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Articles by Cynthia Andrews-Pfannkoch in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite
1Department of Microbial and Environmental Genomics, The J. Craig Venter Institute, 2Department of Synthetic Biology and Bioenergy, The J. Craig Venter Institute
Descriviamo un metodo efficace per separare singolo filamento di DNA a doppio filamento di DNA e le molecole di RNA virale ambientale comunità. Gli acidi nucleici sono frazionate mediante cromatografia di idrossiapatite con concentrazioni crescenti di fosfati contenenti buffer. Questo metodo consente l'isolamento di tutti i tipi virali acidi nucleici da campioni ambientali.
Other articles by Cynthia Andrews-Pfannkoch on PubMed
La Spedizione Di Sorcerer II Global Ocean Campionamento: Atlantico Nord-ovest Attraverso Il Pacifico Tropicale Orientale
Gli oceani contengono una miscela complessa di micro-organismi che per la maggior parte, sono atipici sia geneticamente e biochimicamente. Riportiamo qui uno studio metagenomica il microbiota planctonico marino in cui sono stati analizzati campioni di acqua (per lo più marini) superficie come parte della spedizione del Sorcerer II Global Ocean campionamento. Questi campioni, raccolti attraverso un parecchi mila km transetto dall'Atlantico del nord attraverso il canale di Panama e termina nel sud del Pacifico ha reso un ampio dataset costituito da letture di sequenziamento 7,7 milioni (6,3 miliardi bp). Anche se alcuni cladi principali microbiche dominano la nicchia Marina planctonica, il dataset contiene grande diversità con l'85% della sequenza assemblata e 57% dei dati smontati unico a un'identità di sequenza 98% taglio. Utilizzando i metadati associati a ciascun campione e sequenziamento biblioteca, abbiamo sviluppato nuove comparative genomic e metodi di montaggio. Un metodo di genomico comparativo, definito "frammento reclutamento," affrontate questioni di struttura del genoma, evoluzione e diversità tassonomica o filogenetica, così come la diversità biochimica dei geni e delle famiglie del gene. Un secondo metodo, definito "estremo assieme," hanno reso possibile l'assembly e la ricostruzione di grandi segmenti di organismi abbondanti ma chiaramente nonclonal. All'interno di tutte le popolazioni abbondanti analizzate, abbiamo trovato ampia intra-Ribotipo diversità in diverse forme: (1) variazione di sequenza estesa all'interno orthologous regioni nel corso di un dato genoma; Nonostante la copertura di singoli ribotypes si avvicina 500-fold, più singole sequenziamento letture sono uniche; (2) numerosi cambiamenti nel gene contenuto alcune con dirette implicazioni adattive; e (3) isole genomic ipervariabili che sono troppo variabile da assemblare. La diversità intra-Ribotipo è organizzata in popolazioni geneticamente isolate che sono sovrapposti ma distribuzioni indipendenti, che implica diverse preferenze ambientali. Noi presenti nuovi metodi per misurare la somiglianza tra campioni metagenomici genomic e mostrare come essi possono essere raggruppati in diversi tipi di comunità. Adattamenti funzionali specifici possono essere identificati all'interno di singoli ribotypes e tutta la Comunità intera, compreso proteorhodopsin spettrale tuning e la presenza o l'assenza del gene fosfato-associazione file PST.
Campionamento Spedizione Sorcerer II Global Ocean: Caratterizzazione Metagenomica Del Virus All'interno Di Campioni Microbiche Acquatiche
I virus sono entità biologiche più abbondanti sul nostro pianeta. Interazioni tra virus e loro ospiti impatto diversi importanti processi biologici negli oceani del mondo come trasferimento orizzontale di geni, diversità microbica e biogeochimici in bicicletta. Interrogatorio della metagenomica microbica sequenza dati raccolti nell'ambito del Sorcerer II Global Ocean spedizione (GOS) ha rivelato un'elevata abbondanza di sequenze virali, che rappresentano circa il 3% delle proteine totali previsti. Cluster analisi delle sequenze virali ha rivelato centinaia di migliaia di geni virali codifica varie funzioni metaboliche e cellulari. Analisi quantitativa dei geni virali di origine host eseguita sulla frazione virale dei campioni acquatici ha confermato la natura virale di queste sequenze e suggerito che porzioni significative delle Comunità acquatiche virale si comportano come serbatoi di tale materiale genetico. Analisi filogenetiche e distributivi di queste sequenze virali derivate da host ha anche suggerito che acquisizione virale dei geni ecologicamente rilevanti di origine host è un fenomeno più abbondante e diffuso che precedentemente apprezzato. Il predominante sequenze virali identificate all'interno delle frazioni microbiche ha provenuto dalla coda batteriofagi ed esposto diverse distribuzioni globali secondo la famiglia virale. Assunzione di frammenti di sequenza virale GOS contro 27 completa acquatica genoma virale ha rivelato che un solo genoma del batteriofago riferimento era molto abbondante e strettamente correlati, ma non identico, a cyanomyovirus P-SSM4. I contratti su tutti i siti di campionamento delle sequenze di P-SSM4-come con l'ecotipo dominante del suo ospite, Acinetobacter supporta la classificazione delle sequenze virali come P-SSM4-like e suggeriscono che questo virus può influenzare l'abbondanza, la distribuzione e la diversità di uno dei componenti più dominante di Odum negli oceani oligotrofe. In sintesi, l'abbondanza e ampia distribuzione geografica delle sequenze virali all'interno delle frazioni microbiche, la prevalenza di geni tra sequenze virali che codificano la funzione fisiologica microbica e la loro distribuzione filogenetica distinti dare forte sostegno alla nozione che acquisizione virale-mediata del gene è un meccanismo comune e in corso per generare diversità microbica in ambiente marino.
