N-acetilgalactosamina, ácido 8-epi-legionaminic, fosfato y fosfoetanolamina. Estos estudios indican que las inusuales V. fischeri antígeno O-azúcares juegan un papel en las primeras fases de la colonización bacteriana del calamar.

Análisis Proteómico De Cambios Depende De La Edad En La Solubilidad De La Proteína Identifican Genes Que Modulan La Vida útil

Aging Cell. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22103665

Mientras que generalmente se reconoce que el mal plegamiento de proteínas específicas puede causar enfermedad de aparición tardía, la contribución de la agregación de la proteína al proceso de envejecimiento normal se entiende menos. Para tratar este tema, se realizó un análisis de espectrometría de masa basada en proteómica para identificar proteínas que adoptan dodecil sulfato de sodio (SDS)-conformaciones insolubles durante el envejecimiento en Caenorhabditis elegans. Proteínas SDS-insoluble extraídas de joven y de C. elegans químicamente fueron marcadas por etiquetado isobárico para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) e identificadas por cromatografía líquida y espectrometría de masas. Doscientas y tres proteínas fueron identificadas como enriqueciéndose significativamente en una fracción insoluble en SDS en nematodos envejecidos y eran en gran medida ausentes de una fracción proteica similar en nematodos jóvenes. La fracción insoluble en SDS en animales de edad contiene una amplia gama de proteínas incluyendo un gran número de proteínas ribosomales. Análisis de la ontología génica reveló enriquecimientos altamente significativos para las funciones de producción y traducción de energía. Expresión de genes que codifican proteínas insolubles en nematodos de fue derribado con RNAi, y se midieron los efectos en la vida. 41% de los genes probados fueron demostrado para extender la vida útil después del tratamiento de RNAi, frente al 18% en un grupo control de genes. Estos datos indican que los genes que codifican las proteínas que se convierten en insolubles con la edad se enriquecen para modificadores de vida útil. Esto demuestra que los enfoques proteómicos pueden utilizarse para identificar los genes que modifican la vida útil. Finalmente, estas observaciones indican que la acumulación de proteínas insolubles con diversas funciones puede ser una característica general del envejecimiento.

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