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Articles by Collin Luk in JoVE
JoVE Neuroscience
La culture et l'électrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips
1Institute for Microstructural Sciences, National Research Council of Canada, 2Institute for Biological Sciences, National Research Council of Canada, 3Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary
Nous montrons comment plane de patch-clamp puces fabriquées au sein du Conseil national de recherches du Canada sont stérilisés, apprêté, chargé avec le milieu, plaqué avec des cellules, et utilisé pour les enregistrements électrophysiologiques.
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Une Centrale Génératrices De Modèle Neurone Coordonnées Sensori-moteur Composants Identifiés D'un Comportement Respiratoire Chez Lymnaea
Définir les attributs de chaque centrale modèle génératrices (CPG) neurones qui sous-tendent les divers comportements rythmiques sont fondamentales pour notre compréhension de la façon dont le cerveau contrôle moteurs programmes, tels que la respiration et de la locomotion. À cette fin, nous avons exploré une simple préparation d'invertébrés dont la base neuronale de la rythmogenèse respiratoire peut être étudiée de l'animal entier à un niveau de cellule unique. Un neurone dopaminergique identifié, appelé la pédale droite 1 dorsale (RPeD1), est une composante du réseau CPG qui contrôle la respiration aérienne, pilotée par l'hypoxie dans l'eau douce snail Lymnaea stagnalis. En utilisant des préparations de cerveau intact, semi-intactes et isolés, nous avons découvert que, en plus de son rôle comme un neurone CPG respiratoire, RPeD1 coordonnées sensori-moteur d'entrée depuis le pneumostome (l'orifice respiratoire) à l'interface eau/air à génération entreprendre de rythme respiratoire. Se trouvait également un rôle supplémentaire, roman de RPeD1. Plus précisément, stimulation intracellulaire directe de RPeD1 induite par les ouvertures pneumostome, en l'absence d'activité neuronale motrice. Pour déterminer plus loin le rôle de RPeD1 dans le comportement respiratoire des animaux intacts, soit son axone a été sectionnée ou tuent de façon sélective le soma. Plusieurs composantes du comportement respiratoire chez les animaux intacts ont été trouvés à être perturbée suite à une axotomie RPeD1 ou 'somatomy' (soma enlevé). Pris ensemble, les données présentées fournissent une démonstration directe que RPeD1 est un neurone multifonctionnel de CPG, qui sert également de nombreux autres rôles dans le contrôle du comportement, allant de la coordination des mécanosensoriels d'entrée pour la commande de moteur de l'orifice respiratoire de respiration.
Les Cellules Périphériques De Détection Oxygène Modulent Directement La Sortie D'un Modèle Central Respiratoire Identifié, Générant Des Neurones
Respiration est un comportement homéostatique essentiel réglementé par réseaux neurones centraux, souvent appelés générateurs de patron central (GPC). Malgré les progrès constants dans notre compréhension du contrôle neuronal de la respiration, les mécanismes de base par lequel les périphérique entrée module l'activité de la CPG respiratoire centrale demeurent insaisissables. Ce manque de connaissances fondamentales vis-àvis le rôle des influences périphériques dans le contrôle de la CPG respiratoire est due en grande partie à la complexité des centres de contrôle de la respiration chez les mammifères. Nous avons donc développé un modèle d'invertébrés plus simple pour étudier les mécanismes de base cellulaires et synaptiques par lequel une périphérique entrée chemosensory affecte la CPG respiratoire centrale. Nous rapportons ici sur l'identification et la caractérisation des cellules de chémorécepteurs périphériques (PCRCs) qui relaient l'information la connu respiratoire CPG neurone pédale droite 1 dorsale dans le mollusque Lymnaea stagnalis chemosensory sensible à l'hypoxie. Perfusion sélective de ces PCRCs avec une solution saline hypoxique déclenche rupture d'activité dans ces neurones et quand isolées en culture cellulaire ces cellules a également montré la sensibilité hypoxique qui a donné lieu à une activité de fortification et de dépolarisation membranaire. Lorsque co-cultivées avec pédale droite 1 dorsale, les PCRCs développé les synapses qui présentaient une forme de la plasticité synaptique à court terme en réponse à l'hypoxie. Enfin, dénervation osphradial chez les animaux intacts perturbé significativement l'activité respiratoire par rapport à leurs homologues de l'imposture. Cette étude fournit des preuves pour une connectivité synaptique directe entre un élément régulateur périphérique et un neurone CPG respiratoire central, révélant un locus potentiel pour la plasticité synaptique induite par l'hypoxie qui sous-tendent le comportement de la respiration.