Sintesi Chimica Completa, L'assembly E La Clonazione Di Un Genoma Di Mycoplasma Genitalium
Noi abbiamo sintetizzato una coppia 582.970-base del genoma di Mycoplasma genitalium. Questo genoma sintetico, denominato M. genitalium JCVI-1.0, contiene tutti i geni del selvaggio-tipo M. genitalium G37 tranne MG408, che è stato interrotto da un marcatore antibiotico per bloccare la patogenicità e per consentire la selezione. Per identificare il genoma come sintetica, abbiamo inserito "filigrane" presso intergenic siti conosciuti a tollerare gli inserimenti trasposone. Sovrapposizione "cassette" di 5 a 7 kilobasi (kb), assemblati da oligonucleotidi chimicamente sintetizzati, sono stati raggiunti da ricombinazione in vitro per produrre gli assembly intermedi di circa 24 kb, 72 kb ("1/8 genoma") e 144 kb ("1/4 del genoma"), che erano tutti clonati come cromosomi artificiali batterici in Escherichia coli. La maggior parte di questi cloni intermedi sono stata sequenziata e cloni di tutti i quattro 1/4 sono stati identificati genomi con la sequenza corretta. Il genoma sintetico completo è stato assemblato da trasformazione associata ricombinazione clonazione nel lievito Saccharomyces cerevisiae, quindi isolato e sequenziato. È stato identificato un clone con la sequenza corretta. I metodi descritti qui sarà generalmente utili per la costruzione di grandi molecole di DNA dai pezzi chimicamente sintetizzati ed anche combinazioni di segmenti di DNA naturali e sintetici.
Metaproteogenomic Analisi Di Un Batterio Di Zolfo Verde Dominante Dal Lago Di Ace, Antartide
Batteri verdi dello zolfo (GSB) (Chlorobiaceae) sono i produttori primari che sono importanti in carbonio e zolfo in bicicletta in ambienti naturali. Una sequenza quasi completa del genoma per una singola, dominante specie GSB (C-Ace) è stata assemblata da dati di sequenza del fucile di un campione ambientale adottate da O (2)-H (2) S interfaccia di colonna d'acqua del lago di Ace, Antartide. Circa 34 Mb di dati di sequenza del DNA sono stati assemblati in nove ponteggi per un totale di 1,79 Mb, che rappresenta circa 19-fold copertura per il genoma composito C-Ace. Un livello elevato (circa 31%) di copertura di metaproteomic è stato raggiunto utilizzando biomassa abbinato. L'approccio di metaproteogenomic fornito unico spaccato il complemento della proteina necessario per dominare la comunità microbica in condizioni di luce fredde, nutriente-limited, ossigeno-limitata ed estremamente variegate annuale. C-Ace Mostra tratti fisiologici che promuovono la sua capacità di competere efficacemente con altri GSB e guadagno dominanza (ad esempio, bacteriochlorophylls specifico, meccanismi di adattamento freddo) così come un rapporto syntrophic con solfato-riduzione batteri che fornisce un meccanismo per lo scambio dei composti solforati. Di conseguenza siamo in grado di proporre una spiegazione dei processi biologici attivi promosso da freddo-adattati GSB e le strategie adattive che usano per prosperare nelle condizioni gravi fisiochimici prevalente negli ambienti polari.
Creazione Di Una Cellula Batterica Controllata Da Un Genoma Chimicamente Sintetizzato
Riportiamo la progettazione, sintesi e assemblaggio del genoma 1,08-mega-base coppia Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 a partire da informazioni di sequenza del genoma digitalizzato e il trapianto in una cellula ricevente di M. capricolum per creare nuove cellule mycoides M. che sono controllate solo dal cromosoma sintetico. Il solo DNA nelle cellule è la sequenza del DNA sintetica progettata, tra cui "filigrana" sequenze e altre delezioni del gene progettato polimorfismi e mutazioni acquisite durante il processo di costruzione. Le nuove cellule hanno previsto la proprietà fenotipiche e sono in grado di auto-replicazione continua.
