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Articles by Britta Blumenthal in JoVE
JoVE General
Bleu d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour l'analyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires
1Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 2Centre for Biological Signalling Studies (bioss) and Biology III, Faculty of Biology, University of Freiburg, 3Department of Molecular Immunology, Max-Planck-Institute of Immunology and Epigenetics
Dans cette vidéo, nous décrivons la caractérisation de complexes multiprotéiques (PPM) en bleu électrophorèse en gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE). Dans une première dimension, dialysées lysats cellulaires sont séparés par BN-PAGE pour identifier les PPM individuelle. Dans une deuxième dimension SDS-PAGE, PPM d'intérêt sont subdivisées afin d'analyser leurs électeurs par immunoblot.
Other articles by Britta Blumenthal on PubMed
Les Facteurs Cytotoxiques Nécrosante De Yersinia Pseudotuberculosis Et De Escherichia Coli Se Fixent à Différents Récepteurs Cellulaires, Mais Prendre La Même Route Vers Le Cytosol
Les facteurs cytotoxiques nécrosantes CNF1 et CNF2 produites par des souches pathogènes d'Escherichia coli et CNF (Y) de Yersinia pseudotuberculosis constitutivement active petites GTPases de la famille Rho. Ils deamidate une glutamine (Gln63 dans RhoA), qui est crucial pour l'hydrolyse du GTP. CNF1 et CNF (Y) présentent 61% d'identité sur le niveau des acides aminés, avec une répartition égale sur toute la molécule. Bien que les deux toxines sont homologues dans le domaine de liaison au récepteur, nous montrons qu'elles se lier à différents récepteurs cellulaires. CNF (Y) ne pénètre pas dans Caco-2 et des cellules CHO-K1, qui sont sensibles à CNF1. En revanche, HeLa, Hep-2, et des cellules HEK 293 ne répondre à ces deux toxines. Les études de compétition avec des mutants catalytiquement inactifs des toxines a révélé que la liaison de CNF1 n'a aucune influence sur l'absorption de la FIIC (Y) dans des cellules HeLa. En revanche, la fixation de CNF1 est retardée après préincubation de cellules HeLa avec le mutant catalytiquement inactif de la FIIC (Y), ce qui suggère que les récepteurs des toxines se chevauchent. En outre, nous avons comparé les voies des toxines de la liaison au récepteur dans le cytosol et a montré que les deux toxines sont absorbées indépendante de la présence de radeaux lipidiques ou clathrine et sont libérés dans le cytosol à partir acidifié endosomes.
Le Clivage De Escherichia Coli Facteur Cytotoxique Nécrosante 1 Est Requis Pour L'activité Biologique Complet
Cytotoxique nécrosante facteur 1 (CNF1) est une toxine protéique produite par des souches pathogènes de E. coli. CNF1 active constitutivement petites GTPases de la famille Rho par désamidation d'une glutamine, qui est crucial pour l'hydrolyse du GTP. La toxine est repris dans les cellules de mammifères par endocytose et est livré à partir de fin endosomes vers le cytosol. Ici, nous montrons que d'un fragment d'environ 55 kDa de CNF1, qui contient le domaine catalytique et une partie supplémentaire de la toxine, est présent dans le cytosol. Le traitement de ce fragment nécessite un pH acide et d'insertion de la toxine dans la membrane endosomale. On définit la région du site de clivage de la région située entre les acides aminés 532 et 544 de CNF1. Les données donnent un aperçu de la complexité du mécanisme de l'absorption de toxines bactériennes dans les cellules de mammifères.