Antidépresseur Fluoxétine Supprime La Croissance Neuronale De Neurones Vertébrés Et Invertébrés Et Perturbe La Formation Des Synapses Entre Les Neurones Lymnaea
Les régimes actuels de traitement pour une variété de troubles mentaux impliquent différents selective serotonin reuptake inhibitors comme la fluoxétine (Prozac). Bien que ces médicaments peuvent « gérer » le patient mieux, il y n'a pas eu un changement significatif dans le paradigme de traitement au cours des années et n'ont des résultats améliorés. Il y a aussi un débat considérable quant à l'efficacité de divers inhibiteurs de recaptage de la sérotonine et de leurs effets secondaires sur l'architecture neuronale et de la fonction. Dans cette étude, à l'aide de neurones du cortex chez les mammifères, une lignée de cellules de ganglions de la racine dorsale (cellules F11) et neurones Lymnaea stagnalis, nous fournissent la première preuve directe et sans équivoque que les concentrations cliniquement pertinentes de la fluoxétine induisent la croissance cône effondrement et la croissante neuritique rétraction des neurones sérotoninergiques et de non-sérotoninergiques ressemblent de manière dose-dépendante. En utilisant des enregistrements intracellulaires et le calcium, techniques d'imagerie, nous démontrons également que les effets mécanisme sous-jacent induite par la fluoxétine sur la rétraction des neurites des neurones Lymnaea peuvent impliquer d'abaissement du calcium intracellulaire et un retard ultérieur du cytosquelette de cône de croissance. À l'aide de soma soma synapses entre les neurones présynaptiques et postsynaptiques Lymnaea, nous apporter la preuve directe que cliniquement utilisé des concentrations de fluoxétine aussi bloquer la transmission synaptique et la formation des synapses entre les neurones cholinergiques. Notre étude soulève des alarmes sur potentiellement dévastateurs des effets secondaires de ce médicament d'antidépresseur sur la formation des neurites excroissance et synapse dans un cerveau en développement/régénération. Nos résultats démontrent également que les médicaments comme Fluoxetine peut juste ne pas affecter la communication entre les neurones sérotoninergiques mais que les effets néfastes sont très répandus et impliquent les neurones des phénotypes différents des espèces de vertébrés et d'invertébrés.
Une Silicon Novel Patch-clamp Chip Permis Haute Fidélité D'enregistrement De L'activité De Canaux Ioniques Fonctionnellement Neurones Définies
Nous rapportons un procédé de fabrication simple et à rendement élevé pour de silicium planes de patch-clamp puces, qui permettent une faible capacité et la résistance série de identifiés individuellement des neurones en culture. Ouvertures sont gravés dans un film de haute qualité de nitrure de silicium sur une plaquette de silicium; puits sont ouverts sur la face arrière de la plaquette par gravure humide et passivé par un film épais de dioxyde de silicium déposé à réduire la capacité de la puce et pour faciliter la formation d' une cellule à haute impédance d'étanchéité d'ouverture. La surface de puce est adapté pour la culture de plus de neurones un petit orifice dans le substrat avec un minimum de courant de fuite. Collectivement, ces fonctionnalités permettent de haute fidélité de l'enregistrement électrophysiologique des courants transmembranaires résultant de l'activité des canaux ioniques dans les neurones en culture. En utilisant des cultures de neurones Lymnaea nous faisons preuve de cellules entières enregistrements actuels obtenus à partir d'un protocole de stimulation voltage-clamp, et en courant en mode pince nous rapportons des potentiels d'action stimulées par étapes dépolarisation de la membrane. Malgré la taille relativement importante de ces neurones, un bon contrôle temporelle et spatiale de la tension membrane cellulaire était évident. A notre connaissance c'est le premier rapport de l'enregistrement de l'activité des canaux ioniques et des potentiels d'action de neurones cultivés directement sur un plan de patch-clamp puce. Cette plate-forme d'interrogation a un potentiel énorme en tant que nouvel outil à fournir rapidement des informations à haute teneur en cours de tests pharmaceutiques pour enquêter sur des modèles in vitro de la maladie, ainsi que la physiologie neuronale et la plasticité synaptique.