Separazione Di Idrossiapatite-mediata Di Double-stranded Del DNA Single-stranded Del DNA E RNA Genoma Da Assemblaggi Virali Naturali
Metagenomica può essere utilizzato per determinare la diversità delle Comunità complesse, spesso unculturable, virale con varie composizioni dell'acido nucleico. Qui, segnaliamo l'uso della cromatografia di idrossiapatite efficientemente frazionare DNA double-stranded (dsDNA), DNA a singola elica (ssDNA), dsRNA e genomi ssRNA dal noti batteriofagi. Librerie linker-amplificato fucile sono state costruite per generare il sequenziamento letture da ogni frazione di idrossiapatite. Superiore al 90% della recita visualizzato somiglianza significativa per i genomi previsti a livello del nucleotide. Questi metodi sono stati applicati ai virus marini raccolti dalla baia di Chesapeake e il parco nazionale di Dry Tortugas. Acidi nucleici isolati erano frazionati mediante cromatografia di idrossiapatite seguita da sequenziamento e costruzione della libreria fucile amplificato dal linker. L'analisi tassonomica ha dimostrato che la maggior parte delle sequenze ambientale, indipendentemente dalla loro origine dell'acido nucleico, era più simile ai virus dsDNA, riflettendo il bias di banche dati di sequenza virale metagenomica.
Uno Studio Integrativo Di Un Ecosistema Lago Ghiaccaio in Antartide
In natura, la complessità e la struttura della comunità microbica varia ampiamente, che vanno da poche specie di migliaia di specie e da comunità altamente strutturata a altamente strutturati. Qui, descriviamo l'identità e la capacità funzionale delle popolazioni microbiche all'interno di strati distinti di un incontaminato, derivato da marine, ghiaccaio (stratificato) Lago (Ace) in Antartide. Open reading frame 9 milioni sono stati analizzati, che rappresentano microbiche campioni prelevati da sei profondità della dimensione del lago frazionato su sequenziale 3.0, 0,8 e 0,1 μm filtri e compreso metaproteome dati da 0,1 μm filtri corrispondenti. Determinare come le interazioni dei membri di questa comunità altamente strutturato e moderatamente complesso definiscono i flussi biogeochimici in tutto l'intero lago. La nostra visione è che la salute di questo delicato ecosistema è dettata dagli effetti del ciclo luce polare sul ruolo dominante dei batteri verdi dello zolfo nella produzione primaria e nutrienti in bicicletta e l'influenza del virus/dei fagi e fago resistenza sulla cooperazione tra i membri della comunità microbica di destra in tutto il lago. Per testare le nostre asserzioni e sviluppare un quadro applicabile ad altri ecosistemi microbica guidati, abbiamo sviluppato un modello matematico che descrive come cooperazione all'interno di un sistema microbico è influenzato dalle fluttuazioni periodiche nei parametri ambientali chiave popolazioni di microrganismi. Il nostro studio rivela una struttura mutualistiche all'interno della comunità microbica in tutto il lago che è sorto come il risultato di interazioni meccanicistiche tra i parametri fisico-chimici e la selezione dei singoli membri della Comunità. Da esaustivamente descrizione e modellazione di interazioni in Ace lago, abbiamo sviluppato un approccio che può essere applicabile all'apprendimento come perturbazioni ambientali possono influenzare le dinamiche microbiche in sistemi acquatici più complessi.
Virofago Controllo Della Dinamica Antartico Algali Ospite-virus
Virus sono abbondanti onnipresenti membri di comunità microbiche e in ambiente marino influire sulla struttura della popolazione e dei nutrienti in bicicletta da infettare e lisi produttori primari. Laghi antartici sono ecosistemi microbica dominati sostegno troncato food webs in cui virus esercitano una grande influenza sul ciclo microbica. Qui riportiamo la scoperta di un Virofago (parente del Virofago Sputnik recentemente descritto) che preda Phycodnaviridae che infettano Prasinophyta (alghe phototrophic). Effettuando analisi metaproteogenomic su campioni da Organic Lake, un lago di ghiaccaio ipersaline in Antartide, completo Virofago e quasi completa Phycodnaviridae genomi sono stati ottenuti. Introducendo il Virofago come un predatore supplementare di un modello dinamico di predatore-preda abbiamo determinato che la Virofago stimola la produzione secondaria attraverso il microbial loop riducendo mortalità complessiva dell'host e aumentando la frequenza delle fioriture durante i periodi di luce estate polare. Virophages rimase abbondanti nella y lago 2 più tardi e furono rappresentati da popolazioni con un elevato livello di variazione di sequenza della proteina maggiore del capside (25-100% identità). Virofago firme sono state trovate anche nel vicino lago di Ace (in abbondanza) e in due laghi tropicali (ipersalina e fresco), un estuario e un sito di risalita sull'oceano. Questi risultati indicano che virophages regolare le interazioni ospite-virus, influenza il flusso di carbonio globale nel lago organica e giocare ruoli precedentemente non riconosciuti nei diversi ecosistemi acquatici.
