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Articles by Charles L. Limoli in JoVE
JoVE Clinical and Translational Medicine
頭蓋放射線療法によって引き起こされた認知機能障害の回復のための細胞移植戦略を幹
Department of Radiation Oncology, University of California Irvine
脳腫瘍の患者は定期的、および認知機能障害を衰弱に有益な、この治療法はしばしば結果ながら、頭蓋放射線治療を受ける。この重大な未解決問題は、現時点では臨床的遡求権を持たず、放射線誘発認知減分を回収するための幹細胞ベースの治療法を考案する努力を推進してきました。
JoVE Clinical and Translational Medicine
頭蓋放射線療法によって引き起こされた定量認知デクリメント
Department of Radiation Oncology, University of California Irvine
脳腫瘍の放射線治療管理に起因する認知機能障害に悪影響生活の質に影響を与える臨床的に難治性の状態を表します。批判的に放射線誘発性認知デクリメントを改善するための潜在的な介入を評価する能力は、最終的に認知の厳格な定量的な評価を実施する能力に依存します。
Other articles by Charles L. Limoli on PubMed
色素性乾皮症バリアントにおけるUV誘発複製停止は、DNA二重鎖切断、γ-H2AX形成とMRE11再局在化に導く
はなく、正常細胞では色素性乾皮症バリアント（XPV）のUV-誘発複製停止が停止複製フォークのサイトで大規模な核内フォーカスにMre11/Rad50/Nbs1複雑であり、リン酸化ヒストンH2AX（γ-H2AX）の蓄積につながる。これらの錯体は、特に、二重鎖切断（DSBが）で、DNA損傷の存在を示すことが示されている。この知見は、紫外線によるダメージは、レプリケーション停止の過程でDSBの形成につながることを示唆している。 UV照射後、XPV細胞はMRE11病巣の生産と平行してγ-H2AX病巣の収率のフルエンス依存性の増加を示した。病巣陽性細胞の割合がより高いフルエンスで飽和する前に、10 J.（-2）のフルエンスに（10-15％）、急速に増加した。 γ-H2AXとMRE11病巣の頻度は、両方のUV照射後4時間で最大値に達した。このパターンは、γ-H2AX病巣のピークレベルが数時間でMRE11病巣の形成に先行することが判明したX線照射後に観察された状況に対照的。 γ-H2AXとMRE11の核分布は、UV-はなく、X線照射した後に空間的に局在が認められた。 UV照射XPV細胞はMRE11とγ-H2AX病巣陽性細胞の間に一対一の対応を示した。これらの結果は、XPV細胞が紫外線によって誘発される複製停止の過程でDNAのDSBを開発することを示している。これらのUV-誘発性病巣は紫外線によるダメージの効率的なバイパス·複製を行うことができませんし、さらに遺伝的多様性に貢献するかもしれない細胞で発生します。
放射線誘発ゲノム不安定性のバイスタンダー効果
X線にGM10115ハムスター - ヒトハイブリッド細胞の曝露は、生存細胞の子孫の染色体不安定性の誘導になる可能性があります。この不安定性は、 "マーカー"ヒト染色体を含むユニークな細胞遺伝学的再構成を持つ細胞の新規のサブ集団のダイナミックな生産として現れる。我々は、染色体再配列のソースを提供するため、観察され永続的な不安定性を考慮しなかった染色体不安定なクローンにおける内因性DNA切断の上昇があったかどうかを調べるためにコメットアッセイを使用しています。我々の結果は、非照射と放射線誘発染色体不安定なクローン間の彗星の尾の測定に有意差を示さない。我々はまた、GM10115細胞内の間テロメアリピート様配列を含む組換えイベントはランダムプロセスよりも高い周波数で関与していたかどうかを調べたin situハイブリダイゼーションの2色の蛍光を使用すると、そうでなければ予測する。 11クローンのナインは、ヒトおよびハムスターの染色体間の組換え接合で、これらの間テロメアリピート様配列の予想よりも有意に高い関与を示した。内因性の休憩の上昇レベルが不安定なクローンが検出されなかったので、私たちは不安定な表現型を永続させる組換え経路の活性化へのエピジェネティックなまたはバイスタンダー効果（BSEs）のリード線を提案する。具体的には、放射線は活性酸素種（ROS）の産生を刺激する条件および/または因子を誘導するという仮説に展開します。これらの反応中間体は、複数の世代にわたってサイクルは、染色体の組換えとゲノム不安定性に関連付けられた他の表現型を促進することが慢性的なプロオキシダントの環境に貢献しています。
染色体不安定細胞における持続的酸化ストレス
