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Articles by Brian J. Hawkins in JoVE
JoVE General
血管钙的可视化 2 +信号旁分泌源性活性氧引发
1Department of Biochemistry, Temple University, 2Department of Anesthesiology and Pain Medicine, University of Washington
一种有效的方法获得可视化的旁分泌衍生活性氧诱导内皮细胞Ca2 +信号的见解的描述。这种方法测量旁分泌衍生活性氧引发共培养模型在血管内皮细胞内Ca2 +动员的优势。
JoVE General
小鼠离体心肌线粒体通透性转换孔开放中的多参数测量。
这里介绍一个荧光光谱的测量小鼠离体心脏线粒体中的线粒体通透性转换孔开放的协议。该法涉及同时测定线粒体钙
Other articles by Brian J. Hawkins on PubMed
InsP3 受体介导的线粒体功能障碍与血管内皮细胞凋亡中过氧化物的选择性作用。
活性氧 (ROS) 在细胞存活和缺血/再灌注损伤的细胞死亡的发散作用 (我 / R) 损伤和炎症相关联。在此研究中，激活的巨噬细胞的活性氧生成诱发细胞内的 Ca2 + ([Ca2 +] 我) 瞬时被烧蚀的超氧化物歧化酶和阴离子通道阻滞剂结合的内皮细胞。[Ca2 +] 存储耗尽，但不是胞外 Ca2 + 螯合，使 [Ca2 +] 我抬高的回应 O2 *-这是肌醇 1,4,5 内 (InsP3) 的依赖，并缺乏三 InsP3 受体 (InsP3R) 异构体的单元格显示 [Ca2 +] 失败我瞬变。重要的是，的 O2 * 使触发的 Ca2 + 动员之前在线粒体膜电位的损失，是独立于其他氧化剂和 mitochondrially 派生的活性氧。激活细胞凋亡的发生有选择性地以响应 O2 *-可能无法由 [Ca2 +] 和我缓冲。这项研究提供了证据，O2 *-便利 InsP3R 链接凋亡梯级和可能在我担任一个重要功能 / R 损伤和炎症。
中超重中年成人与阻塞性睡眠呼吸暂停的独特运动心肺功能测试响应。
阻塞性睡眠呼吸暂停 (OSA) 的特点是重复性的上呼吸道的夜间障碍物诱导低氧血症、 高碳酸血症、 交感神经激活和树。此紊乱诱发心血管自主神经失调和高血压的发展做出贡献。虽然在测试的诊断和预后的练习测试实用程序是心脏病方面的临床实用程序行使的既定 OSA 筛查不仔细探讨了。探索此潜在的应用程序，我们对比心肺的响应，以行使测试最近患类似身体健康显然是对口的 OSA 患者处于非活动状态的历史记录、 年龄和身体热售。
超通量氯通道-3 通过血管内皮细胞介导细胞内信号传递。
活性氧 (ROS) 在细胞信号转导和病理都有牵连。内皮细胞的活性氧的主要来源是 NADPH 氧化酶，生成超 (O(2)(.-)) 胞外侧的细胞膜，但可以导致细胞内的信号。以研究可能跨膜通量的 O(2)(.-)、 肺微血管内皮细胞是预先加载与 O(2)(.-) 敏感荧光 hydroethidine (他)。O(2)(.-) 胞外丸中的应用导致迅速和浓度依赖性瞬态他氧化，随后逐步和不可逆的增加在核他荧光。这些荧光改变阻碍了超氧化物歧化酶 (SOD)、 阴离子通道阻滞剂分布式入侵检测系统，和选择性沉默的氯离子通道-3 （ClC-3)，以 siRNA 治疗。胞外 O(2)(.-) 触发释放又引发了跟线粒体 O(2)(.-) 生产和细胞凋亡的线粒体膜潜在改建的经。这些"信号"的 O(2)(.-) 影响受阻分布式入侵检测系统治疗、 胞经商店与 thapsigargin 的枯竭和螯合性细胞内的经。这项研究表明 O(2)(.-) 通血管内皮细胞细胞膜跨 ClC 3 渠道发生诱导细胞内的经释放，激活线粒体 O(2)(.-) 代。
