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Articles by Claudia Litterst in JoVE
JoVE General
El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa
Gene Expression Division, Bio-Rad Laboratories
Este procedimiento describe un flujo de trabajo rápido y fácil de introducir en siRNA difíciles de transfectar líneas celulares y seguir la expresión de genes por PCR en tiempo real. El uso de un contador de células automatizado, multi-así placa electroporación, y la estación de electroforesis automatizados proporcionar resultados rápidos y confiables sin la necesidad de manipulación robótica caro.
Other articles by Claudia Litterst on PubMed
Un Motivo LXXLL En El Dominio De Transactivación De STAT6 Media Contratación De NCoA-1/SRC-1
Transductor de señal y activador de la transcripción 6 (STAT6) regula la activación transcripcional en respuesta a la interleucina-4 (IL-4)-inducida de la fosforilación de la tirosina por interacción directa con activación. La proteína CREB y el nuclear coactivator 1 (NCoA-1), un miembro de la familia de coactivator p160/esteroide receptor, independientemente se unen a regiones específicas de STAT6 y actúan como activación. En este estudio demostramos que un motivo LXXLL en el dominio de transactivación STAT6 interviene en la interacción con NCoA-1. Péptidos que representa este adorno así como anticuerpos generados contra este motivo inhibición STAT6/NCoA-1 interacción en ensayos de telecine glutatión S-transferasa. Péptidos derivan del dominio de transactivación STAT6 adyacente al motivo LXXLL así como anticuerpos contra estos péptidos no mostró ningún efecto inhibitorio. Mutagénesis del motivo LXXLL elimina la interacción STAT6/NCoA-1 in vitro e in vivo, apoyando el papel específico de este motivo en Unión NCoA-1. Lo importante, mutagénesis del motivo STAT-LXXLL había disminuido fuertemente la activación de IL-4-regulada de los objetivo de STAT6 endógeno gen eotaxin-3. Tomados en conjunto, estos resultados indican que el motivo de unión a STAT6-LXXLL media la interacción con NCoA-1 en la activación transcripcional y representa un nuevo objetivo potencial de la droga para la inhibición de la función de transactivación STAT6 en enfermedades alérgicas.
NCoA-1/SRC-1 Es Un Coactivador Esencial De STAT5 Que Se Une Con El Motivo De La FDL En La Región Alfa Helicoidal Del Dominio De Transactivación STAT5
Transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5) es un factor de transcripción que activa la prolactina (PRL)-expresión génica dependiente en la glándula mamaria. Para la activación de sus genes diana, STAT5 recluta activación como p300 y la proteína CREB (CBP). En este estudio analizamos la función de p300/CBP-asociados de la p160/SRC/NCoA-familia en la transactivación mediada por STAT5 de expresión de la beta-caseína. Nos encontramos con que sólo uno de ellos, NCoA-1, actúa como un coactivador STAT5a tanto STAT5b. Los dos activación p300/CBP y NCoA-1 mejoran cooperativamente transactivación mediada por STAT5a. Para coactivation NCoA-1-dependiente de STAT5, tanto en el dominio de activación 1 y en el dominio amino-terminal bHLH/PAS se requieren. La región amino-terminal interviene en la interacción con STAT5a en las células. Un motivo de tres aminoácidos en una región alfa helicoidal del dominio de transactivación-STAT5a es esencial para la Unión del NCoA-1 y para la actividad transcripcional de STAT5a. Además observamos que NCoA-1 está implicada en la acción sinérgica del receptor de glucocorticoides y STAT5a en el promotor de la beta-caseína. Estos resultados apoyan un modelo en el cual STAT5, en concierto con el receptor de glucocorticoides, recluta un coactivador multifuncional complejo para iniciar la transcripción de PRL-dependiente.
