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Articles by Carol Kreader in JoVE
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Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID
La Biblioteca ID di destinazione รจ un plasmide-based, genome-wide collezione di cDNA clonati utilizzati per identificare gli obiettivi miRNA. Qui mostriamo il suo utilizzo ed applicazione.
Other articles by Carol Kreader on PubMed
Isolamento E Caratterizzazione Di Un Gene Di Proteina Ribosomiale Crassa Della Neurospora Omologo a CYH2 Di Lievito
Abbiamo isolato e caratterizzato un Neurospora crassa gene omologo al gene CYH2 lievito codifica L29, una proteina che conferisce sensibilità cicloeximide dei ribosomi citoplasmatici. Da cross-ibridazione a CYH2 è stato isolato il gene clonato Neurospora. Esso è stato sequenziato da cDNA e cloni genomici. La regione codificante è interrotto da sette sequenze intermedie. La sequenza aminoacidica dedotta Mostra omologia di 70% a quello del lievito proteina ribosomiale L29 e 60% omologia a quella della proteina ribosomiale mammiferi L27', suggerendo che la proteina ha un ruolo importante nella funzione ribosomiale. Il modello di utilizzo del codone è altamente polarizzato, coerente con l'efficienza alta traduzione. C'è una sola copia del gene in N. crassa, e R. Metzenberg ed i colleghe hanno mappato la posizione genetica per la vicinanza del locus cyh-2.
Una Proteina Mitocondriale Da Neurospora Crassa Rilevato Su Ribosomi E Nelle Frazioni Di Membrana. Analisi Del Gene, Il Messaggio E La Proteina
Abbiamo isolato cloni che rappresenta almeno tre geni nucleari per le proteine ribosomiali mitocondriale da Neurospora crassa di screening di una libreria di cDNA lambda gt11 con un antisiero contro una miscela di queste proteine. Il cDNA e sequenze di DNA genomica per uno di questi geni, mrp-3, è stato determinato. La proteina MRP3 è stata purificata mediante cromatografia di affinità immunitaria, utilizzando una sonda di anticorpi monoclonali e sottoposti ad analisi di sequenza dell'amminoacido per identificare il terminus amminico maturo e un potenziale mitocondriale-targeting presequence. MRP3 è stato identificato come il più grande, almeno di base proteica rilevata dalla piccola subunità dei ribosomi che era stato lavato dal sale e frazionato su gradiente di saccarosio. Tuttavia, i prodotti mRNA e proteina mrp-3 sono stati trovati per essere presenti in eccesso rispetto a quelli di altri geni di proteina mitoribosomal di N. crassa. Usando una soluzione ibridazione/S1 nucleasi analisi, abbiamo trovato tre volte di più mRNA per mrp-3 rispetto per un altro gene della proteina ribosomiale-mito. Inoltre, un eccesso di 30 a 50 volte di non-ribosomal proteina MRP3 è stato scoperto. La proteina supplementare è stata localizzata nelle frazioni di membrana mitocondriale; nessuno è stato rilevato nelle frazioni di matrix dopo la rimozione dei ribosomi. Una proteina immunologicamente correlata è stata rilevata in frazioni ribosoma e membrana dei mitocondri da Saccharomyces cerevisiae. Il significato funzionale di questa doppia localizzazione resta un enigma.
Progettazione E Valutazione Di Bacteroides DNA Sonde Per Il Rilevamento Specifico Di Inquinamento Fecale Umana
Perché i Bacteroides spp sono obbligano anaerobi che dominano la flora fecale umana, e perché alcune specie possono vivere solo nell'intestino umano, questi batteri potrebbero essere utili distinguere umano da nonhuman fonti di inquinamento fecale. Per verificare questa ipotesi, gli iniettori di PCR specifici per sequenze di geni 16S rRNA di Bacteroides distasonis, b. thetaiotaomicron e b. vulgatus sono stati progettati. Ibridazione con sonde interne specie-è stato utilizzato per rilevare i prodotti di PCR previsti. Estratti da 66 noti ceppi di Bacteroides, che rappresenta 10 specie correlate, sono stati utilizzati per confermare la specificità di queste analisi PCR-ibridazione. Per verificare la specificità nelle feci, le procedure sono state sviluppate per preparare il DNA di purezza sufficiente per la PCR. Estratti di feci da 9 degli esseri umani e non 70 umani (gatti, cani, bovini, maiali, cavalli, pecore, capre e polli) erano ciascuno analizzato con e senza un controllo positivo interno per verificare che l'amplificazione di PCR non era inibito da sostanze nell'estratto. Inoltre, diluizioni seriali di ogni estratto che risultati positivi sono stati dosati per stimare l'abbondanza relativa di destinazione Bacteroides spp. nel campione. A seconda del set di primer-sonda utilizzato, oppure 78 67% degli estratti fecali umani testati avevano alti livelli di DNA dell'obiettivo. D'altra parte, solo il 7-11% dei non umani estratti testati similmente avevano alti livelli di DNA dell'obiettivo. Un 12-20% dei non umani estratti avevano livelli di target DNA che erano 100 - a 1,000 volte inferiori a quelli trovati in esseri umani.(ABSTRACT TRONCATO A 250 PAROLE)
Rilievo Di Inibizione Di Amplificazione Di PCR Con Albumina Di Siero Bovino O Della Proteina Del Gene 32 T4
I vantaggi dell'aggiunta di albumina di siero bovino (BSA) o T4 gene proteina 32 (gp32) di PCR sono stati valutati con miscele di reazione contenenti sostanze che inibiscono l'amplificazione. Considerando che FeCl3 più a 10 - a 1,000 volte, Emina, fulvico acidi, acidi umici, acidi tannico o estratti dall'acqua, acqua dolce o Marina di feci, sono stati accomodati nella PCR quando entrambi 400 ng di BSA per microl o 150 ng di gp32 per microl è stato incluso nelle reazioni, BSA né gp32 interferenza alleviato significativamente quando livelli minimi inibitori della bile sali, bilirubinaErano presenti EDTA, NaCl, solfato dodecilico di sodio o Triton X-100. Uso di BSA e gp32 insieme non offerto alcun sollievo più di inibizione rispetto sia solo al suo livello ottima, e né proteine ha avuto alcun effetto notevole sull'amplificazione in assenza di inibitori.
Persistenza Di PCR-rilevabile Bacteroides Distasonis Da Feci Umane in Acqua Di Fiume
Per valutare la persistenza della PCR-rilevabile Bacteroides distasonis nelle acque superficiali, feci tutta umane furono dispersi nell'acqua dal fiume Ohio e incubate in beute in laboratorio o in camere di diffusione in situ. Ogni giorno sono stati prelevati campioni duplicati, e materiale che stabulato a 16.000 x g è stata analizzata mediante PCR. Persistenza del DNA PCR-rilevabili da questo anaerobe dipendeva dalla temperatura e predazione, due dei fattori mostrati da altri ad influenzare la sopravvivenza dei batteri aerobi rilevato dalla cultura. B. distasonis è stato rilevato mediante PCR per almeno 2 settimane a 4 gradi C, ma solo per 4-5 giorni a 14 gradi C, 1-2 giorni a 24 gradi C e 1 giorno a 30 gradi C. In acqua filtrata o in presenza di cicloeximide, un inibitore eucariotico, persistenza a 24 gradi C è stata estesa da almeno una settimana.