Bax 和 Bak 的浆液因素调节 T 细胞的内质网经稳态控制通过扩散。
Bcl-2 相关 X 蛋白 (Bax) 和 Bcl-2-拮抗剂/杀手 (Bak) 重要监管者的淋巴细胞凋亡，但是否它们发挥作用，在可行的 T 细胞功能尚不清楚。在这里，我们报告 T 细胞缺乏 Bax 和 Bak Ca(2+) 信号缺陷由于显示抗原特异性扩散中的缺陷。有缺陷的 T 细胞受体 (TCR) 和肌醇 1,4,5 (IP(3)) Bax(-/-)，Bak(-/-) T 细胞显示依赖经动员因，扭转了 Bax 的引入的更改的内质网 (ER) 经监管。依赖于 Bax 和 Bak TCR 依赖经信号刺激线粒体 NADH 生产超过用于 ATP 合成的能力。Ca(2+) 诱导线粒体 NADH 标高缺席的 Bax 和 Bak 钝化导致活性氧产量下降，这是所需的 T 细胞增殖。在一起，数据建立 Bax 和 Bak 发挥重要作用的 T 细胞增殖控制在通过调节 ER 经释放。
G 蛋白偶联受体 Ca2 +-链接线粒体的活性氧物种的内皮细胞白细胞/遵守至关重要。
受体介导的信号转导是常与多个函数，包括生产的活性氧物种相关联。但是，是否源性线粒体超氧 (洗) 直接有助于生理信号是有争议的。在这里我们展示的生理 Ca(2+) 诱发洗生产发挥了关键作用内, 皮细胞 (EC) 激活和白细胞坚定黏附在以前未知的机制。G 蛋白偶联受体 (气相) 和酪氨酸激酶介导肌醇 1,4,5 内依赖线粒体经吸收导致 NADPH 氧化酶独立洗生产。但是，气相化学还原链接洗生产并没有改变线粒体的函数或触发器细胞死亡，而是有助于激活通过欧共体诱导细胞间粘附分子 1 NF 活化和白细胞粘附。锰超氧化物歧化酶表达和模拟单元 permeative 的超氧化物歧化酶洗歧化烧蚀 NF 活化转录活性和促进下模拟循环后气相化学还原-但不是细胞因子诱导激活内皮细胞白细胞脱离。这些结果表明，洗是受体介导经信号转化为炎性信号和白细胞/EC 坚定粘附的下游效应分子。
同时检测细胞凋亡和流式细胞术和共焦显微镜观察活细胞内的线粒体超氧生产。
膜联蛋白 V 和 Sytox 绿色是广泛使用的标记，以评估中使用流式细胞术和荧光显微镜的各种类型细胞的凋亡。最近，新型 fluoroprobe MitoSOX 红了选择性检测的过氧化物，线粒体的活细胞和验证其共聚焦显微镜和流式细胞术。本议定书与凋亡标记 （膜联蛋白 V 和 Sytox 绿色） 描述了通过流式细胞和血管内皮细胞中的共聚焦显微镜的线粒体超氧代同时测量。过其他基于单元格的方法描述的流流式细胞分析方法的优点是惊人的速度 (1-2 h)、 精致的精度和线粒体超氧生成和凋亡 （及其他） 的同时定量测量标志物与细胞功能的最大保护的可能性。与荧光显微镜结合此方法可能会非常有用，以揭示重要时空改变线粒体超氧生产和执行在几乎任何单元格中键入的程序性的细胞死亡。
内皮靶向透聚合物 Nanocarriers 的酶疗法。
蛋白质，如治疗酶、 医疗效用大大不耐热性质和不足交付受限制。最治疗酶不做堆积在其目标和蛋白酶灭活。针对封装基板透聚合物纳米载体 （民警） 到酶的蛋白酶不透水层可能克服这些限制。若要测试这一假设，我们设计了血管内皮有针对性的 PNC 加载与过氧化氢酶，(2) H O 2 解毒酶和测试如果这种方法可以防止血管的氧化应激、 缺血再灌注和其它疾病条件受牵连的病理过程。多晶硅-乳酸/聚羟基乙酸 (PEG PLGA) 是在范围内和封装的过氧化氢酶 (MW 247 科威特第纳尔)、 过氧化物酶 (MW 42 科威特第纳尔) 和黄嘌呤氧化酶 （XO，MW 300 第纳尔) 到大约 300 nm 直径民警组成的聚乙二醇共聚物会大约 10%的所有酶。PNC/过氧化氢酶和刚果国家警察/过氧化物酶受到来自外部的蛋白质降解和施加其国家民警敷衬底，H(2)O(2) 和邻-phenylendiamine，酶的活性而封装 XO 的活动是由于在基体聚合物抗渗性可以忽略不计。民警针对血小板内皮的细胞 (EC) 粘附分子 1 交付的活动封装到 ECs 过氧化氢酶和保护内皮细胞对氧化应激的细胞培养和动物研究。血管靶向民警加载解毒酶的可能会发现广泛医疗应用程序，包括其他毒性与氧化应激的管理。