5-hydroxytryptamine Module La Libération De La Migration, Des Cytokines Et Des Chimiokines Et De La Capacité D'amorçage Des Lymphocytes T De Cellules Dendritiques in Vitro Et in Vivo
A côté de son rôle bien décrit dans le système nerveux central et périphérique 5-hydroxytryptamine (5-HT), communément connu sous le nom de sérotonine, est également un puissant immuno-modulateur. Récepteurs sérotoninergiques (5-HTR) sont exprimées par un large éventail de types de cellules inflammatoires, y compris les cellules dendritiques (CD). Dans cette étude, nous avons cherché à caractériser davantage les propriétés immuno-biologiques de l'homme sur les récepteurs sérotoninergiques dérivées de monocytes PED. 5-HT est capable d'induire la migration orientée dans les PED immatures mais pas dans LPS-mûri par l'activation de la 5-HTR (1) et 5-HTR (2) types de récepteurs. En conséquence, la 5-HT a également augmenté la migration des CD pulmonaires pour les ganglions lymphatiques in vivo. En se liant à 5-HTR (3), 5-HTR (4) et 5-HTR (7), des récepteurs 5-HT-régulé de production de l'pro-inflammatoire cytokine IL-6. En outre, la 5-HT influencé la libération des chimiokines par les monocytes humains dérivés PED: la production de la puissante Th1 IP-10/CXCL10 chimiotactique a été inhibée dans les DCs matures, tandis que la sécrétion CCL22/MDC était régulée à la hausse dans les PED à la fois matures et immatures. En outre, PED mûri en présence de 5-HT commuté vers un phénotype de haute sécrétant l'IL-10 et IL-12p70 de faible. Constamment, la 5-HT favorisé le résultat d'une réponse immunitaire de type Th2 à la fois in vitro et in vivo. En résumé, notre étude montre que la 5-HT est un puissant régulateur de la fonction des cellules dendritiques humaines, et que le ciblage récepteurs sérotoninergiques pourrait être une approche prometteuse pour le traitement des troubles inflammatoires.
Détection De T Phosphorylés Et L'espèce B Antigène De Cellule Par Des Récepteurs Phos-tag SDS-et Blue Native-PAGE
Détection des phospho-protéines et des formes phosphorylées différemment de la même protéine sont importantes pour comprendre le comportement des cellules. Une nouvelle méthode est Phos-tag SDS-PAGE. Un Mn binucléaire (2 +) complexe qui se lie aux groupes phosphate (-Phos l'étiquette) est attaché de manière covalente à la matrice de gel de polyacrylamide. Ainsi, des protéines phosphorylées sont retardés dans leur migration et peuvent être distingués de leurs homologues non-phosphorylées. Nous avons appliqué Phos-tag SDS-PAGE à l'analyse des sous-unités zêta, CD3epsilon et CD3delta du récepteur de l'antigène des cellules T (TCR-CD3). La stimulation pervanadate généré six différentes phospho-zeta et chaque CD3epsilon deux différentes formes et CD3delta. Cela correspond à des tyrosines phosphorylables sur leurs queues cytoplasmiques. Le motif de phosphorylation était compatible avec les événements de phosphorylation aléatoires. En outre, nous avons montré que la technologie Phos-tag peut être appliqué à des Autochtones Bleu (BN)-PAGE. Ce étend l'applicabilité à l'analyse des complexes protéiques d'origine. Lors de la stimulation du complexe TCR pervanadate-CD3 a été principalement détectés comme deux distincts phospho-complexes. En revanche, le récepteur B antigène de cellule (BCR) est apparue comme une phospho-forme. Ainsi, Phos-tag BN-PAGE est utile pour l'analyse des états de phosphorylation différents de complexes multiprotéiques.
Polyuréthane Échafaudages Ensemencé Avec Génétiquement Modifiés Myoblastes Squelettiques: Un Outil Prometteur Pour Rétablir La Fonction Du Myocarde
Dans les modèles animaux, l'injection intra-myocardique de myoblastes squelettiques primaires est censé favoriser la régénération tissulaire et à améliorer la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde. L'utilisation de transgéniques surexprimant les myoblastes facteurs paracrines impliqués dans la réparation tissulaire est censé améliorer ces effets. Cependant, la thérapie cellulaire par injection est toujours accompagné par un taux élevé de mortalité des cellules injectées. Ici, nous décrivons la construction d'un facteur de croissance de production de myoblastes tête de série échafaudage pour surmonter cette limitation. Myoblastes squelettiques ont été isolés et élargi à partir de rats nouveau-nés de Lewis. Les cellules ont été ensemencées sur polyuréthane (PU) échafaudages (Artelon) et transfectées avec l'ADN de VEGF-A, HGF, SDF-1, ou en utilisant le Akt1 à base de lipides méthode Metafectene Pro. La surexpression a été vérifiée par ELISA, RT-PCR (VEGF-A, HGF, et SDF-1) et l'analyse par Western blot (Akt1). La tête de série échafaudages ont été transplantés sur endommagé myocarde des rats Lewis 2 semaines après un infarctus du myocarde. Six semaines plus tard, leur potentiel thérapeutique in vivo a été analysé par la mesure de la taille de l'infarctus et la densité capillaire. Myoblastes squelettiques primaires de rat ensemencées sur des échafaudages ont été transfectées efficacement PU, avec des taux de transfection de 20%. In vitro, nous avons noté une augmentation significative de l'expression du VEGF-A, HGF, SDF-1, et Akt1 après la transfection. In vivo, la transplantation de produire le facteur de croissance des myoblastes graines échafaudages entraîné angiogenèse renforcée (VEGF-A, HGF, et Akt1) ou une zone de l'infarctus du réduite (SDF-1 et Akt1) dans l'ischémie du myocarde endommagé. En résumé, nous avons construit un facteur de croissance de production de myoblastes tête de série échafaudage qui combine le potentiel bénéfique de la transplantation de cellules souches avec les effets prometteurs du gène-thérapeutiques des approches. Parce que cette matrice nous permet aussi de contourner l'application de cellules précédentes inconvénients, il peut représenter un outil prometteur pour la régénération tissulaire et le rétablissement de la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde.
