生きているシナプス小胞マーカー：シナプトタグミン-GFP

Genesis (New York, N.Y. : 2000). Sep-Oct, 2002  |  Pubmed ID: 12324970

チック遺伝子の釣り：in Situハイブリダイゼーショントリプルラベルホールマウント蛍光は鳥類胚における同時重複遺伝子発現を検出

Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. Mar, 2004  |  Pubmed ID: 14991720

in situハイブリダイゼーションマルチカラー全体のマウントは、発展途上胚における2つ以上の遺伝子の空間的発現パターンを比較するための強力な手法です。我々は、単一の胚の3つの異なるmRNAの検出を可能にするin situハイブリダイゼーション（FISH）プロトコルで増幅されたトリプルラベル全体のマウント蛍光を開発しました。我々のプロトコルは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗ハプテン抗体を用いたシーケンシャル抗体検出が続いhaptenylatedリボプローブ、およびチラミド信号増幅（TSA）蛍光検出システムへのin situハイブリダイゼーション同時を使用しています。共焦点蛍光顕微鏡は、シングルセルの解像度を可能にし、与えられた組織内の特殊な細胞の種類を区別するのに対し、従来の蛍光顕微鏡は、組織レベルでの遺伝子発現の重複領域を識別します。このプロトコルは、単独で、または免疫組織化学または緑色蛍光タンパク質の局在との組み合わせで、in situハイブリダイゼーションプロトコルで、自分を適応させるための強固な出発点とFISHの使用に従事する研究者を提供します。

中央神経網と神経筋接合部の両方で機能することが不可欠ショウジョウバエのグルタミン酸受容体サブユニット

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Mar, 2005  |  Pubmed ID: 15788777

悪い受信（brec）を同定し、欠陥シナプスの開発と変異体のショウジョウバエ遺伝前方に画面が表示されます。ホモ接合brec変異体は胚性致死、麻痺であり、グルタミン酸作動性神経筋接合部（NMJ）で検出可能なシナプス伝達を示さない。遺伝子マッピング、相補性テスト、およびbrec変異はここで名前の前に未知イオンチャネル型グルタミン酸受容体サブユニットは、混乱させることがゲノムシーケンシングショー "GluRIID。" GluRIIDは、中枢神経系のシナプスの神経網を通して広くシナプスNMJのドメインと同様に、で表されます。ヌルbrec変異体のNMJでは、すべての知られているグルタミン酸受容体サブユニットは、免疫細胞化学によって検出されており、すべての機能グルタミン酸受容体が排除されます。したがって、我々はGluRIID、アセンブリ、および/またはNMJにおけるグルタミン酸受容体の安定化のために不可欠であると結論付けている。ヌルbrec変異体胚では、運動ニューロンの周期的な興奮性電流の周波数が大幅に中枢神経系の運動パターンのアクティビティがGluRIIDによって調節されていることを実証し、低減されます。シナプスの開発と分子の分化がそうでない場合はnull変異体では動じない表示されますが、実行可能なhypomorphic brec変異体は、GluRIID依存中枢パターンの活性は、末梢シナプスの成長を調節することを示唆し、幼虫の発育の終わりまでに劇的に発育不十分なNMJsを表示します。これらの研究は、末梢NMJにおけるグルタミン酸受容体の組み立て/安定化のために不可欠とCNSで適切にパターン化され、モータ出力するために必要です。新たに同定されたグルタミン酸受容体のサブユニットとしてGluRIID明らかにした。

人間のESCRTとALIXのタンパク質が細胞質分裂における中心体と機能のタンパク質と相互作用

The EMBO Journal. Oct, 2007  |  Pubmed ID: 17853893

TSG101とALIX HIV出芽で、彼らはウイルスや小胞のリリースに必要なトランスポート（ESCRT）経路の要因に必要な他のエンドソーム選別複合体と相互作用する多胞体ボディ（MVB）での小胞形成における機能の両方。プロテオーム解析は、ALIXとTSG101/ESCRT-IもCEP55、CD2AP、ROCK1と、IQGAP1を含む細胞質分裂に関与するタンパク質、一連の結合することを明らかにした。 ALIXとTSG101は中心体に集中して、中央のCEP55 "ヒンジ"地域とTSG101とALIX内GPPベースのモチーフの間の直接的な相互作用を介して細胞分裂のmidbodiesに動員されています。 ESCRT-IIIとVPS4タンパク質はまた、ESCRT経路の多くは中心体に局在することを示す、募集しています。 VPS4過剰発現がするようにALIXとTSG101/ESCRT-Iの枯渇は細胞分裂におけるこれらのタンパク質のための要件を確認し、HeLa細胞の細胞質分裂の離ステップを阻害する。さらに、ALIX点変異体は、ブロックCEP55とCHMP4/ESCRT-III結合は、両方の相互作用が不可欠であることを示す、離を抑制すること。これらの実験は、ESCRT経路は、HIV出芽、MVB小胞形成、細胞質分裂の離段階で類似した膜分裂イベントを容易にするために採用されることが示唆された。