细胞膜穴样内陷是为血管内皮细胞信号转导与剪应力突然减少相关通路的重要组成部分。
到流改编肺微血管内皮细胞 (PMVEC) 表示的剪应力 (模拟缺血) 急性丧失流突然停止导致 EC 增殖信号的活性氧物种 （ROS） 代。我们评价窖 1 上用鼠标为 72 h 5 dyn/cm(2) 跟流 （"缺血") 停止在层流到了预处理的 PMVEC 此细胞反应的作用。预处理导致细胞表达的 K(ATP) (K(IR) 6.2) 渠道 2.7-fold 增加但窖 1、 gp91(phox) 或 MAP 激酶的表达水平没有变化。野生型细胞在缺血的初步反应是废除了基因打靶的 K(IR) 6.2 的细胞膜去极化。随后的反应是增加的 ROS 生产与 NADPH 氧化酶 (NOX2) 的激活，然后磷酸化的 MAP 激酶 (Erk、 JNK） 相关联。后的野生型细胞在缺血的 24 h，细胞增殖指数增加了 2.5 倍和的 %s + G 中的单元格 (2) /M 阶段增加 6-fold。在窖 1 空 PMVEC 或 filipin 与野生型细胞治疗，此信号的级联放大地图激酶激活及细胞增殖活性氧生产细胞膜去极化） 被正式废止。这些研究表明，窖 1 函数作为剪切传感器在流改编教统会导致 ROS 介导的细胞信号转导和血管内皮细胞增殖后流量突然减少。
超氧诱导细胞死亡的浆液 Bcl-2 相关蛋白质投标和 Bak 的执行。
乙醇中毒刺激生产的炎性细胞因子、 增加形成的活性氧和诱导线粒体功能障碍。但是，有限的精确序列和酒精性肝损害中涉及的组件的信息。急性乙醇暴露增强线粒体超氧 (O(2)(*-)) 生产和损害线粒体经处理。反过来，O(2)(*-) 促进细胞色素 c 释放并不是取决于 H(2)O(2) 和二价阳离子和 Bax 独立方式需要 Bak 的线粒体膜潜在损失。此外，触发的 Bak 的浆液活动需要投标，只有 BH3 的蛋白质由启动器半胱氨酸蛋白酶-2 处理游离的存在。在一起，这些研究确定有选择性地涉及 bcl-2 家族蛋白投标和 Bak 的 O(2)(*-) 驱动、 半胱氨酸蛋白酶启动凋亡通路。这条步道表现在老年动物的慢性酒精消费的过程，并将半胱氨酸蛋白酶-2、 投标和 Bak 标识为基本调解员 O(2)(*-) 诱导细胞凋亡，可能证明是有效的疗法治疗酒精性肝病的发展目标。
黑素细胞样细胞在心脏和肺静脉对房性心律失常触发器作出贡献。
心房纤颤是最常见的临床心律失常。它通常由早搏引起肺静脉和心房，但源和这些节拍的机制仍不清楚。黑色素合成酶体 tautomerase (DCT) 被参与细胞内钙离子和活性物种调节黑素细胞中。既然时异常的细胞内钙离子和活性物种已述心房颤动患者，我们调查的 DCT 在此过程中的作用。在这里，我们的特点是唯一 DCT 表示单元格人口内填充肺静脉、 心房、 房室的小鼠和人类的心中。表达谱表明这一人口表示肾上腺素能和毒蕈碱受体，并显示不同的皮肤黑素细胞的转录配置文件。成年小鼠缺乏 DCT 显示正常心脏的发展，但对房性心律失常的敏感性增加。原发性心脏黑素细胞样细胞被激发，和那些缺乏 DCT 显示与早期后除极延长复极。此外，与酪氨酸激酶受体 Kit 基因突变小鼠缺乏心脏黑素细胞样细胞，不开发 DCT 缺席的房性心律失常。这些数据表明在中庭的黑素细胞样细胞功能障碍和肺静脉可能有助于房性心律失常。
硝化的线粒体复合体我亚基 NDUFB8 诱发 RIP1 和 RIP3 介导坏死。