Estructura Del Dominio NCoA-1/SRC-1 PAS-B Enlazado Con El Motivo De La LXXLL Del Dominio De Transactivación STAT6
Transductor de señal y activador de la transcripción 6 (STAT6) regula la activación transcripcional en respuesta a la interleucina-4 (IL-4) por interacción directa con activación. La proteína CREB (p300/CBP) y la nuclear coactivator 1 (NCoA-1), un miembro de la familia de coactivator p160/esteroide receptor, independientemente se unen a regiones específicas del dominio de transactivación STAT6 y actúan como activación. La interacción entre STAT6 y NCoA-1 está mediada por un motivo LXXLL en el dominio de transactivación de STAT6. Para definir el mecanismo de reconocimiento coactivator, determinamos la estructura cristalina del dominio PAS NCoA-1-B en complejo con el motivo de STAT6 LXXLL. El anfipáticos, motivo de STAT6 LXXLL alfa-helicoidal se une sobre todo a través de interacciones hidrofóbicas específicas NCoA-1. Un solo aminoácido del dominio NCoA-1 PAS-B establece interacciones hidrofílicas con el péptido STAT6. STAT6 interactúa sólo con el dominio de la PAS-B de NCoA-1 pero no con las regiones homólogas de NCoA-2 y NCoA-3. Los residuos implicados en vinculante el péptido STAT6 se conservan fuertemente entre los diferentes miembros de la familia NCoA. Por lo tanto superficial complementariedad entre las caras hidrofóbicas del fragmento STAT6 y del dominio NCoA-1 PAS-B casi exclusivamente define la especificidad de unión entre las dos proteínas.
Activación En La Regulación Génica Por STAT5
Transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5) es un miembro de la familia tendencia de factores de transcripción que retransmiten el efecto de diversas citoquinas, hormonas y factores de crecimiento mediante la regulación de la transcripción de genes diana distinta. Esta función se acentúa por su papel crucial en el desarrollo de la glándula mamaria y el sistema hematopoyético. Quinasas de Janus asociado a receptor de citoquinas (JAKs) inducen dimerización, translocación nuclear y enlace de ADN mediante la fosforilación de la tirosina de STAT5. STAT5 regula la expresión de genes diana de cytokine atando a motivos de gamma interferón-Activar secuencia (GAS). Activación transcripcional requiere el contacto de STAT5 para activación y componentes de la maquinaria de transcripción. Otro punto importante en la activación transcripcional es la cooperación con otros factores de transcripción que se unen en las cercanías de los promotores de genes objetivo y potenciadores. Su acción concertada puede resultar en una Unión mayor a los promotores o reclutamiento cooperativa de activación. Además, la diafonía con otras vías de señalización, así como modificaciones secundarias de STAT5 se han descrito para afectar la función de transactivación.
Caderinas Median Tanto La Asociación Entre PS1 Y Beta-catenina Y Los Efectos De La PS1 En La Estabilidad De La Beta-catenina
Presenilin1 (PS1), una proteína implicada en el desarrollo celular, forma complejos funcionales con beta-catenina, un regulador de Wnt signaling y célula-célula adherencia. Además, ambas proteínas han demostrado un papel importante en enfermedades como el cáncer y la enfermedad de Alzheimer. Aunque PS1 y beta-catenina se encuentran en los complejos de la mismos, no está claro si se unen directamente a cada uno con el otro o un tercer componente complejo, como cadherina, puede mediar sus interacciones. Aquí mostramos que PS1 y beta-catenina no forman complejos detectables en las células que no expresan cadherin. Por el contrario, estos complejos se encuentran fácilmente en células que contienen E-cadherina. Además, es necesario para la formación de complejos de PS1/beta-catenina enlace de PS1 y de beta-catenina para E-cadherina. Lo importante, nuestros datos muestran que la Unión de PS1 a cadherin media los efectos de la PS1 en la fosforilación, ubiquitinación y desestabilización de beta-catenina. Así, caderinas median tanto la Asociación de PS1 y beta-catenina y los efectos de la PS1 en los niveles celulares de beta-catenina.