人間ハムスターハイブリッドラインGM10115を使用して、過去の作品は、DNA損傷剤の様々な暴露は染色体の永続的な不安定化につながることが実証されています。不安定な表現型を永続させるに関与する潜在的な生化学的メカニズムへの洞察を得るために、安定または不安定を特徴とクローンのグループは、酸化ストレスの兆候を分析した。クローンのすべてが電離放射線や化学物質への暴露を生き残った、単一の前駆細胞から派生したものです。蛍光染料を酸化する能力を強化する能力によって測定された彼らの安定した対応と比較して、不安定なクローンは活性酸素種の上昇（ROS）を持っていた。 7'-dichlorodihydrofluorescein、 '（および-6） - クロロ-2 - 蛍光色素5から派生した不安定なクローンが有意に高く、約2倍と約1.25倍、それぞれの蛍光シグナルを意味したことが示された自動化セルソーティング分析アセテートおよびジヒドロ123、それぞれ。ミトコンドリアは、細胞の安定性と不安定なクローンはノニルアクリジンオレンジ及びローダミン123を使用して関数を使用して、ミトコンドリアのコンテンツを分析したROSの潜在的なソースを構成する可能性があるかどうかを決定します。蛍光自動細胞ソーティングのデータは安定したクローンと比較して、不安定なクローンが機能不全ミトコンドリア（平均ローダミン123蛍光の27％減）の上昇数（平均ノニルアクリジンオレンジ蛍光の15％増）と有することが示された。興味深いことに、上昇ROSの結果は核DNAの酸化的塩基損傷の増加に翻訳していませんでした。ガスクロマトグラフィー/質量分析法による9つの異なる基本ダメージ付加体の分析は、安定と不安定なクローン間に有意差は認められなかった。データは、ゲノムの不安定性に関連付けられている異常な表現型の多くの永続化は機能不全ミトコンドリアから部分的に派生した慢性的な酸化ストレスの状態にリンクされていることが示唆された。
慢性的な酸化ストレスによる染色体不安定性の誘導
GM10115細胞を用いた以前の研究では、ゲノムの不安定性を誘導するために別のDNA損傷剤の能力を分析し、急性酸化ストレスは、染色体の永続的な不安定化を誘発するで比較的効率の悪いことがわかった。このような状況が慢性暴露条件下で変更するかどうかを判断するために、ヒトハムスターハイブリッドラインGM10115は、酸化ストレスの条件下で培養した。 10から30の連続した日間毎日一回投与した濃度は、慢性的治療は、過酸化水素の範囲（25から200マイクロモル）またはグルコースオキシダーゼを（5-50をmU / mlでGO）を使用して、1時間のインキュベーションで構成されていた。慢性的な治療の毒性は控えめだった（ - つのログを殺す）と最初の分裂異常（<5％）の収率が低いと一致しています。しかし、180以上のクローンと36000分裂の分析は、慢性的な酸化ストレスが染色体不安定性の発生率が高いにつながったことが示された。 100と200マイクロモルの過酸化水素または50 MU / mlのGOの細胞の治療が11％に染色体不安定性を引き出すことが判明した、22％、およびクローンの19％は、それぞれ分析した。対照的に、モック治療後に単離されたコントロールのクローンは染色体の不安定化の兆しを見せませんでした。これらのデータは、慢性的な酸化ストレスが細胞のゲノムの完全性を破壊することができる生化学的メカニズムを構成していることを示唆している。
神経前駆細胞の放射線応答：細胞周期チェックポイント、アポトーシスと酸化ストレスに対する細胞の感度のリンク
脳の治療照射が神経新生の欠陥を含むことができる進歩的な認知機能障害を引き起こす可能性があります。放射線誘発幹細胞の機能不全のメカニズムを理解するために、成体ラットの海馬から単離された神経前駆細胞は、アポトーシスと活性酸素種（3から33日）（0-24 h）は、急性および慢性の変化を分析した（ X線への曝露後ROS）。照射された神経前駆細胞は、3から4週間にわたって持続ROSの増加を伴う急性の用量依存性のアポトーシスを示した。放射線の影響が増加しTrp53リン酸化と関連していた細胞周期チェックポイントの活性化とTrp53およびp21（CDKN1A）蛋白質のレベルが含まれています。 in vivoで、海馬歯状下帯内の神経前駆細胞は放射線に大きな感度を示した。増殖前駆細胞およびその子孫（すなわち、未熟なニューロン）の細胞数の用量依存的な減少を示した。これらの減少は、アポトーシスの混乱が原因の可能性があり、Trp53欠損マウスで少なかった。これらのデータは、アポトーシスとROS応答は細胞周期の制御とストレス活性化経路のTrp53依存規制に縛られることを示唆している。 in vitroおよびアポトーシスのin vivo測定の間の時間的な偶然の一致では、酸化ストレスが認知障害の開発におけるニューロン新生の放射線誘発阻害のメカニズムの説明を提供することを示唆している。
海馬ニューロン新生の指標は、用量依存的に56Fe粒子照射により変更される
高LET放射線にさらされる宇宙飛行士の健康へのリスクは可能な認知障害が含まれています。放射線誘発認知障害の病因は不明であるが、海馬歯状回の下帯（SGZ）から神経前駆細胞の損失を伴うことがあります。この仮説に対処するために、成人女性C57BL / 6マウスでは0、1、2、3 Gyの単分の1 GeVの/核鉄粒子ビームで全身照射を受けた。二ヶ月後にマウスは、増殖細胞を標識するためにBrdUの注射を与えられた。その後、海馬組織は、増殖細胞と未熟な神経細胞の検出のための免疫組織化学を用いて評価した。ルーチン病理組織学的方法は、質的に海馬および隣接地域で組織/細胞形態を評価するために使用されました。対照と比較した場合、放射線照射したマウスは投与量の関数として徐々に少なくなりBrdU陽性細胞が認められた。この観察は用量依存的減少を示すSGZでのKi-67免疫染色によって確認した。増殖SGZ細胞の子孫、すなわち未熟な神経細胞は、染色をdoublecortinによって可視化し、大幅に3照射後1照射後の34パーセントから71パーセントまで減少すると、照射により減少した。病理組織学的にはSGZの細胞の変化に加えて、（56）Fe粒子は、慢性、びまん性星状細胞と海馬とその周辺の錐体ニューロンの変化を誘導することが明らかになった。現在のデータは、高LET放射線は海馬の神経新生に関連付けられている細胞に及ぼす有害な影響を持っている最初の証拠を提供しています。
