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Articles by Celia Keim in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B
1Department of Microbiology and Immunology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University
Un efficiente sistema di struttura e analisi funzionale di un gene in un
Other articles by Celia Keim on PubMed
Inibizione Dell'interleuchina-6 Espressione Dalla Proteina V Di Virus Parainfluenzali 5
La proteina V di virus parainfluenzali 5 (PIV5) svolge un ruolo importante nell'evasione della risposta immunitaria ospite. La proteina V blocca l'interferone (IFN) in cellule umane di segnalazione provocando la degradazione della proteina STAT1, un componente chiave di IFN di segnalazione e produzione di blocchi IFN-beta da prevenire la traslocazione nucleare di IRF3, un fattore di trascrizione chiave per l'attivazione di promotore di IFN-beta. Interleuchina-6 (IL-6), insieme al fattore di necrosi tumorale (TNF)-Alfa e IL-1beta, è una citochine proinfiammatorie principali che svolge ruoli importanti in compensazione l'infezione del virus attraverso le risposte infiammatorie. Molti virus hanno sviluppato strategie per bloccare l'espressione di IL-6. Infezione PIV5 selvaggio-tipo induce poco, se del caso, espressione di citochine come IL-6 e TNF-alfa, considerando che l'infezione da un dominio ricco di cisteina mutante PIV5 manca il C-terminale conservato (rPIV5VDeltaC) indotta da alti livelli di espressione di IL-6. Esame dei livelli di mRNA di IL-6 ha indicato che l'attivazione della trascrizione di IL-6 ha giocato un ruolo importante nell'aumentata espressione di IL-6. Co-infezione con selvaggio-tipo PIV5 impedito l'attivazione della trascrizione di IL-6 da rPIV5VDeltaC, e un plasmide codifica per la proteina PIV5 V full-length ha impedito l'attivazione di IL-6 espressione del gene reporter promotore-guidato da rPIV5VDeltaC, che indica che la proteina V ha svolto un ruolo nell'inibire la trascrizione di IL-6. L'attivazione di IL-6 è stato indipendente di IFN-beta, anche se rPIV5VDeltaC-cellule infette prodotto IFN-beta. Utilizzando dosaggi gene reporter e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), si è constatato che la NF-kappaB ha giocato un ruolo importante nell'attivazione di espressione di IL-6. Abbiamo proposto un modello di attivazione e inibendo la trascrizione di IL-6 da PIV5.
Un Singolo Amminoacido Residui Cambiamento Nella Proteina Del Virus Parainfluenzale 5 P Eleva L'espressione Del Gene Virale
Parainfluenza virus 5 (PIV5) è un prototipo paramixovirus. Il gene V/P del PIV5 codifica per due specie di mRNA attraverso un processo di inserimento di pseudotemplated dei residui due G presso un sito specifico durante la trascrizione, con conseguente due proteine virali, V e P, cui termini N dei residui dell'amminoacido 164 sono identici. In precedenza è stato riferito che la mutazione di sei residui dell'amminoacido all'interno di questa regione identica risultati in un PIV5 ricombinante (rPIV5 - CPI-) che esibisce l'espressione della proteina virale elevato e induce la produzione di citochine, come l'interferone beta e interleuchina 6. Perché sei mutazioni corrispondono alla regione condivisa della proteina V e la proteina P, non è chiaro se i fenotipi associati rPIV5-CPI-sono dovute alle mutazioni della proteina P e/o mutazioni della proteina V. Per rispondere a questa domanda, abbiamo utilizzato un sistema di minigenome e virus ricombinanti per studiare gli effetti delle mutazioni sulle funzioni delle proteine P e V. Abbiamo trovato che la proteina P con sei modifiche residui dell'amminoacido (Pcpi-) era più efficiente di selvaggio-tipo P facilitando la replica di RNA virale, mentre la proteina V con sei modifiche residui dell'amminoacido (Vcpi-) inibisce ancora replica minigenome come fa la proteina V wild-type. Questi risultati indicano che espressione del gene virale elevata nelle cellule rPIV5-CPI-infetti può essere attribuita ad una proteina P con un'aumentata capacità di facilitare la sintesi di RNA virale. Inoltre, abbiamo trovato che una singolo amminoacido residui modifica alla posizione 157 della proteina P da Ser (il residuo nella proteina wild-type P) a Phe (il residuo in Pcpi-) è sufficiente per l'espressione del gene virale elevato. Mediante spettrometria di massa e l'etichettatura di P (33), abbiamo trovato che quel residuo S157 della proteina P è fosforilato. Basato su questi risultati, proponiamo che la fosforilazione del P proteina al residuo 157 svolge un ruolo importante nella regolazione della replicazione virale RNA.
Il RNA Exosome Obiettivi La Deaminasi Della Citidina Aiuti a Due Filoni Di Trascritti Substrati Duplex Di DNA
Deaminasi attivazione indotta citidina (aiuto) avvia immunoglobuline (Ig) catene pesanti (IgH) classe switch ricombinazione (CSR) e Ig regione variabile ipermutazione somatica (SHM) nei linfociti B deammina cytidines sul modello e non template ciocche di substrati DNA trascritti. Tuttavia, il meccanismo di accesso aiuti a filo del DNA template, particolarmente quando ibridato a una trascrizione di RNA nascente, è stato un enigma. Abbiamo ora coinvolgono il RNA exosome, un complesso RNA-elaborazione/degradazione cellulare, in aiuto di targeting di due filamenti di DNA. In cellule di lignaggio B attivate per la RSI, il RNA exosome associa gli aiuti, si accumula sulle regioni switch IgH in maniera aiuto-dipendente ed è necessaria per la RSI ottimale. Inoltre, sia il cellulare RNA exosome complesso e un nucleo di exosome RNA complesso ricombinante impartire deaminazione DNA robusto aiuto - e trascrizione-dipendente di due fili di substrati SHM trascritti in vitro. I nostri risultati rivelano un ruolo per macchinari di sorveglianza RNA non codificante nel generare diversità dell'anticorpo.
