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- Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados en ovocitos de Xenopus
- Hacer patch pipetas y electrodos de Sharp con un extractor programable
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Articles by Brandon E. Johnson in JoVE
JoVE General
Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados en ovocitos de Xenopus
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine
Esta pretende ser una introducción a la revisión de la grabación de la abrazadera ovocitos de Xenopus laevis. Cubre la eliminación vitelina membrana, la formación de un sello gigaohm (gigaseal), y la conversión opcional de la revisión a la topología de fuera-out.
JoVE General
Hacer patch pipetas y electrodos de Sharp con un extractor programable
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University School of Medicine
Este vídeo muestra cómo usar un extractor de programación para pipetas de parches y electrodos para electrofisiología fuerte. El mismo procedimiento puede ser utilizado para hacer una variedad de herramientas de vidrio, incluyendo agujas de inyección.
Other articles by Brandon E. Johnson on PubMed
Levadura De Florecimiento De La Alfa-sinucleína Modelo: Toxicidad Proteasoma Deteriorada Y Estrés Oxidativo
Enfermedad de Parkinson (EP) es una neurodegeneración común que resulta de la pérdida selectiva de las neuronas dopaminérgicas de mesencéfalo. Mal plegamiento y agregación de la proteína alfa-sinucleína, daño oxidativo y deterioro proteasomal son todas las hipótesis para la causa molecular de esta neurotoxicidad selectiva. Aquí, describimos un modelo de Saccharomyces cerevisiae para evaluar el mal plegamiento, agregación, y capacidad inductora de toxicidad de tipo alfa-sinucleína y tres mutantes (A30P, A53T y A30P/A53T) y comparar la regulación de estas propiedades proteasomas disfuncional y estrés oxidativo. Encontramos localización prominente de tipo salvaje y A53T alfa-sinucleína, cerca de la membrana plasmática, apoyando la conocida capacidad de unión a lípidos in vitro. Por el contrario, A30P era sobre todo citoplásmico, mientras que A30P/A53T muestran ambos tipos de fluorescencia. Sorprendentemente, alfa-sinucleína no era tóxico para varias cepas de levadura probadas. Cuando mutantes de la levadura para el cañón proteasomal (doa3-1) fueron evaluados, retrasada alfa-sinucleína síntesis y membrana Asociación fueron observados; mutantes de la levadura para la tapa proteasomal (sen3-1) exhibieron mayor acumulación y agregación de alfa-sinucleína. Ambos mutantes de doa3-1 sen3-1 y exhibieron letalidad sintética con alfa-sinucleína. Cuando las levaduras se desafiaron con un oxidante (agua oxigenada), alfa-sinucleína fue extremadamente letal para las células que carecían de superóxido dismutasa de manganeso Mn-SOD (sod2Delta) pero no a las células que carecía de cobre, cinc superóxido dismutasa Cu, Zn-SOD (sod1Delta). A pesar de la toxicidad, células sod2Delta nunca mostraron intracelulares agregados de alfa-sinucleína. Sugerimos que las especies tóxicas alfa-sinucleína en la levadura son más pequeñas que los agregados visibles, y toxicidad puede implicar Asociación de membrana de alfa-sinucleína. Así, las levaduras han surgido organismos eficaces para caracterizar factores y mecanismos que regulan la toxicidad por alfa-sinucleína.
El Rastreador De Gusano En Paralelo: Una Plataforma Para La Medición De Velocidad Media Y La Parálisis Inducida Por Fármacos En Nematodos
Caenorhabditis elegans la locomoción es un comportamiento simple que ha sido ampliamente utilizado para diseccionar los componentes genéticos de la conducta, la transmisión sináptica, y la función muscular. Muchos de los paradigmas que se han creado para estudiar la locomoción C. elegans se basan en la observación cualitativa del experimentador. Aquí se presenta la implementación de un sistema de rastreo automatizado para cuantificar la locomoción de los gusanos individuales múltiples en paralelo.