神経前駆細胞の機能の細胞密度依存的な調節
海馬歯状回の下帯から神経前駆細胞のストレス誘発性の減少は、障害神経と認知機能障害にリンクされている。 CNS内に複数の損傷応答経路の調節におけるレドックス状態の重要性に鑑み、我々は酸化ストレスが神経や細胞傷害/枯渇した後、その後の認知機能に影響を与えることに大きな役割を果たしていると仮定した。 in vitroの系を使用して、我々は他のプライマリおよび形質転換細胞株と比較した場合、細胞密度の変化に決定的に依存する活性酸素種（ROS）のレベルは、神経前駆細胞で有意に高かったことを示した。 ROSは、低（<1×10（4）cm当たり細胞（2））と、高密度（> cmあたり1×10（5）細胞（2））の条件下で（約4倍）が有意に上昇していた。低い細胞密度で見つかった高いROSレベルは上昇の増殖と代謝活性の増加と関連していた。これらROSは、おそらく最終的に細胞の増殖速度を侵害している改変されたミトコンドリア機能の結果であった。高い細胞密度で、細胞内ROSと酸化的損傷はミトコンドリアスーパーオキシドジスムターゼ2の発現増加と協調して減少した。私たちは、マウスの下帯における神経前駆細胞のDNA損傷誘発性の枯渇にも増加したROSと変更された増殖は、in vitroシステムで私たちの検証につながったことを発見。 in vitroおよびin vivoの両方の前駆細胞数の減少と関連して増加したROSと増殖は、酸化防止剤α-リポ酸と逆転させることができる。これらのデータは、神経前駆細胞が中枢神経系の損傷後の細胞増殖を制御するレドックス感受性の経路を制御する微小環境の手がかりにかかりやすいことがわかった。
UV照射XPバリアントの細胞における組換えの代替経路
XPバリアント（XP-V）細胞が損傷特異的ポリメラーゼηを欠いているとUV光生成の障害迂回のためにUV照射後の長期複製停止を示す。逮捕された複製フォークの結果を分析するには、相同組換え（HR、Rad51のイベント）とフォークの破損（RAD50イベント）病巣陽性細胞の免疫蛍光検出によって測定した。どちらの細胞型は、RAD50巣の増加を示しながら、照射1時間以内に、XP-V細胞は、正常細胞よりもRad51の陽性細胞が認められた。 1時間を超えて、Rad51の陽性細胞の頻度は高いUV用量で減少し、両方の細胞型で同様のレベルに達した。これらの後の回で、RAD50-陽性細胞は用量とし、XP-V細胞の大きい程度に増加した。いくつかの細胞は、組換えタンパク質の相互に排他的な採用を示唆して、病巣の両方のセットを同時に陽性であった、またはこれらの経路は、S期の異なる段階で動作すること。タンデムに配置され強化された緑色蛍光タンパク質遺伝子のベクターを含む細胞の分析はまた、UV-誘発HRは、XP-V細胞で高いことを示した。これらの結果は、細胞はHRへの早期取り組みを行うことを示唆していること、およびそれ以降の時間に逮捕されたフォークのサブセットは、二重鎖切断、XP-V細胞に大きく二つの代替経路に低下します。
250 MeVの陽子への曝露後に神経前駆細胞における活性酸素種の効率的生産
宇宙放射線環境は、宇宙飛行士への潜在的な健康リスクの範囲をもたらすプロトンによって支配非常に高エネルギーイオン、構成されています。特定の組織を介してこれらの粒子のトラバーサルは、生存率および/または海馬の歯状下帯内に存在する神経前駆細胞を含む感受性細胞の機能が損なわれる可能性があります。照射が生体内でこれらの細胞を枯渇させることが示されており、これらの重要な細胞の減少は、神経と認知を損なうと考えられている。より完全に照射した後、これらの前駆細胞の挙動のメカニズムを理解するために、我々はin vitroで神経前駆細胞系で開発され、ROSの急性（0から48 h）の変化とミトコンドリアのエンドポイントを評価するためにそれを使用しているのブラッグ暴露後250 MeVのピーク陽子。相対的なROSレベルは、非照射コントロールと比較してほぼすべての用量（1〜10 Gy）を照射後と時間（6月24日h）で増加した。プロトン照射後のROSの増加は、X線で観察されたものよりも急速であった、6時間および24時間目に、明確に定義された用量反応を示し、それぞれ約10％、グレーあたり3％を増加します。しかし、48時間照射後で、ROSレベルは、コントロールの下に落ち、ミトコンドリアの含有量のわずかな減少と一致した。酸化防止剤α-リポ酸（照射前または後）の使用は、ROSレベルの放射線誘発の上昇を排除することが示された。我々の結果はX線を用いた以前の研究を裏付けると上昇したROSは神経前駆細胞のradioresponseに不可欠であるというさらなる証拠を提供しています。
高LET放射線では、海馬ニューロン新生のマーカーにおける炎症および永続的な変化を誘導