Haute-fidélité De Patch-clamp Enregistrements De Neurones En Culture Sur Un Microchip Polymer
Nous présentons une puce polymère capable de suivre l'activité neuronale avec une fidélité jamais obtenu sur un plan de patch-clamp appareil. Cardio-respiratoires neurones pédale de gauche dorsale 1 (LPeD1) à partir de Lymnaea mollusques ont été cultivées sur la surface de la micropuce polyimide pour 2 à 4 heures. Neurones mis en culture formée joints à haute résistance (gigaseals) entre la membrane cellulaire et la surface entourant les ouvertures gravées dans le polyimide. La formation a été observée Gigaseal sans appliquer une force externe, telle que aspiration, sur les neurones. La formation d'gigaseals, ainsi que la résistance d'accès faible et des valeurs de capacité de shunt de la puce de polymère entraîné enregistrements haute fidélité. Sur la puce de la culture de neurones a permis, pour la première fois sur un polymère de patch-clamp dispositif, l'enregistrement des potentiels d'action de haute fidélité physiologiques. Microfabrication du poly hybride (diméthylsiloxane)-polyimide (PI-PDMS) micropuce est examiné, comprenant une technique à deux couches PDMS de traitement résultant en minimisant les variations rétrécissement.
Une Nouvelle Approche Révèle Des Tendances Temporelles De La Synaptogénèse Entre Les Cônes De Croissance Isolé Des Neurones Lymnaea
Toutes les fonctions du cerveau, allant du comportement moteur de la cognition, dépendent des modes de développement précis de la formation des synapses entre les cônes de croissance des neurones pré- et post-synaptiques. Alors que les données moléculaires pour la présence d'éléments « pré-assemblés » des machines synaptique avant le contact physique commence à émerger, le calendrier précis de la synaptogénèse fonctionnelle entre les cônes de croissance n'a pas encore été défini. En outre, on ignore si un premier montage de diverses molécules synaptiques situées dans les régions d'extrasomal (p. ex. les cônes de croissance) peut entraîner en effet des synapses pleinement matures et consolidés en l'absence de corps cellulaires de signalisation. Cette preuve est difficile à obtenir tant in vivo qu'in vitro parce que les sites d'extrasomal sont souvent difficiles, voire impossible, à l'accès pour analyse électrophysiologique. Nous démontrons une nouvelle approche afin de définir précisément les différentes étapes qui sous-tendent la formation des synapses entre les cônes de croissance isolé des neurones de pré- et post-synaptiques individuellement identifiables issues du mollusque Lymnaea stagnalis. Nous montrons pour la première fois que les cônes de croissance isolé transformés en « boules de croissance » ont une tendance innée à développer spécifiques et multiples des synapses dans les minutes suivant le contact physique. Nous démontrons également qu'un avant « synaptique historique » nombres premiers de la balle de croissance présynaptique à forme synapses plus vite avec les partenaires suivants. Il s'agit de la première démonstration qu'isolé Lymnaea cônes de croissance disposent des instruments nécessaires pour former des synapses fonctionnelles.
Enregistrements Des Neurones En Culture Et De L'activité Synaptique à L'aide De Copeaux De Patch-clamp
Technologie Planar patch-clamp de la puce a été développée afin d'améliorer l'évaluation de nouveaux composés d'efficacité thérapeutique et de sécurité. Cependant, cette technologie a été limitée à l'enregistrement de canaux ioniques, exprimée dans les cellules isolées de suspension, rendant l'étude de la fonction des canaux ioniques dans la transmission synaptique impraticable. Récemment, nous avons développé single et dual-enregistrement site planar patch clamp puces et démontré leur capacité à enregistrer l'activité des canaux ioniques des neurones mis en place dans la culture. Cette capacité offre la possibilité d'enregistrer à partir de synapses connectées neurones cultivés sur puce. Dans cette étude, que nous avons reconstitué, on-chip, un circuit simple synaptique entre présynaptique viscérales dorsales 4 neurones cultivés et post-synaptiques gauche pédale dorsale 1 neurones isolés du mollusque Lymnaea stagnalis. Nous rapportons ici les premiers enregistrements de puce planar patch-clamp de phénomènes synaptiques de ces paires de neurones et pharmacologiquement démontrent la nature cholinergique de cette synapse. Nous aussi signaler les enregistrements simultanés de double-site de neurones appariés et démontrent dédiée perfusion cytoplasmique de neurones individuels via sur puce microfluidique souterraine. Il s'agit de la première application de la technologie planar patch-clamp pour examiner la communication synaptique.
