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Articles by Christopher Murakami in JoVE
JoVE General
Quantificare cronologica Span lievito Life di conseguenza di cellule invecchiate
Department of Pathology, University of Washington
Invecchiamento cronologico di lievito si riferisce alla perdita di vitalità cellulare associato con il tempo in fase stazionaria. Qui si descrivono un elevato throughput metodo per determinare quantitativamente la durata della vita cronologico lievito.
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Un Metodo Di Analisi Quantitativa High-throughput Di Lievito Cronologico Life Span
Invecchiamento cronologico nel lievito è stato studiato da mantenere le cellule in una cultura quiescente-come fase stazionaria e monitoraggio nel tempo la sopravvivenza delle cellule. La composizione del mezzo di crescita può avere una profonda influenza sull'invecchiamento cronologico. Per esempio, restrizione dietetica compiuto abbassando notevolmente la concentrazione di glucosio del mezzo aumenta la durata. Qui riportiamo un nuovo metodo di alto-rendimento per misurazione durata cronologico lievito di monitoraggio escrescenza di invecchiamento delle cellule usando una macchina Bioscreen C MBR. Ci mostrano che questo metodo fornisce i dati di sopravvivenza paragonabili ai metodi tradizionali, ma con ridotta variabilità. Oltre a ridurre la concentrazione di glucosio, troviamo che livelli elevati amminoacido o aumentata osmolarità del mezzo di crescita è sufficiente per aumentare la durata cronologica. Segnaliamo inoltre che estensione durata dalla restrizione dietetica non richiede qualsiasi delle cinque sirtuine lievito (Sir2, Hst1, Hst2, Hst3 o Hst4) da solo o in combinazione.
Un Meccanismo Molecolare Dell'invecchiamento Cronologico in Lievito
I meccanismi molecolari che causano invecchiamento organismica sono un argomento di dibattito e scrupolose. Restrizione dietetica estende la durata della vita di molti organismi, tra cui il lievito, e sono in corso sforzi per comprendere i percorsi biochimici e genetici che regolano questo prolunga la durata della vita in organismi modello. Qui descriviamo il meccanismo mediante il quale restrizione dietetica estende la durata cronologica lievito, definito come la lunghezza del tempo che le cellule di lievito fissi rimangono vitali in uno stato quiescente. Troviamo che l'invecchiamento in condizioni standard di cultura è il risultato di un componente cellulare-estrinseco che è legato al pH del terreno di coltura. Individuiamo l'acido acetico come mediatore estrinseco-cella della morte delle cellule durante l'invecchiamento cronologico e dimostrare tale restrizione dietetica, crescita in una fonte di carbonio non fermentabili, o trasferimento di cellule per acqua durata cronologico aumenta riducendo o eliminando l'acido acetico extracellulare. Altri life span che estende gli interventi ambientali e genetici, quali la crescita elevata osmolarità media, eliminazione di SCH9 o RAS2, aumentare resistenza cellulare all'acido acetico. Possiamo concludere che la mortalità indotta acido acetico è il principale meccanismo di invecchiamento cronologico nel lievito in condizioni standard.
Un Approccio Genomico Per Invecchiamento Cronologico Del Lievito
Il lievito è un organismo modello utile per studiare i meccanismi genetici e biochimici di invecchiamento. Studi di genomici di invecchiamento in lievito hanno stati limitati, tuttavia, di metodologie tradizionali che richiedono un grande investimento di risorse e di manodopera. In questo capitolo, descriveremo un metodo di recente sviluppato per misurare quantitativamente la durata cronologica di ogni ceppo contenuta nel lievito insieme eliminazione ORF. Il nostro approccio comporta la determinazione di sopravvivenza della popolazione di monitoraggio cinetica escrescenza utilizzando un lettore di smuovicenere incubatore Bioscreen C MBR. Questo metodo ha una precisione paragonabile ai tradizionali dosaggi, pur consentendo una velocità superiore e ridotta variabilità nella misurazione.
YODA: Software Per Facilitare L'analisi Di Alto-rendimento Dell'arco Cronologico Di Vita, Tasso Di Crescita E Sopravvivenza Nel Lievito Gemmante
Il lievito gemmante Saccharomyces cerevisiae è uno dei microrganismi più ampiamente studiato in scienze invecchiamento-relative. Anche se sono stati identificati diversi modificatori genetici della longevità di lievito, l'utilità di questo sistema per gli studi sulla longevità ha stato limitato dalla mancanza di dosaggi di alto-rendimento per misurare quantitativamente la sopravvivenza delle cellule di lievito individuale durante l'invecchiamento.