重イオン放射線への暴露は長期的な宇宙旅行の潜在的な健康リスクと見なされます。それは最終的にミッションの目標と生活の長期的な品質を損なう可能性のあるパフォーマンスをデクリメントにつながる可能性があり、中枢神経系（CNS）、のような複雑なシステムの重要な細胞成分が失われる場合があります。特定の海馬依存の認知障害は、全身56Fe粒子照射後に発生し、この効果の病因はまだ明確ではないですが、それが海馬歯状回における神経前駆細胞への損傷を伴うことがあります。我々は歯下帯（SGZ）の12Cまたは56Feイオン1-3 Gyの9ヵ月後に定量化し増殖細胞と未熟な神経細胞を照射したマウス。我々の結果は、これらの細胞の減少は用量に依存していたことが明らかになったとしましょう。 56Fe粒子照射後3ヶ月を検討したマウスのデータと比較すると、私たちの現在のデータは、これらの変更だけで永続的ではありませんが、時間とともに悪化することが示唆された。前駆細胞の損失も変更された神経と強固な炎症反応と関連していた。これらの結果は、高LET放射線は微小で、セルの損失や変更を伴う海馬の神経人口に大きな影響と長期的な効果を有することを示している。
神経前駆細胞の放射線応答
かなりのデータは、哺乳類の脳のニューロン新生部位に存在する神経前駆細胞の放射線応答性に関する利用可能になりました。これらの細胞とその子孫は、あからさまな組織損傷が発生しない臨床的に関連のある投与後のアポトーシスを受けて、照射に極めて敏感である。さらに、その放射が大幅に神経新生のプロセス全体に影響を与え、感度は前駆細胞が存在する内微小環境の変化に、少なくとも部分的に依存していることを説得力のある証拠がある。挑発的なデータは、炎症、酸化ストレス、または形態学的関係に影響を与える神経を示唆して存在しますが、関係する正確なメカニズムは不明のまま、調査する必要があります。さらに、これらの知見は、頭蓋内疾患の治療に伴う放射線パラダイムのコンテキストで意味するかもしれないか理解しようとすることが重要です。神経前駆細胞は侵害刺激に応答する方法を理解することは、神経新生を復元し、おそらく認知能力を改善すべき新しい治療法につながる可能性があります。
微小環境における細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（EC-SOD）の欠如は、神経発生における放射線誘発の変更に影響を与える
認知障害に関連付けられている海馬の神経新生における重要な変化の電離放射線照射の結果。そのような効果は神経細胞が存在する内微小環境の変化によって、部分的に、影響を受けています。神経新生に影響を与える可能性が1つの重要な要因は、酸化ストレスであり、この研究は、次の場合に、どのようにスーパーオキシドジスムターゼの細胞外アイソフォーム（SOD3、EC-SOD）を介した放射線誘発変異神経細胞内で決定するために行われました。野生型（WT）およびEC-SODノックアウト（KO）マウスは、5 Gyの急性（8から48時間）細胞の変化と神経の長期変化定量化した照射した。急性放射線応答は、EC-SODの有無は、照射後の急性細胞死の責任のメカニズムに影響を及ぼさなかったことを示唆し、遺伝子型間で差は認められなかった。一方、神経新生の程度はWT対照と比較して非照射KOマウスでは39％減少した。神経が照射後にWTマウスでは約85％減少した一方これとは対照的に、神経発生における実質的削減はKOマウスで観察されなかった。これらの知見は、照射後、EC-SODを欠いている環境では、海馬の神経新生のコンテキストでは、はるかに寛容であることを示している。この知見は、頭蓋照射後の認知機能障害を軽減する開発戦略に大きな影響を与える可能性があります。
過酸化水素を仲介する哺乳動物細胞における放射線誘発突然変異誘発遺伝子の表現型
慢性的な酸化ストレスは、電離放射線への暴露後にゲノム不安定性に関連付けられている。ただし、特定のROS（活性酸素種）と電離放射線誘発ミューテーター表現型の間の直接的な因果連関を示す結果が不足している。本研究では、電離放射線誘発ゲノム不安定な細胞（染色体不安定性と変異および遺伝子増幅の周波数の増加によって特徴づけられる）を示して過酸化水素の定常状態レベルの3倍の増加を示しているが、スーパーオキシドはありません。さらに、並列の研究から分離された安定したクローンは、カタラーゼとGPX（グルタチオンペルオキシダーゼ）活性の有意な増加を示した。 PEG-CATで不安定な細胞（ポリエチレングリコールコンジュゲートカタラーゼ）の治療は用量依存的に突然変異頻度と突然変異率を減少させた。さらに、（3 - アミノトリアゾール）にして安定なクローンを阻害カタラーゼ活性は、変異の頻度と速度を増加させた。これらの結果は明らかに過酸化水素と電離放射線への哺乳動物の細胞の曝露後に多くの世代のために持続するミューテーター表現型によって媒介される慢性的な酸化ストレスとの因果関係を示しています。
改変された浸透圧により誘起されるクロマチン構造の変化に対応したヒストンH2AXのリン酸化