Metaloproteinasa/Presenilin1 Proceso De EphrinB Regula La Fosforilación EphB-inducida De La Fuente Y Señalización
Bidireccional señalización desencadenada por receptores de interacción ephrinB (EphB) y ligandos ephrinB es crucial para el desarrollo y funcionamiento de los sistemas vasculares y nerviosos. Una cascada de señalización desencadenada por esta interacción implica la activación de la cinasa de la fuente y fosforilación de ephrinB. Se desconoce el mecanismo, sin embargo, por el cual EphB activa fuente en las células ephrinB-expresión. Aquí mostramos que EphB estimula una hendidura de la metaloproteinasa de ephrinB2, produciendo un fragmento de carboxi-terminal que además es procesado por PS1/gama-secretasa para producir péptidos intracelulares ephrinB2/CTF2. Este péptido une fuente e inhibe su asociación con inhibidor cinasa Csk, permitiendo la autophosphorylation de la fuente en el residuo tyr418. Fuente de EphrinB2/CTF2-activado fosforila ephrinB2 e inhibe su procesamiento por la gama-secretasa. Estos datos demuestran que el sistema de PS1/gama-secretasa controla la activación de la fuente y ephrinB fosforilación mediante la regulación de la producción de fuente activador ephrinB2/CTF2. Por consiguiente, inhibidores de la gama-secretasa impidieron el surgimiento de EphB-inducida de las células endoteliales y la contratación de Grb4 a ephrinB. PS1 FAD y gama-secretasa dominante negativo mutantes inhiben la ruptura inducida por EphB de ephrinB2 y fuente autophosphorylation, incrementa la posibilidad de que mutantes de FAD interfieran con las funciones de la fuente y ephrinB2 en el SNC.
Mutantes De La FAD Incapaces De Aumentar Neurotóxicos Abeta 42 Sugieren Que Efectos De La Mutación En La Neurodegeneración Pueden Ser Independientes De Los Efectos De Abeta
Fuerte apoyo para un papel causal principal de los péptidos de Abeta en el desarrollo de la neurodegeneración de la enfermedad de Alzheimer (EA) se deriva de informes que Presenilina familiares mutantes de AD (FAD) alteran el procesamiento de la proteína precursora del amiloide, aumentando la producción de Abeta neurotóxico 1-42 (Abeta 42). Este efecto de mutantes de la FAD se refleja también en una mayor proporción de péptidos Abeta 42 sobre Abeta 1-40 (40 de Abeta). En el presente estudio, mostramos que varios mutantes de Presenilina 1 FAD no aumentar la producción de Abeta 42 o la relación de Abeta 42/40. Nuestros datos sugieren que el mecanismo por el cual las mutaciones de la FAD promoción neurodegeneración y AD puede ser independiente de sus efectos en la producción de Abeta.
Ligando Y Afluencia De Calcio Inducen Ectodominio/gamma-secretasa-procesamiento De Distintas Vías De EphB2 Receptor
Unión de receptores EphB a ligandos ephrinB en la superficie de las células adyacentes inicia cascadas de señalización que regulan la angiogénesis, la guía axonal y plasticidad neuronal. Estas funciones requieren procesamiento de receptores EphB y eliminación de EphB-ephrinB complejos de la superficie de la célula, pero los mecanismos implicados son poco conocidos. Aquí mostramos que ectodominio de EphB2 receptor se lanza al espacio extracelular tras escote de EphB2 residuo 543. El fragmento de membrana asociada restante es dividido por la actividad presenilin-dependiente de la gama-secretasa después de EphB2 residuo 569 liberando un péptido intracelular que contiene el dominio citoplásmico de EphB2. Este escote es inhibida por mutaciones de la enfermedad de Alzheimer familiares Presenilina 1. Procesamiento de EphB2 receptor depende de tratamientos específicos: ephrinB inducida por ligando procesamiento requiere endocitosis, y el escote del ectodominio es sensible al inhibidor de péptido N-benciloxicarbonil-Val-Leu-leucinal pero insensible al inhibidor de la metaloproteinasa de la GM6001. La transformación inducida por ligando ocurre en endosomas e implica la degradación rápida de la EphB2 extracelular. EphrinB ligando estimula la ubiquitinación de EphB2 receptor. Procesamiento de inducida por ácido de afluencia - y N-metil-d-aspártico de calcio de EphB2 es inhibida por los inhibidores de la GM6001 y ADAM10 pero no por N-benciloxicarbonil-Val-Leu-leucinal. Este proceso no requiere endocitosis y promueve la rápida caída de EphB2 extracelular, indicando que se lleva a cabo en la membrana plasmática. Nuestros datos identifican nuevas divisiones y modificaciones de EphB2 receptor e indican que condiciones específicas determinan los sistemas proteolíticos y sitios subcelulares implicados en el procesamiento de este receptor.