Prova Quantitativa Per Primi Life Fitness Difetti Da 32 Longevità-associated Alleli in Lievito
Ridotta fecondità è stato associato con alcuni alleli che aumentano la longevità nei modelli invertebrati e mammiferi. Questa osservazione ha suggerita a sostegno della teoria di pleiotropia antagonista dell'invecchiamento, che prevede che gli alleli di alcuni geni promozione fitness all'inizio della vita hanno effetti dannosi più tardi nella vita che limitano la sopravvivenza. In solo pochi casi, tuttavia, è la relativa idoneità di mutanti longevi stata quantificata attraverso la competizione diretta con il genotipo wild type. Qui riportiamo la prima analisi completa di fitness e longevità trade-off misurando la relativa idoneità di 49 varianti longevi lievito in un dosaggio di diretta concorrenza con cellule di tipo selvatico. Troviamo che 32 (65%) di queste varianti mostrano un difetto significativo in palestra in questo test di competizione. Nel 26 (81%) di questi casi, questa riduzione nel fitness può essere parzialmente rappresentata dal tasso di crescita massima ridotta durante i primi anni di vita, di solito derivanti da un difetto del ciclo cellulare G0/G1-specifiche. Una maggioranza della longevità-enhancing varianti sono associati con meno fit ridotto traduzione di mRNA. Questi risultati sono quindi coerenti con l'idea che una maggiore longevità spesso viene fornito con un costo di fitness e suggeriscono che questo costo è spesso associato con variazione in un sottoinsieme dei fattori di longevità, come quelle che regolano la traduzione, la crescita e la riproduzione di mRNA.
Un'analisi Genomica Di Longevità Cronologico Fattori Nel Lievito Gemmante
Arco cronologico di vita (CLS) è stata studiata come un paradigma di invecchiamento in lievito. Sono stati identificati alcuni invecchiamento conservata geni che modulano la longevità cronologico e replicativa nel lievito nonché longevità nel nematode Caenorhabditis elegans; Tuttavia, un'analisi completa del rapporto tra controllo genetico di longevità cronologico e invecchiamento in altri sistemi modello deve ancora essere segnalato. Per rispondere a questa domanda, abbiamo effettuato un'analisi genomica funzionale della longevità cronologico per 550 ceppi di delezione di un singolo gene, che rappresenta circa il 12% dei ceppi praticabile delezione omozigote diploide il lievito insieme eliminazione ORF. Questo studio identificato 33 determinanti precedentemente sconosciuti di CLS. Abbiamo non trovato nessun significativo arricchimento per CLS rafforzata tra delezioni corrispondenti a orthologs lievito di geni invecchiamento worm o tra ceppi di eliminazione replicatively longevi, anche se è stato osservato un trend verso la sovrapposizione. Al contrario, un sottoinsieme di delezioni del gene identificato da uno schermo per ridotta acidificazione dei terreni di coltura durante la crescita di fase stazionaria è stato arricchito per CLS aumentata. Questi risultati suggeriscono che controllo genetico di CLS in condizioni di test più comunemente utilizzati non fortemente sovrapporsi con determinanti longevità in c. elegans, confinato in un piccolo numero di percorsi genetici esistenti. Questi dati inoltre ulteriore supporto del modello che l'acidificazione del terreno di coltura svolge un ruolo importante nella sopravvivenza durante l'invecchiamento cronologico in mezzo sintetico e suggeriscono che gli studi di invecchiamento cronologico utilizzando condizioni medie alternative possono essere più informativi in materia di invecchiamento di eucarioti pluricellulari.
Eliminazione Di SIR2 Impedisce Estensione Durata 32 Mutanti Longevo
Attivazione di Sir2 orthologs si propone di aumentare la durata della vita a valle della restrizione dietetica. Qui, descriviamo un esame dell'effetto di 32 diverse mutazioni di allungare la durata della vita e quattro metodi di DR su durata replicativa (RLS) nel ceppo di lievito sir2Δ di breve durata. In ogni caso, eliminazione di SIR2 impedito estensione RLS; Tuttavia, estensione RLS è stata ripristinata quando sia SIR2 e FOB1 sono stati eliminati in diversi casi, dimostrando che SIR2 non è direttamente necessaria per estensione del RLS. Questi risultati indicano che la soppressione del difetto durata sir2Δ è un fenotipo raro tra gli interventi di longevità e suggeriscono che sir2Δ cellule senesce rapidamente da un meccanismo distinto da quello del selvaggio-tipo celle. Essi dimostrano anche che la mancata estensione della durata della vita in uno sfondo di breve durata, di osservare come le cellule o gli animali privi di sirtuine, devono essere interpretati con cautela.