DNA鎖切断は、ヒストンH2AX（すなわちγ-H2AX）のマークされたリン酸化を引き起こす。 DNA二重鎖切断（DSBが）このイベントのために強い刺激を提供しますが、クロマチンの構造変化に伴うには、γ-H2AXを誘発し、実際の信号を表すことができる。我々のデータは、クロマチン構造の変化は、DNA鎖切断の相対的な欠如の広範なγ-H2AX形成を誘発するのに十分であることを示している。細胞は80から200のDNA DSBが（つまり2から5 Gy）での誘導後に発見されたものと同等である低張（0.05 M）治療展示γ-H2AXレベルに供した。リン酸化のこの大幅な増加にもかかわらず、細胞の生存率（<10％の細胞毒性）は比較的影響を受けないままであり、アポトーシスの有意な増加はありません。核染色プロファイルには、γ-H2AX陽性細胞が均一にパン染色からのDNA鎖切断のより多くの特性の離散点状の巣に至るまで、染色の変化した等張の展示変数レベルで誘導されることを示しています。 DNA鎖切断の相対的な不在下で変更された等張の下に重要なγ-H2AX形成を誘導する能力は、このヒストン修飾は、クロマチン構造の変化に応じて進化したことを示唆している。
グルタミン酸システインリガーゼの過剰発現は、酸化とガンマ放射線誘発細胞死に対するヒトCOV434顆粒腫瘍細胞を保護
電離放射線は、卵巣の卵胞に対して毒性があると不妊を引き起こす可能性があります。活性酸素種（ROS）の生成は、いくつかの細胞型における電離放射線の毒性に関与している。我々は、保護である抗酸化物質のグルタチオン（GSH）の枯渇は、毒物誘発性のアポトーシスとGSHのその補充に毛包と顆粒細胞の感受性が示されている。 GSH生合成における律速反応は、触媒サブユニット（GCLC）と調節サブユニット（GCLM）で構成されてグルタミン酸システインリガーゼ（GCL）によって触媒される。我々は、GSH合成を増加させるGclcまたはGclmの過剰発現は酸化剤と放射線誘発細胞死に対する顆粒細胞を保護するという仮説を立てた。人間の顆粒腫瘍細胞のCOV434ラインが安定しGclc、Gclm、GclcとGclm両方または空ベクターの構成的発現用に設計されたベクターでトランスフェクトした。 GCLタンパク質と酵素活性と総GSHレベルは大幅にGCLサブユニットトランスフェクトした細胞で増加した。 GCL-トランスフェクトした細胞は、対照細胞と比較して過酸化水素で処理することにより細胞死滅に耐性であった。細胞の生存率は、対照細胞に比べて0.5 mMの過酸化水素処理した後、すべてのGCLサブユニットトランスフェクト細胞株で1から8 hを以下に減少しました。我々は次の電離放射線への応答にGCL過剰発現の影響を調べた。 ROSは、ガンマ線の0,1、または5 Gyを照射した細胞内のレドックス感受性の蛍光色素を用いて測定した。すべての細胞株において30分以内にROSの用量依存的増加、GCL-トランスフェクトした細胞で有意に減弱した効果がありました。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識およびイムノ活性化カスパーゼ3によって評価アポトーシスは、大幅に照射コントロール細胞に比べて照射Gclc-トランスフェクトした細胞で減少した。 Gclc-トランスフェクトした細胞のGSH合成の抑制は、放射線への耐性を逆転させた。これらの所見は、顆粒膜細胞におけるGCLの過剰発現はGSH合成を増大させると酸化ストレスと照射への曝露に関連する様々な後遺症を改善できることを示している。
神経前駆細胞と中枢神経系の放射線感受性
正常な脳組織の許容差は、頭蓋放射線治療中に安全に配信することができ、放射線量を制限し、発生する可能性が潜在的な合併症の一つは、認知障害を伴います。大規模な実験室のデータは、海馬の神経新生が有意に照射することにより、このような変更は、変更された認知機能と関連付けられ、一部には、微小環境の変化を（酸化ストレスと炎症）を含んでおり、その影響であることを示す最近登場しています。これらの変化が進化を正確に方法についてかなりの不確実性があるが、in vitroおよびin vivoのアプローチの新たな新しいメカニズムの洞察力がトピックに関連して得られることができる手段を提供してきました。一緒に、細胞培養および動物ベースの研究からのデータは頭蓋放射線治療の潜在的に重篤な合併症に関連する補足情報を提供し、全脳照射後の正常な脳の許容範囲の我々の理解を高める必要があります。
（137）Csで思春期後のマウスの全身放射線照射は、急性海綿骨と増加の破骨細胞のマイクロアーキテクチャを損なう
電離放射線は宇宙飛行士や放射線治療患者の長期的な健康を脅かす可能性があります実質的な組織の変性を引き起こす可能性があります。放射線の単回投与は、急性思春期後の骨格の構造の整合性を損なうかどうかを判断するには、18週齢の雄性マウス（137）Csのガンマ線（1または2 Gy）で暴露した。高離職率、海綿骨の構造はmicrocomputed断層撮影（microCT）3または10日間照射後、基底のコントロールで（照射時に採取した組織）と年齢の対照群で分析した。 1 Gyは10日後に28％の減少を引き起こしながら照射（2 Gyの）は、3日以内に脛骨海綿骨の体積分率（BV / TV）の20％の減少を引き起こし、10日以内に43％減少しました。 BV / TVデクリメントが増加間隔によるものであったと梁の厚さを減少させた。放射線も（約150％）増加した骨の表面は酒石酸耐性酸ホスファターゼ陽性破骨細胞、増加した骨吸収の指標と並ぶ。圧縮機械的特性が影響を受けなかったものの、放射線は、海綿骨の損失の永続性を示し、照射後の腰椎BV / TV 1ヶ月減少した。合計では、ガンマ放射線の単回投与は急速に骨組織と改造四肢と思春期後のマウスの中軸骨格で妥協海綿アーキテクチャにおける破骨細胞の表面を増加させた。