Péptido EphB2/CTF2 Generado Por El Proceso De La Gama-secretasa De EphB2 Receptor Promueve La Localización Superficial Tirosina Fosforilación Y Célula De Receptores N-metil-D-aspartato
Presenilina 1, una proteína implicada en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer familiar, es un importante componente funcional del gama-secretasa complejo que procesa muchos receptores de superficie celular incluyendo los receptores tirosina quinasa de EphB2 (Litterst, C., Georgakopulos, A., Shioi, J., Ghersi, E., Wisniewski, T., Wang, R., Ludwig, A. y Robakis, J. N. K. (2007) Biol Chem. 282, 16155-16163). La evidencia reciente revela que citosólica péptidos producción por el tratamiento combinado de Metaloproteinasa/gama-secretasa de función de proteínas de la superficie de la célula en la fosforilación de proteína y transducción de señal. A continuación os mostramos ese péptido EphB2/CTF2 aparecido en el citosol por el proceso de la gama-secretasa de EphB2 receptor, tiene actividad tirosina quinasa y fosforila directamente las subunidades del receptor (NMDAR) de N-metil-d-aspartato en líneas celulares y cultivos primarios neuronales. Esta fosforilación se produce en ausencia de quinasas Src y es resistente a los inhibidores de la fuente revelando una nueva vía de fosforilación de la tirosina NMDAR independiente de la actividad de la fuente. EphB2/CTF2, pero no un mutante de la deficiencia de cinasa de EphB2/CTF2, promueve la expresión superficial de la célula de NMDAR. Porque NMDAR juega un papel central en la función y la plasticidad sináptica, nuestros resultados proporcionan un posible vínculo entre la función de la gama-secretasa de Presenilina 1 y el aprendizaje y la memoria.
Interacción De STAT6 Con Su Coactivador SRC-1/NCoA-1 Está Regulada Por La Desfosforilación De Esta última Vía PP2A
Regulación de la expresión génica representa una cuestión central en respuestas celulares regulada por señal. STAT6 es un importante mediador de IL-4 estimula la activación de genes. Para mediar esta función, STAT6 recluta complejos coactivador. Hemos demostrado previamente que STAT6 se une el dominio PAS-B de la coactivador NCoA-1 mediante un motivo LXXLL en su dominio de transactivación. Nuestro reciente descubrimiento de que el dominio de la PAS-B de NCoA-1 también es esencial para puntos de formación de complejos coactivador un nivel adicional de Reglamento de la Asamblea del coactivador. En este estudio, hemos descubierto que desfosforilación de NCoA-1 es esencial para la interacción con STAT6 y para la activación transcripcional de IL-4-dependiente. PP2A desfosforila NCoA-1 y facilita la activación de genes diana de STAT6. Curiosamente, la inhibición simultánea de fosfatasas y Quinasas Ciclina-Dependientes rescata la interacción NCoA-1/STAT6. Por otra parte, detención de las células en G1/S produce mayor fosforilación NCoA-1. En Resumen, nuestros resultados indican que la interacción de NCoA-1 y STAT6 dinámicamente está regulada por la fosfatasa PP2A y Quinasas Ciclina-Dependientes. Esto proporciona un mecanismo para integrar la regulación transcripcional por STAT6 con la progresión del ciclo celular.