障害のある好中球細胞外トラップ（NET）の形成：ヒトの新生児の新規自然免疫欠乏症

Blood. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19221037

好中球は、病原体を殺すために進化してきた専門性の高い生得的なエフェクター細胞である。人間の新生児は不完全に特徴付けられる好中球機能不全の一般的な多因子症候群を持っており、敗血症やその他の重篤な感染性合併症に貢献しています。好中球細胞外トラップ（ネット）を形成することができない：私たちは、新生児の抗菌防御における新規の欠陥を同定した。ネットは、細胞外DNA、クロマチン、微生物の細胞外の殺害を仲介する抗菌タンパク質の格子であり、リン酸（NADPH）オキシダーゼで生成された活性酸素種（ROS）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドによって合図されたユニークな死の経路を介して形成すると考えられている。私たちは炎症性アゴニストインの健康な成人から白血球とは対照的で活性化される用語と早産児の好中球はネットを形成するために失敗することがわかった。 NET形成の欠損は、細胞外細菌を殺すに以前に認識されていない赤字で並列されています。それはロスが必要なく、十分なシグナル伝達の仲介者であることを実証し、新生児の白血球内のリンクまたは下流の経路の欠陥を識別し、不活化NADPHオキシダーゼの成人の細胞で行ったようにロスの世代は、新生児の好中球によってNETの形成に欠陥を補完していませんでした。障害NET形成は、感染に新生児を素因とその一般的な発達不全の重要な面かもしれません。

臨床的に適切な濃度で心筋細胞にタバコの煙の水性抽出物の直接的な毒性作用

Toxicology and Applied Pharmacology. Apr, 2009  |  Pubmed ID: 19371621

私たちの目標は、たばこの煙（CSE）の水性抽出物の臨床的に適切な濃度は、シミュレートされた虚血時の心室筋細胞に直接的な悪影響を持っているかどうかを判断し、メカニズムが関与して検討した。

人間のESCRT-IIIとVPS4タンパク質が中心体、スピンドルメインテナンスに必要である

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20616062

ESCRT経路は哺乳類や古細菌の細胞質分裂の最終的離のステップを仲介することができます。哺乳類では、ESCRT経路の2つの初期作用タンパク質、ALIXとTSG101は、リンCEP55との直接的な相互作用を介して中心体に補充されています。 CEP55は、細胞周期の大部分を中心体に存在しますが、その後、細胞質分裂の開始時に中心体に移行し、ESCRT経路はまた、中心体のリンクを持つことを示唆している。ここでは、体系的に後期に作用する哺乳類のESCRT-IIIと有糸分裂と細胞分裂のさまざまな段階でVPS4タンパク質の要件を分析した。我々はVPS4A、VPS4Bのその枯渇を発見した、または11の異なるヒトESCRT-IIIのいずれか（CHMP）のタンパク質は、脱離を抑制した。驚くべきことに、個々のESCRT-IIIとVPS4タンパク質の枯渇も多スピンドル（最もESCRT-III/VPS4タンパク質）または単極スピンドル（CHMP2AまたはCHMP5）の製造と染色体の分離と核形態の欠陥を引き起こし、中心体および紡錘体極の番号を変更しました。 VPS4タンパク質は有糸分裂時の紡錘体極で濃縮した後、細胞質分裂時のmidbodiesで、これらのタンパク質は、両方のサイトで直接機能することを意味する。我々はESCRT-III/VPS4タンパク質は、それによって細胞分裂のさまざまな段階を経て注文した進行を確保できるように、脱離時にmidbodiesでその後のメンテナンスや増殖を調節するために中心体で機能すると結論付けている。

再発を克服し、寛解期間を改善するために悪用する抗腫瘍免疫

Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22198309

薬剤耐性クローンの進化と腫瘍幹細胞の再増殖に頻繁に再発するため、癌の生存者。私たちの臨床研究では、末期癌患者のリンパ球は薬剤耐性クローンと腫瘍幹細胞を含む患者自身の腫瘍細胞を殺すことをin vitroで効果的な細胞傷害性Tリンパ球にin vivoでの寛容な傍観者から変換することができることを実証した。我々は、イマチニブの効果的な腫瘍の殺害は、腫瘍誘発性が損なわながら抗腫瘍免疫を促進するためにペグインターフェロンα-2bは危険信号として機能することが合理的とステージIII / IV消化管間質腫瘍（GIST）の治療のためにイマチニブとインターフェロンα-2bを組み合わせて臨床試験を設計しました公差そのための適切な樹状細胞とTh1応答に向かって細胞傷害性Tリンパ球分化を可能にし、白血球減少せず、in vivoで腫瘍特異的抗原を提供します。 8患者の中間解析では、IFN-γ産生-CD8（+）、抗CD4（+）細胞、-NK、およびIFN-γ産生腫瘍-リンパ球浸潤、重要なTh1細胞応答を意味するとNK細胞の有意な誘導を示したアクティベーション。 3.6年のフォローアップ中央値の後、完全寛解（CR）+部分奏効（PR）= 100％、全生存率= 100％、一人の患者が寛解中に無関係の病気で死亡、7人の評価可能な患者の6人が継続的であるか、 PR / CR（5例）、または持っている無増悪生存期間（PFS、1人の患者）が実証した第III相の遺伝子型特異-PFSイマチニブ単独療法（CALGB150105/SWOGS0033）の95％の信頼レベルの上限を超える高度な臨床転帰を約束。現在の裁判は、大規模な将来の臨床試験の準備のために閉じられます。我々は、標的療法と免疫療法の組み合わせは、安全かつ誘導重要なTh1細胞応答とNK細胞活性化であると結論したがって、他の腫瘍型で開発を正当化し、GISTに非常に有望な臨床効果を示した。