神経発生における放射線誘発減少はCuZnSODまたはMnSOD欠損マウスで改善される
電離放射線照射が大幅に海馬の神経新生に影響を与え、認知障害に関連付けられています。これらの効果が変更された微小環境によって影響を受ける可能性があります。酸化ストレスが神経新生に影響を与えることが示されている要因であり、そのようなストレスに対処する防御経路の一つが抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）を含む。本研究では、どのような影響に対処質の欠乏（SOD1）またはミトコンドリア（SOD2）SODは、海馬の神経新生に対する放射線の影響を持っています。野生型（WT）とSOD1とSOD2のノックアウト（KO）マウスは、5 Gyの単一のX線線量を受け、歯下帯で新しく生成された細胞の生存の定量化と表現型の運命は、2ヵ月後に行われた。放射線被ばくは、WTマウスでは神経新生を減少したが、神経のベースラインレベルは照射前のSOD KO株の両方で減少したものの、KOマウスでは明らかな影響を与えなかった。さらに、照射が新しく生成されたアストロサイトとミクログリアに影響を与える方法でWTとKO株の両方の間に顕著かつ有意差があった。これらの影響の責任はまだ知られていないメカニズム（S）が、in vitroの研究ではパイロットはスーパーオキシドの高いレベルの "保護"の効果を示唆している。全体として、これらのデータは、SOD欠乏の条件下では、神経新生、電離照射によりどのように影響されるか一般的な経路口述があることを示唆している。
ヒト胚性幹細胞の脳神経移植による放射線誘発性認知障害の救助
頭蓋照射は、腫瘍の成長を制御するための最前線の治療法のままとなり、そのような治療を生き残った人々はしばしば認知機能障害の様々な程度を明示する。特に脳、海馬の神経の領域に存在するそれらの幹/前駆細胞プールの放射線誘発枯渇、これらの頻繁に避けられない認知障害の原因であることが、一部には、信じられています。放射線誘発認知障害を改善する可能性を探るために、唯一の照射（10 Gy）を頭にかけ無胸腺ヌードラットは、海馬にヒト胚性幹細胞（hESCの）で2日後移植および幹細胞の生存、分化のために分析されたと認知機能。 hESCの移植を受けた動物は、ヒトES細胞を受信しませんでした、その照射された手術の対応に比べ、海馬依存性の認知タスク4ヶ月の照射後に優れた性能を示した。重要な幹細胞の生存率は1と4ヶ月の照射後、移植細胞で発見されたこの神経ニッチ内のニューロンの形態の兆候を示す、海馬歯状回にわたって下帯に堅牢な移行を示した。これらの結果は、ヒトES細胞を用いた放射線誘発正常組織の損傷を改善する能力を実証し、そのような戦略が認知に照射の副作用を軽減するための有用な介入を提供することを示唆している。
ミトコンドリア複合体II機能障害は、電離放射線への暴露後、ゲノム不安定性に大きく貢献できる
電離放射線は、H（2）O（2）によって媒介されるハムスター線維芽細胞の慢性代謝酸化ストレスとミューテーター表現型を誘導するが、Hの細胞内ソース（2）O（2）は、よく定義されていません。放射線誘発ミューテーター表現型におけるミトコンドリアの役割を決定するために、ミトコンドリア機能のエンドポイントは、10 GyのXにさらされたGM10115細胞に由来する不安定な（CS-9とLS-12）と安定した（114）ハムスター線維芽細胞株で決定された光線。照射後に単離した細胞株は、ミトコンドリア膜電位の20-40％の損失と親細胞株GM10115に比べてミトコンドリアの含有量の増加を示した。驚くべきことに、差はATP（P> 0.05）の定常状態レベルで観察されなかった。不安定なクローンが増加した酸素消費量（2〜倍、CS-9）を示し、および/またはミトコンドリアの電子伝達鎖（ETC）複合体IIの活性を（二重、LS-12）に増加した。ウエスタンブロット分析とブルーネイティブゲル電気泳動を用いて、複合体IIサブユニットBのタンパク質レベルの有意な増加がLS-12細胞で観察された。さらに、免疫沈降アッセイは、LS-12細胞の異常な複合体IIのアセンブリの証拠を明らかにした。 ETC複合体II（テノイルトリフルオロアセトン）の阻害剤とLS-12細胞の治療は、H（2）O（2）、変異頻度の50％の減少と同様に16％削減の定常状態レベルの有意な減少をもたらしたCAD遺伝子の増幅周波数インチこれらのデータは、放射線誘発ゲノム不安定性は、Hの増加、定常状態のレベル（2）増加した変異頻度と遺伝子増幅に寄与したO（2）につながるミトコンドリア機能障害の証拠を伴っていたことを示している。これらの結果は、複合体IIから発信されたミトコンドリアの機能不全は、活性酸素種の定常状態レベルを増加させることにより放射線誘発ゲノム不安定性に寄与することができるという仮説を支持している。
骨細胞における筋骨格系廃用との併用で（56）Feイオンへの全身曝露の短期効果