Capacità Elevata Del Proteasoma Estende Replicativa Durata in Saccharomyces Cerevisiae
Invecchiamento è caratterizzata dall'accumulo di macromolecole cellulari danneggiati causati dal calo percorsi di riparazione ed eliminazione. Un componente integrale impiegato dalle cellule per gli aggregati di proteine tossiche contatore è il sistema ubiquitina/proteasoma conservato (UPS). Precedenti studi hanno descritto un declino età-dipendente della funzione proteosomale e maggiore longevità correla con capacità del proteasoma sostenuta in centenari e nudo ratti talpa, un roditore longevo. Prova per un impatto diretto della funzione del proteasoma avanzata sulla longevità, tuttavia, è ancora carente. Per determinare l'importanza della funzione del proteasoma nell'invecchiamento del lievito, abbiamo stabilito un metodo per modulare la capacità del gruppo di continuità da livelli di manipolazione del fattore di trascrizione correlati a UPS Rpn4. Mentre le cellule manca RPN4 esibiscono una piscina è diminuito del proteasoma non adattabile, perdita di UBR2, un'ubiquitina ligasi che regola Rpn4 fatturato, si traduce in elevati livelli di Rpn4, quali componenti di UPS sopraregola le. Aumento della capacità UPS migliora significativamente replicativa durata (RLS) e resistenza alle sollecitazioni di proteotoxic, mentre la ridotta capacità di UPS ha opposte conseguenze. Nonostante la coregolamentazione transcriptional stretta della UPS e sistemi di disintossicazione ossidativo, l'impatto della capacità del proteasoma sulla durata della vita è indipendente di quest'ultimo, poiché eliminazione di Yap1, un regolatore chiave della risposta dello stress ossidativo, non influisce sul estensione della durata della vita delle cellule con capacità superiore del proteasoma. Inoltre, dal proteasoma elevata capacità risultati in liquidazione migliorata di frammenti di huntingtina tossica in un modello del lievito per le malattie neurodegenerative, si ipotizzano che l'estensione di vita osservati proviene dalla eliminazione prolungata di proteine danneggiate nelle cellule madre vecchie. Epistasi analisi indicano che modulazione del proteasoma-mediata della durata della vita è almeno parzialmente distinta dalla restrizione dietetica, Tor1 e Sir2. Questi risultati dimostrano che determina la capacità di UPS lievito RLS da un meccanismo che è distinto da percorsi noti longevità e aumentare la possibilità che gli interventi per promuovere la funzione del proteasoma avanzata avrà effetti benefici sulle malattie legate all'età e longevità negli esseri umani.
Composizione E L'acidificazione Del Terreno Di Coltura Influenza Invecchiamento Cronologico Similmente in Vigna E Laboratorio Di Lievito
Invecchiamento cronologico è stato studiato estesamente nel lievito laboratorio di coltura di cellule in fase stazionaria in terreno sintetico completo con 2% di glucosio come fonte di carbonio. Durante questo processo, l'acidificazione del terreno di coltura si verifica a causa della secrezione di acidi organici, tra cui l'acido acetico, che limita la sopravvivenza delle cellule di lievito. Restrizione dietetica o buffer a pH 6 medio impedisce l'acidificazione e aumenta la durata cronologica. Qui abbiamo impostato per determinare se questi effetti sono specifici al lievito derivato da laboratorio testando le proprietà di invecchiamento cronologico del ceppo di lievito vigneto RM11. Simile per il ceppo di laboratorio BY4743 e suoi derivati aploidi, RM11 e suoi derivati aploide visualizzati aumentarono durata cronologico dalla restrizione dietetica, buffering il pH del terreno di coltura, o invecchiamento in mezzo ricco. RM11 e BY4743 anche visualizzato invecchiamento in generale simile e caratteristiche di crescita quando coltivate in una varietà di fonti di carbonio differenti. Questi dati supportano l'idea che i meccanismi dell'invecchiamento cronologico sono simili in ceppi il laboratorio e la vigna.