グルタチオン依存還元ストレスはミトコンドリア酸化と細胞毒性をトリガ

The FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22202674

優勢な非タンパクチオール、グルタチオン（GSH）の影響を調べるために、酸化還元ホメオスタシスに、我々は、in vitroの両方で損失と利得の機能GSH含量の影響を決定するために補完的な薬理学的および遺伝的戦略を採用しています。我々は、酸化還元に敏感な緑色蛍光タンパク質（roGFP）プローブおよび還元/酸化チオレドキシン（Trxs）のレベルを使用して、細胞質ゾルおよびミトコンドリアにおける酸化還元のイベントをモニターした。 H（2）O（2）または共発現還元酵素阻害剤は、1 - クロロ-2,4 - ジニトロベンゼン（DNCB）、胚性ラット心臓（H9C2）細胞では、どちらかは、8または50 mVのより多くの酸化グルタチオン酸化還元電位、E（HCを誘発（）GSSG/2GSH）であった。対照的に、ヒト胚性腎臓293 T（HEK293T）のグルタミン酸システインリガーゼ（GCL）触媒サブユニット（GCLC）またはGCL修飾サブユニット（GCLM）のいずれかのN-アセチル-L-システイン（NAC）H9c2細胞の治療、または過剰発現GSHの4倍増加し、それぞれE（HC）を低減する7または12 mVの多くの原因 - 細胞は、3つにつながった。ミトコンドリアroGFPとTrx2における酸化還元のシフトによって示されるようにこの条件は、逆説的に、ミトコンドリアの酸化のレベルを増加させた。最後に、以上の還元環境に増加した細胞毒性と感受性を示したNAC治療（EC（50）4 mm）またはどちらGCLCまたはGCLM過剰発現のどちらかがROSの減少レベルで達成された。一緒に、我々の知見は、GSH-依存還元ストレスはミトコンドリアの酸化とcytotoxicity.·チャン、H.、Limphong、P.、ピーパー、J.、劉、Q.、Rodesch、CK、キリスト教徒、Eをトリガすることによって新たなメカニズムを明らかに、ベンジャミン、IJグルタチオン依存還元ストレスはミトコンドリアの酸化と細胞毒性をトリガします。

Dystrophinopathy筋標本におけるジストロフィン免疫の定量化

Neuropathology and Applied Neurobiology. Jan, 2012  |  Pubmed ID: 22243335

目的：デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、通常筋線維膜に存在しないか、またはほとんどないジストロフィンの発現に関連付けられています。筋生検切片の免疫研究におけるジストロフィン信号の非常に低いレベルの定量化は技術的な課題を提示します。これは、発現レベルの有意な変化であるかもしれないものの検出および定量は絶対ジストロフィンレベルは低いままであっても、重要である証明の原理薬の臨床試験の設定に特に当てはまります。方法：我々は、セクションスペクト用Co-染色で低レベルのジストロフィン発現の信頼性と半自動免疫蛍光定量化を可能にする画像解析の手法を開発した。連続した領域のスペクトマスクを作成するには、カスタムMetamorphスクリプトを使用して、私たちは、おそらく筋線維膜を表すスペクトマスク内のピクセルでジストロフィンの信号強度を定量化する。このメソッドを使用して、我々は、DMD、ベッカー型筋ジストロフィー（BMD）、中間型筋ジストロフィー（IMD）、正常なコントロール組織の患者のシリーズからの筋生検組織を分析した。結果：シリアルセクションの分析、複数の日には、再現性、正規化されたジストロフィンを確認：ウェスタンブロット分析によって決定されたスペクト強度比（正常なコントロール組織のパーセンテージとして表される）ジストロフィンの発現レベルとよく相関している。結論：この方法では、DMD治療薬の試験のためのバイオマーカーの検出の堅牢で信頼性の高い方法を提供しています。 ©2012作成者。神経病理学、応用神経©2012英国の神経病理学的研究。