宇宙旅行と筋骨格系廃用による長期臥床の原因骨量の減少。体の組織を横断する荷電粒子は、細胞毒性および遺伝毒性病変の広い範囲を引き出すことができるのでスペースでは、放射線の分野でも有害な影響を与えることがあります。骨細胞や組織上の筋骨格系廃用との併用で重イオン放射線被曝の影響は知られていない。これを調べるために、正常にロードされた16週齢の雄性C57BL / 6マウスは、前に0 cGyで（偽）、10 cGyで、50 cGyで、または2 Gyの3日の用量で（1トロン/核子）（56）Feイオンにさらされた組織の収穫。追加のマウスは後肢無重力をシミュレートするために1週間連続して尾部の牽引によってアンロードと（56）鉄イオン放射（0 cGyで、50 cGyで、2 Gy）を組織の収穫前3日にさらされた。本研究の期間が短いにも関わらず、正常にロードされたマウスの低用量（10、50 CGY）照射は偽照射対照と比較し18％、近位脛骨の骨梁体積率（BV / TV）を減少させた。 50 cGyで放射線と一緒にアン後肢は、トラップの数（+）が正常にロードされ、偽照射コントロールとの相対的な海綿骨表面の破骨細胞の126％の増加を引き起こした。一緒に、放射線と後肢のアンロードは単独治療よりも抑制し骨芽細胞をex vivoに大きな影響を与えた。重イオンの合計が、低用量暴露で（50 CGY）後肢無負荷時のマウスでは正常にロードされたマウスと増加した破骨細胞数の急速な海綿骨の損失が発生しました。 in vitroでの照射でも正常にロードされたマウス由来の細胞に比べて後肢のアンロードされたマウスから回収された骨髄細胞の骨芽細胞へのより多くの有害であった。さらに、in vitroで照射重イオン照射でも骨芽細胞の存在下で破骨細胞の分化を刺激することができることを示す、RANKL（25 ng / ml）の存在下でのマクロファージ細胞株（RAW264.7）の破骨細胞形成を刺激した。したがって、重イオン放射線は急性海綿組織に破骨細胞数を増やすことができますと、筋骨格系廃用の条件下では、放射線の影響を、特にosteoprogenitorsでは、骨細胞の感受性を高めることができます。
衛星細胞の放射線感受性：細胞周期の調節、アポトーシスと酸化ストレス
骨格筋は、運動器官であり、彼らの成長、再生やメンテナンスには、衛星細胞と呼ばれる筋幹細胞の集団に大部分依存しています。骨格筋、これらの常駐筋幹細胞（すなわち、衛星細胞）は、一般的な診断手順中に放射線の有意な用量にさらされるおよび/または癌の放射線治療管理中にされています。本研究の主な目的は、衛星細胞の生存と増殖、細胞周期の調節、アポトーシス、DNA二重鎖切断修復、酸化ストレスとNO産生におけるγ放射線の臨床的に適切な用量の効果を検討した。全体として、我々の調査結果γ放射線≥5 Gyのその線量を示しては、一部には原因で上昇し、アポトーシスや細胞周期の進行の抑制に少なくとも70％の衛星細胞数を減少させた。放射線はまた、活性酸素と窒素種のレベルの重要かつ永続的な増加を引き起こすことが判明した。興味深いことに、と上昇酸化ストレスのこのような背景の中で、同様の用量は、一酸化窒素（NO）のレベルの大幅な削減を生成することがわかった。衛星細胞の増殖は、NOの生産に部分的に依存することが示され、我々の調査結果は、NO濃度の放射線誘発の減少はおそらくin vitroでの衛星細胞増殖の阻害のメカニズムと再生を提供することができるという可能性をもたらすされています骨格筋の臨床照射手順の間に公開されます。
ヒト神経幹細胞における電離放射線に起因する損傷の影響
頭蓋照射は、脳がんの最前線の治療法であるだけでなく、正常組織の損傷につながります。低線量照射（≤10 Gy）を最小限の組織病理学的変化を引き起こすが、それは神経幹細胞の枯渇に関連付けられている認知機能障害の可変度を引き出すことができます。解読するために放射線誘発幹細胞の機能不全、臨床的に関連する照射（0-5照射）に付し、ヒト神経幹細胞（hNSCs）の基礎となるメカニズムは生存パラメータが、細胞周期の変化、DNA損傷と修復、および酸化ストレスを分析した。 hNSCsが原因上昇アポトーシスおよびG2 / Mチェックポイントの遅延として現れ、細胞周期の進行の抑制に一部であった低線量照射に著しい感受性を示した。 DNA二重鎖切断の効率的な除去は、γ-H2AX核病巣の消失によって示された。酸化およびニトロソ化ストレスの用量応答性と永続的な増加は、おそらく照射hNSCs、生存細胞の割合が高い代謝活性の結果で発見された。これらのデータは、低線量照射にhNSCsの顕著な感度を強調表示し、神経幹細胞の機能が損なわれる可能性が放射線誘発酸化ストレスに起因する中枢神経系の微小環境におけるその長期的な摂動を示唆している。
筋骨格系廃用による酸化ストレスとガンマ放射線誘発性海綿骨の損失
無重力時の放射線に対する宇宙での宇宙飛行士の暴露は、その後の骨量の減少に貢献するかもしれない。思春期後のマウスのガンマ線照射は、急速に海綿組織における骨吸収破骨細胞と骨の損失の原因の数が増加し、同様の変化が酸化ストレスに関連付けられている骨格疾患で発生します。したがって、我々は、酸化ストレスを仲介する放射線誘発骨の損失と、その筋骨格系廃用性変化、放射線被曝に海綿状組織の感度を仮定した。後肢のアンロード（1または2週間）または4-MO歳、雄のC57BL / 6マウスの全身ガンマ線照射（CS（137）の1または2照射）による筋骨格系廃用近位脛骨のそれぞれ減少した海綿骨の体積分率と腰椎。脛骨と腰椎における放射線誘発急性海綿骨の損失の程度は、正常にロードされたと後肢-無負荷マウスでは同様であった。同様に、脛骨の破骨細胞の表面は後肢のアンロードの結果として、照射の結果として47％を46％増加し、照射の結果として64％+後肢が正常にロードされたマウスと比較してアンロードする。