Un Rôle Possible Pour P2X7R Dans L'inflammation Allergique Des Voies Respiratoires Chez Les Souris Et Les Humains
P2X ₇ R déficit est associé à un résultat moins sévère dans les aigus et chroniques des troubles inflammatoires. Récemment, nous avons démontré que l'adénosine triphosphate est extracellulaire impliquée dans la pathogenèse de l'asthme en modulant la fonction des cellules dendritiques (CD). Cependant, le rôle du récepteur purinergique P2X sous-type ₇ est inconnue. Pour élucider le rôle de P2X ₇ R dans l'inflammation allergique des voies respiratoires (AAI) in vitro et in vivo, P2X ₇ R expression a été mesurée dans les tissus pulmonaires et les cellules immunitaires de la souris ou chez l'homme souffrant d'asthme allergique. En utilisant un P2X spécifiques ₇ R-antagonistes et P2X ₇ R-animaux déficients, le rôle de ce récepteur dans l'asthme aigu et chronique expérimentale a été explorée. P2X ₇ R a été jugée régulée à la hausse au cours inflammation asthmatique voies respiratoires aiguë et chronique chez les souris et les humains. In vivo expériences ont montré la pertinence fonctionnelle de cette constatation, car sélective P2X ₇ R inhibition ou P2X ₇ R déficit a été associée à des caractéristiques réduites de l'asthme aiguë et chronique dans l'ovalbumine-alun ou modèle HDM de l'AAI. Des expériences avec des chimères de moelle osseuse a souligné que l'expression R ₇ P2X sur les cellules hématopoïétiques est responsable des effets proasthmatic de P2X signalisation ₇ R. Dans le modèle DC-mené de l'AAI, P2X ₇ R-déficientes PED ont montré une diminution de la capacité à induire une immunité Th2 in vivo. Up-régulation de P2X ₇ R sur les macrophages et les éosinophiles sanguins BAL a pu être observée chez les patients souffrant d'asthme chronique. Nos données suggèrent que le ciblage P2X ₇ R sur les cellules hématopoïétiques (p. ex, DCS ou éosinophiles) pourrait être une nouvelle option thérapeutique pour le traitement de l'asthme.
Échafaudage à Base De Transplantation De Myoblastes Squelettiques Akt1 Surexprimant: Régénération Fonctionnelle Est Associée à L'angiogenèse Et La Taille De L'infarctus Réduit
Myoblastes basé sur la thérapie peut améliorer la fonction cardiaque après infarctus du myocarde et est classiquement réalisée par injection directe. Un transfert d'échafaudage à base pourrait permettre de surmonter les problèmes d'injection associés. Dans la mise à niveau de cette approche que nous transplanté myoblastes squelettiques (SKM) surexprimant le gène AKT1 prosurvival. SKM ont été transfectées par pcDNA3-huda-Akt1 et ensemencées sur des échafaudages en polyuréthane. Ces échafaudages ont été transplantés chez des rats 2 semaines après un infarctus du myocarde. Hémodynamique ont été analysés avant la thérapie et 6 semaines plus tard. Taille de l'infarctus et de la densité capillaire ont été effectuées par la suite. D'autres groupes ont reçu des injections de myoblastes Akt1-transfectées ou non transfectées, échafaudages ensemencés avec des myoblastes non transfectées, ou opération fictive. Détérioration de la fonction systolique ventriculaire gauche globale peut être inhibée par toutes les approches thérapeutiques. En outre, la transplantation de cellules transfectées Akt1, soit échafaudage en fonction ou injectée, était supérieur à l'égard de propriétés systolique de la paroi ventriculaire gauche. Cet effet était accompagné par des tailles plus petites infarctus et de l'angiogenèse. Échafaudages avec myoblastes non transfectées a abouti également de plus petits infarctus que les injections de myoblastes non transfectées. Les deux groupes Akt profité à l'égard de la dP / dt (min). En revanche, d'autres paramètres diastoliques pointé altération de la relaxation et plus rigide myocarde en particulier dans le groupe Akt1-échafaud. En conclusion, SKM surexprimant Akt1 peut maintenir la fonction du myocarde après un infarctus, de réduire la taille d'infarctus, et d'induire la néovascularisation. Transfert de cellules d'échafaudage à base n'augmente pas cette capacité de remodelage inverse.