一氧化氮 (NO) 和其他活性氮物种的目标中线粒体影响细胞生物能量学和生存多个站点。动力学成像研究表明没有从激活的巨噬细胞或捐助化合物迅速发散到线粒体，在不依赖 DAF 荧光，这相当于线粒体膜的潜在损失和发起最终导致坏死性细胞死亡的细胞生物能量的变化引起剂量依赖性会逐步增加。细胞功能失调是介导的线粒体复合体升高的 3-硝基酪氨酸签名我亚基 NDUFB8，这是重要的正常线粒体功能选择性 ⑷ 通过 siRNA 可见一斑。线粒体的超氧化物歧化酶的表达大大下降 NDUFB8 硝化反应和恢复线粒体内稳态。此外，necrostatin-1 或 siRNA 组合式 RIP1 和 RIP3 的细胞治疗阻止介导无坏死。这项工作表明，相互作用和 mitochondrially 之间无派生的超改变线粒体生物能量学和细胞功能，从而提供一个分子机制活性氧和氮线粒体内稳态介导的物种变化。
线粒体复合物 II 可防止缺氧但不是钙和浆液 Bcl-2 蛋白诱导线粒体膜潜在损失。
线粒体膜潜在损失了生命的严重后果，并有助于许多人类疾病包括心肌梗死、 脑卒中、 肿瘤、 神经变性。然而，尽管它的突出和细胞能量生产中的重要性，即设立了线粒体膜电位的基本机制仍不清楚。我们的研究阐明复杂二驱动电子流是由其中线粒体膜极化在缺氧的条件下和复杂的二衬底琥珀酸的缺乏导致可逆膜潜在损失可由丁二酸补充迅速恢复的主要手段。我和 F (0) F 1 ATP 合成酶抑制线粒体复合体诱导线粒体的去极化，是独立于线粒体通透性转换孔、 Bcl-2 （B 细胞淋巴瘤 2) 家族蛋白或高振幅肿胀和无法扭转的丁二酸。重要的是，在缺氧条件下的丁二酸代谢恢复膜电位和 ATP 水平。此外，二介导的复杂电子流依赖允许细胞线粒体疾病患者没有复杂的功能从我维持线粒体膜电位所传达的线粒体结构和螯合激动剂诱导钙类似于正常细胞的能力。这一发现是重要的因为它作为有吸引力的治疗缺氧时保持线粒体功能设置复杂二功能保存的舞台。
甲基苯丙胺导致 Mitrochondrial 氧化损伤导致功能障碍的人类 T 淋巴细胞。
甲基安非他明 (甲基) 滥用被认为是过分的感染率与相关联。虽然许多研究已描述方法学专门曝光和免疫抑制的协会，到目前为止的底层机制仍然是可望而不可及。在此研究中，我们提出证据 METH 暴露导致线粒体氧化损伤，并造成的人类 T 细胞的主要功能障碍。T 淋巴细胞的方法学专门治疗导致增强生成的活性氧物种的细胞内钙水平上升。TCR CD28 与钙动员和随后的吸收与线粒体产生的超氧增加相关的方法学专门治疗 T 细胞中的线粒体。暴露于 METH 诱导线粒体功能障碍线粒体膜电位显著下降的形式增加线粒体大众、 提高蛋白 nitrosylation 和降低蛋白水平配合物一、 三和四电子运输链。这些变化的同时，减少分泌白细胞介素-2 和 T 细胞增殖反应后 TCR CD28 刺激指示受损 T 细胞功能。此外，抗氧化剂衰减 METH 线粒体损伤所保留的线粒体复合物蛋白水平一、 三和四。总之，我们的数据表明 METH 可以导致通过诱导的氧化应激和免疫功能障碍继发 METH 滥用的基础机制作为线粒体损伤的 T 细胞功能紊乱。
谷胱激活 STIM1，并改变线粒体的动态平衡。
氧化应激的影响许多细胞的过程，包括细胞生长、 分化、 细胞死亡。公认的链接，这些进程与氧化应激是通过经信号的变化。然而，正是如何氧化剂影响经信号尚不明确。氧化应激导致经调动表型转变从振荡持续提升模式通过钙释放活性钙 (裂纹)-介导的电容经条目与基质的相互作用分子 1 (STIM1)-和 Orai1-缺细胞对氧化应激有抗药性。就功能而言，氧化剂诱导经项改变线粒体经处理与生物能量学和触发器细胞死亡。STIM1 S glutathionylated 位于中对氧化应激反应的 56 半胱氨酸和唤起本构经进入独立于细胞内的经商店。这些试验表明，56 半胱氨酸是依赖氧化剂的激活的 STIM1 传感器和表明氧化应激和经信号通过恒温恒湿空调系统通道之间的分子联系。
PECAM 针对交货的超氧化物歧化酶抑制血管内皮的炎症反应。