Une Nouvelle Forme De Présynaptique Potentialisation à Court Terme De CaMKII-dépendante Entre Neurones Lymnaea
Plasticité à court terme est censée servir de base à la mémoire de travail, les mécanismes cellulaires qui sont le moins bien compris dans le système nerveux. Dans cette étude, à l'aide d'in vitro reconstruit des synapses entre le neurone de Lymnaea identifié 4 dorsales viscérales (VD4) et laissé 1 dorsale pédale (LPeD1), nous démontrons une nouvelle forme de potentialisation à court terme (STP) qui est « d'utilisation »- mais pas dépendant du temps, à la différence des formes plus définis précédemment de la plasticité synaptique à court terme. En utilisant une configuration triple-cellule nous montrons pour la première fois qu'un seul neurone présynaptique peut potentialiser fiable des synapses inhibiteurs et excitateurs. Par ailleurs, nous démontrent que, contrairement aux formes décrites précédemment de STP, la potentialisation synaptique entre les neurones Lymnaea n'implique pas une sensibilisation des récepteurs postsynaptiques ou présynaptique calcium résiduel. Finalement, nous démontrons que STP à la synapse VD4-LPeD1 nécessite présynaptique calcium/calmoduline dépendante kinase II (CaMKII). Pris ensemble, notre étude identifie une nouvelle forme de STP qui peut servir de base à la fois court et long terme potentialisation, en l'absence de toute mesure de synthèse-dépendante de protéine et impliquent la CaMKII activité exclusivement dans la cellule présynaptique.
De Comprendre La Fonction Cellulaire à La Découverte De Nouveaux Médicaments : Le Rôle De La Technologie De Puce Planar Patch-clamp
Toutes les fonctions des cellules excitables se fondent sur des canaux ioniques qui sont incorporés dans leur membrane plasmique. Les perturbations de la fonction ou la structure de canal d'ion entraîner des pathologies allant de dysfonction cardiaque aux maladies neurodégénératives. Par conséquent, pour comprendre les fonctions des cellules excitables et remédier à leur physiopathologie, il est important de comprendre les fonctions de canal d'ion dans diverses conditions expérimentales - y compris l'exposition à des cibles de nouveaux médicaments. Patch-clamp de pipette de verre est la technique de pointe pour surveiller les propriétés intrinsèques et synaptiques des neurones. Cependant, cette technique est beaucoup de travail et a données à faible débit. Puces Planar patch-clamp, intégrés dans des systèmes automatisés, d'offrir des débits élevés mais sont limitées à des cellules isolées des suspensions, ce qui limite leur utilisation dans la modélisation d'une fonction physiologique. Ces puces ne sont donc pas plus adaptés aux études portant sur la communication neuronale. Multiélectrodes tableaux (AME), en revanche, avoir la possibilité de surveiller l'activité réseau en mesurant les potentiels de champs locaux de plusieurs sites extracellulaires, mais l'activité des canaux ioniques spécifiques est difficile à extraire de ces signaux multiplexés. Nous décrivons ici une technologie de puce de nouveaux planar patch clamp qui permet l'interrogatoire électrophysiologique haute résolution simultanée de neurones individuels sur des sites multiples dans les réseaux neurones synapses connectés, combinant ainsi les avantages des techniques MEA et patch clamp. Chaque neurone peut être sondée par une ouverture qui se connecte à un canal microfluidique souterraine dédiée. De plus en plus dans les réseaux de neurones sont alignés sur les ouvertures par physisorbées ou chimisorbés des signaux chimiques. Dans cette revue, nous décrivons le processus de conception et de fabrication de ces puces, approches de structuration chimique pour le placement de la cellule et présenter des données physiologiques des cellules neuronales cultivées.