Régénération Fonctionnelle Du Myocarde Ischémique Par Des Cellules Transplantées Des Cellules Stromales Surexprimant-derived Factor-1 (SDF-1): Injection Intra-Versus échafaudage Application Basée Sur
Cellules stromales de facteur-1 (SDF-1) est un chemotaxin puissant. L'augmentation des SDF-1 niveaux peuvent être trouvés dans le myocarde ischémique et peut protéger contre l'ischémie-reperfusion. Nous émettons l'hypothèse que la transplantation de cellules souches surexprimant SDF-1 pourrait améliorer la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde (MI). Nous avons comparé l'injection intramyocardique avec une application basée sur échafaudage de SDF-1-cellules transfectées.
Hépatocytes En Facteur De Croissance Transfectées Myoblastes Squelettiques Pour Limiter Le Développement De L'insuffisance Cardiaque Post-infarctus
Les cellules souches transplantées à un coeur blessé affectent le myocarde hôte indirectement. Le facteur de croissance des cytokines des hépatocytes (HGF) peut jouer un rôle clé dans cette activité paracrine. Nous avons supposé que HGF surexprimant les cellules souches serait de restaurer la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde (MI). Parce qu'il ya un taux élevé de la mort cellulaire lors de l'injection des cellules intramyocardially, nous avons utilisé le transfert de cellules échafaudage basée. Myoblastes squelettiques (SKMS) ont été isolés et élargi à partir de rats nouveau-nés de Lewis. Les cellules ont été transfectées par pcDNA3-huHGF et ensemencé de polyuréthane (PU) ou échafaudages dilué dans un milieu pour l'injection des cellules. La tête de série échafaudages ont été transplantés chez des rats deux semaines après un IM (groupe: PU-HGF-SKM) ou la solution infection a été injecté intramyocardially (groupe: Inj-HGF-SKM). Deux groupes (INJ-SKM et PU-SKM) ont été préparés avec des cellules non transfectées et groupe témoin sans la thérapie cellulaire a servi de témoin (n = 10 par groupe). Au début du traitement (de base) et six semaines plus tard, les paramètres hémodynamiques ont été évalués. A la fin de l'étude, l'analyse histologique a été employé. Chez les animaux factices, nous avons détecté une diminution de la fonction systolique et diastolique au cours de la période d'observation. Traitement avec des myoblastes non transfectées ne conduit pas à des changements significatifs dans les paramètres hémodynamiques entre l'intervention et six semaines plus tard. Dans le groupe PU-HGF-SKM, les paramètres systoliques comme dP / dt (max), dP / dt (min) et de contraction isovolumique nettement améliorée entre le début et fin de l'étude. Certains paramètres diastoliques étaient inférieurs par rapport aux valeurs initiales (SB-Ked, à mi-temps la pression [PHT], la protéine Tau). Dans le groupe Inj-HGF-SKM, seulement PHT a été altérée par rapport à des valeurs preinterventional. L'analyse histologique a montré de manière significative plus de capillaires dans la zone frontalière infarctus dans les groupes PU-HGF-SKM que dans imposture et Inj-SKM groupe. La taille de l'infarctus n'a pas été influencé par le traitement. Transplantation HGF-transfectées myoblastes après un IM peut limiter le développement de la dysfonction ventriculaire. Scaffold-thérapie à base en combinaison avec la thérapie génique accélère cette capacité. Cette amélioration hémodynamique est accompagné par une néovascularisation, mais pas par la taille d'infarctus plus petits.