El Complejo Distrofina Controles Bk Canal De Localización Y La Actividad Muscular En Caenorhabditis Elegans
Los defectos genéticos en el complejo de proteínas asociado a la distrofina (DAPC) son responsables de una variedad de condiciones patológicas, incluyendo la distrofia muscular, la miocardiopatía, y el vasoespasmo. Conservadas DAPC componentes de los seres humanos a Caenorhabditis elegans sugieren una función molecular similar. C. elegans mutantes DAPC exhiben un déficit exclusivo de locomoción como resultado de la excitación muscular prolongada y contracción. Aquí nos muestran que la DAPC C. elegans es esencial para la correcta localización de SLO-1, la gran conductancia, potasio voltaje, y dependiente de calcio (BK) canal, que lleva a cabo una gran corriente hacia el exterior rectificar en el músculo bajo la condición fisiológica normal . A través del análisis de mutantes con el mismo fenotipo que los mutantes DAPC, hemos identificado la novela ISLO-1 gen que codifica una proteína con dos dominios transmembrana predichos. Se demuestra que ISLO-1 actúa como una molécula de adaptador de la novela que une la DAPC de SLO-1 en el músculo. Se demuestra que un defecto en la DAPC o ISLO 1-interrumpe el normal de SLO-1 en el músculo de localización. De acuerdo con observaciones que SLO-1 requiere una alta concentración de calcio para la activación completa, nos encontramos con que SLO-1 está localizada cerca de los canales de calcio tipo L en el músculo, proporcionando así un mecanismo de acoplamiento influjo de calcio con la corriente hacia el exterior rectificar. Nuestros resultados indican que la DAPC modula la excitabilidad muscular por localizar el canal de SLO-1 a las regiones ricas en calcio de C. elegans muscular.
Por Otra Parte Dominios Empalmados Interactúan Para Regular La Apertura De Puerta BK Canal De Potasio
Mayoría de los genes humanos contienen múltiples sitios de empalme alternativo que se cree que extienden la complejidad y diversidad del proteoma. Sin embargo, poco se sabe acerca de cómo las interacciones entre los exones alternativos regular la función de las proteínas. Se utilizó el Caenorhabditis elegans SLO-1 de potasio a gran conductancia de calcio y el voltaje activado-(BK) gen del canal, que contiene tres sitios de empalme alternativo (A, B y C) y codifica al menos 12 variantes de empalme, para investigar las consecuencias funcionales de splicing alternativo. Estos sitios de empalme permiten la inserción de los exones que codifica parte del regulador de K (+) de la conductancia (RCK) 1 Ca (2 +) coordinación dominio (exones A1 y A2) y las porciones del enlazador RCK1-RCK2 (exones B0, B1, B2, C0 y C1). Los exones A1 y A2 se utilizan de una manera mutuamente exclusiva y son 67% idénticos. Los otros exones pueden extender el enlazador RCK1-RCK2 hasta en un 41 residuos. Grabaciones electrofisiológicas de todas las isoformas muestran que los exones A1 y A2 regular la cinética de activación y Ca (2 +) la sensibilidad, pero sólo si los exones alternativos se insertan en el sitio B o C. Así, RCK1 interactúa con el enlazador RCK1-RCK2, y el efecto variación del exón en compuerta depende de la combinación de exones alternativos presentes en cada isoforma.
Coordinación Intragénica Splicing Alternativo Es Esencial Para El Caenorhabditis Elegans Función Slo-un Gen
Splicing alternativo es fundamental para la diversificación de proteomas eucariotas, pero las normas que rigen y coordinación de eventos de empalme entre los múltiples sitios de empalme alternativo dentro de los genes individuales no se comprenden bien. Se desarrolló una PCR cuantitativa basada en la estrategia para cuantificar la expresión de los 12 transcripciones codificadas por el Caenorhabditis elegans SLO gen-1, que contiene tres sitios de empalme alternativo. Uso de condicionales basados en modelos de probabilidad, nos muestran que los eventos de splicing se coordinan a través de estos sitios. Además, se identifica una mutación puntual en un intrón adyacente a un sitio de empalme alternativo que rompe splicing alternativo en los tres sitios. Esta mutación da lugar a la transmisión sináptica aberrante en la unión neuromuscular. En un estudio genómico, se encontró que un elemento UAAAUC interrumpido por esta mutación se enriquece en intrones flanqueantes exones alternativos en los genes con múltiples sitios de empalme alternativo. Estos resultados establecen que la coordinación adecuada de splicing alternativo intragénica es esencial para la fisiología normal de slo-1 in vivo e identificar putativo especializados elementos reguladores cis que regulan la coordinación de splicing alternativo intragénica.