高架的代内皮细胞酶，包括 NADPH 氧化酶、 活性氧 (ROS) 被卷入了血管氧化应激和血管内皮炎症激活涉及暴露血管细胞粘附分子-1 (血管细胞黏附分子-1）。过氧化氢酶、 超氧化物歧化酶 (SOD) 抗体的血小板/血管内皮细胞粘附分子 1 (PECAM 1) 共轭绑定具体到内皮细胞和抑制相应的活性氧，H(2)O(2) 和超氧阴离子的影响。在此研究、 超氧化物抗-PECAM 歧化酶，但不是抗-PECAM/过氧化氢酶或 nontargeted 的酶，包括聚乙二醇 (PEG)-超氧化物歧化酶，抑制 2 到 3 倍血管细胞黏附分子表达肿瘤坏死因子 (TNF)、 白细胞介素-1β 和脂多糖引起的。抗 PECAM 超氧化物歧化酶，但不是 nontargeted 同行，静脉滴注后累积的血管内皮细胞中血管内皮的 endosomes，本地化和抑制小鼠 70%脂多糖引起血管细胞黏附分子-1 表达。抗-PECAM/SOD colocalized 与 EEA 阳性 1 皮水泡和淬火活性氧产生肿瘤坏死因子的响应。NADPH 氧化酶和阴离子通道 ClC3 的抑制剂阻止肿瘤坏死因子诱导血管细胞黏附分子表达，申明超生产和运送这些蛋白质的分别，介导炎症信号。抗-PECAM/SOD 废除引起血管细胞黏附分子表达 poly(I:C)-诱导活化的收费样受体 3 在细胞内囊泡中本地化。这些结果直接牵连 endosomal 涌入的过氧化物内, 皮炎症反应和建议通过有针对性地开展反-PECAM/超氧化物歧化酶的成血管内皮的 endosomes 实现此信号的特定于站点拦截可能有抗炎作用。
放松管制的 Microrna 的艾滋病毒 1 蛋白蛋白导致认知障碍的发展。
研究表明艾滋病病毒感染的病人发展认知障碍的神经功能障碍的特点。生产性感染艾滋病毒的神经元的缺乏表明病毒和细胞蛋白与神经毒性的活动，从感染艾滋病毒 1 靶细胞释放导致神经元放松管制。已证明病毒蛋白 R (蛋白)，由艾滋病毒-1 编码的蛋白质改变表达的各种重要的细胞因子和炎症蛋白在感染和非感染细胞 ；但是参与的机制仍不清楚。使用人类神经细胞行，我们发现蛋白可以采取导致神经元： (i) 钙稳态，(ii) 内质网钙释放，(iii) 氧化应激通路、 (四) 线粒体功能障碍和 v 突触回缩活化的放松管制。在搜索有关的细胞因子，我们执行的 Microrna 和基因重组蛋白蛋白与使用我们治疗的人类神经元 （主文化或 SH SY5Y 细胞系） 的数组检测方法。有趣的是，蛋白 deregulates 几个 Microrna (例如和平号空间站-34a） 和其靶基因 （例如 CREB)，这可能导致神经功能障碍的水平。因此，我们的结论蛋白在神经细胞功能障碍通过放松 Microrna 和其靶基因，一种现象，可能会导致认知障碍的发展中发挥着重要作用。
艾滋病毒 1 Tat 蛋白促进神经细胞功能障碍通过 Microrna 的中断。
过去十年，小非编码 RNA 分子例如 Microrna (Mirna) 已成为关键的监管机构的表达与真核基因组的功能。有建议病毒感染和神经系统疾病的结果也可能由小 RNAs 的影响。这促使我们建议艾滋病毒感染改变内源性米尔的表达模式，从而促进神经细胞的放松管制和艾滋病痴呆症。因此，使用原代培养和神经元细胞系，我们审查 （艾滋病毒 1 达） 的病毒蛋白的影响对其特性的功能，如从受感染的细胞释放由于 Mirna 表达和所占用的 noninfected 单元格。我们使用 microRNA 阵列测定，表明达 deregulates 几个 Mirna 的水平。有趣的是，和平号空间站 34a 是最高度诱发 Mirna 达治疗神经元之间。达也减少了和平号空间站 34a 靶基因等的实时聚合酶链反应所示的 CREB 蛋白的水平。达的影响下反 miR 34a，击退。使用原位杂交检测，我们发现和平号空间站 34a 的水平增加达转基因小鼠与父母的小鼠相比。因此，我们的结论撤销利率管制的神经元功能由艾滋病毒 1 达蛋白是米尔依赖。