照射ではなく、後肢のアンロード、減少し生存率および骨髄細胞のアポトーシスの増加と石灰化組織内の脂質に酸化的損傷を引き起こした。照射はまた、骨髄細胞で活性酸素種の生成を刺激した。さらに、α-リポ酸、酸化防止剤の注入は、照射によって引き起こされる急性の骨の損失を軽減する。一緒に、これらの結果は、廃用やガンマ線照射、単独または組み合わせでは、急性の海綿骨の損失の類似度を発生し、増加した骨吸収の共通の細胞メカニズムを共有することが明らかになった。さらに、照射ではなく、廃用は、別の分子機構を示唆し、破骨細胞と増加活性酸素種の生産とそれに続く酸化的損傷による急性骨喪失の範囲の数を増やすことができます。 α-リポ酸は、照射の有害な影響から海綿組織を保護するという知見は、宇宙飛行士や放射線治療患者への潜在的な関連性を持っています。
衛星細胞は放射線にノーと言う
骨格筋は、一般的な診断手順や癌や異所性骨形成の治療のための放射線にさらされています。いくつかの研究が増殖するために（筋幹細胞）衛星細胞の能力に放射線の臨床用量の影響を考慮した、差別化と筋肉量を回復/維持に貢献しています。この研究の主な目的は、照射された衛星細胞の増殖が薬理学的アプローチとメカニカルストレッチ（NO濃度を増加さないことが知られている）を介してNOレベルを操作しないことによって救われることができるかどうかを判断することであった。我々は衛星細胞内NOレベルを操作しないようにSNP（NOドナー）とPTIO（NOスカベンジャー）の両方を使用していました。我々は、SNPが特に5 Gyを以下の用量で、照射された衛星細胞の増殖を救出に非常に有効であったことを観察した。 NOの潜在的重要性はさらに完全にSNPのレスキューの効果を阻害するPTIOの効果によって説明されました。機械的な周期的なストレッチは、照射衛星細胞のNO濃度の有意な増加を生成することが判明したが、これは衛星細胞増殖の堅牢な増加と関連していた。つのキー筋原性制御因子に対する放射線とNO（MyoDはとミオゲニン）の両方の効果も検討しました。衛星細胞の照射は、MyoDのとミオゲニンの両方で大幅に増加し、SNPを介してNOレベルを操作しないことによって軽減された効果を作り出した。衛星細胞の増殖と分化における筋原性制御因子の中心的な役割を与えられた、現在の研究の知見は、より完全に放射線、NOと衛星細胞の機能との関係を理解する必要性を強調。
ヒト神経幹細胞移植、放射線誘発性認知機能障害を改善する
頭蓋放射線療法は、部分的には、神経幹細胞の枯渇が原因である可能性があり認知の進行性衰弱減少を誘導する。放射線誘発認知低下が無胸腺ヌードラットを照射することによって解決された戦うための戦略として、幹細胞の置換を使用しての潜在的なヒト神経幹細胞（hNSC）と海馬内移植により2日後に続きます。認知能力、hNSCの生存、および表現型の運命の対策は、照射後1と4ヶ月の時点で評価した。 hNSCsを移植した照射動物が照射された、偽移植された動物よりも認知機能が有意に少ない減少を示し、非照射コントロールから何時の間にか行動した。公平な立体学は23％と移植細胞の12％がそれぞれ、移植後1〜4ヶ月生存したことを明らかにした。移植細胞はグリア細胞と神経系統に沿って分化し、広範囲に移行し、活性を調節細胞骨格関連蛋白質（アーク）を発現し、機能的に海馬に統合する彼らの能力を示唆している。これらのデータはhNSCsは機能的に照射した動物で認知を復元するための有望な戦略を与えることを示している。
がん化学療法に続いて障害者の認知機能と海馬における神経新生
目的：乳癌の生存者のかなりの割合は、しばしばと呼ばれ、認知機能に重要な、長期的な障害を報告する "chemobrain。"発見と治療の進歩は、より多くの患者は浸潤性乳癌の長期的な以下の診断を存続することを意味します。したがって、それは細胞傷害性抗がん剤による治療後に認知障害の種類、程度および持続性を定義することが重要です。実験デザイン：私たちは一般的に乳がん患者、シクロホスファミドとドキソルビシン（アドリアマイシン）で使用される2つのエージェントとの慢性的治療の効果を検討した。無胸腺ヌードラットを4週間にわたり週に一度、シクロホスファミド、ドキソルビシン2mg/kgまたは生理食塩水注射を50mg/kg投与した。新しい場所の認識タスクとコンテキストとキューさ恐怖条件付けは、学習や記憶能力を特徴付けるために用いた。未熟と成熟したニューロンとミクログリアの免疫染色は、神経とneuroinflammation.RESULTSの変化を評価するために使用された：シクロフォスファミドとドキソルビシンで処理したラットは、未処理の対照と比較して、新規の場所の認識タスクで大幅に低下し、パフォーマンスと文脈恐怖条件付けタスクを示したを示唆し、海馬ベースのメモリ機能を破壊した。化学療法で処置した動物は、神経新生が大幅に減少し（80〜90％NeuNを発現しているのBrdU標識細胞の低下）を示した。活性化ミクログリア（正ED1）は、ドキソルビシンtreatment.CONCLUSIONSシクロホスファミドの後に見つかりましたが、されませんでした：我々の結果は、2つの一般的に使用される化学療法剤のいずれかで慢性的な治療が認知能力を損なう、との戦略が中断海馬の神経新生を予防または修復することを示唆しているかもしれません実証がん生存者で、この重篤な副作用を改善するのに有効。
