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Articles by Daniel J. Turner in JoVE
JoVE General
iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council - MRC, 2European Bioinformatics Institute, EMBL Heidelberg, 3Computer and Information Science, University of Ljubljana, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute
転写でRNA結合蛋白質の空間配置は、転写後調節の重要な決定要因である。したがって、我々は、RNA結合タンパク質の結合部位の正確なゲノムワイドなマッピングを可能にする個々のヌクレオチドの解像度のUV架橋及び免疫沈降（iCLIP）を開発。
Other articles by Daniel J. Turner on PubMed
リガーゼ検出反応を用いたメラニン細胞性の病変の変異 BRAF 変異の検出。
BRAF RAF キナーゼ ファミリのメンバーであり、それは RAS 地図キナーゼ シグナル伝達カスケードによるシグナル伝達を促進します。研究が示している黒色腫と母斑の大半を示す活性化変異 (T1799A) 変異 BRAF exon 15 内。BRAF の追加研究は T1799A の突然変異が不在であることを示している脈絡膜悪性黒色腫とスピッツ母斑で。
5 S RDNA 単位海ビート （ベータ版尋常性病菌 Maritima) で要約されます。
5 S rDNA のポリメラーゼ連鎖反応による拡大を繰り返してベータ版尋常性病菌 maritima の単位フルレングス 5 秒単位に対応する 4 の要約されたユニット クラスはまた明らかに、350 bp 製品がそれぞれにスペーサーのほとんどと 12 76 bp コーディング シーケンスの削除削除で起因しました。それぞれ少なくとも 1 保存された要素の 5 s 遺伝子の転写に関与してこれが機能しないように見える種類を欠いている要約されます。ネットワーク分析要約ユニット フルレングスのバージョンと同じ方法で進化していることを明らかにしました。
達成するために耐熱性の EndoV による非対称基板認識を活用マルチプレックス SNP タイピングでリニア増幅バランス。
PCR またはストランド変位増幅の特定の DNA シーケンスの多重増幅は、本質的に偏りのあるプロセスです。相対的な豊かさの増幅された DNA は元の表現から大幅に変更することができ、極端なケースで、アレルのドロップ アウトが発生することができます。協同組合、シーケンス依存性 DNA ミスマッチ修復酵素エンドヌクレアーゼ V (EndoV) から Thermotoga 海洋センター (Tma) および細菌第 (Bst) DNA ポリメラーゼの機能に依存する DNA の線形増幅の手法を提案する.Tma EndoV 未変更の二重 dna 一本鎖 Bst ポリメラーゼによって拡張することによってニックすることができます。不一致が不一致自体を取り巻く拠点を制御することにより、EndoV と拡張子によって Bst ポリメラーゼによって刻み目をつける人の効率を制御できます。メソッドは、現在 100 の多重増幅流水の平均の変化を実行するターゲット分子のことができます < 1.3 倍そのオリジナルの表記。のみ 1 つのプライマーが必要なので、プライマーの工芸品と非特異的増幅製品が最小化されます。
染色体の逆転による単一分子 Haplotyping の試金。
逆転構造変化の重要な形ですが、そのブレークポイントはしばしば倒立繰り返し内秋として彼らを特徴付けることは困難です。我々 は 'では、反転ブレークポイント ヒトのゲノム DNA 上単一分子融合 PCR を実行することによって発症誘因ですハプロタイプ フュージョン' と呼ばれる手法を開発しました。単一コピー シーケンスの反転ブレークポイント ブラケティングを融合ジェノタイピング アッセイ用 int22 の血友病 A 反転 Xq28 を例示、配向特異 PCR の製品を生成します。さらに、我々 反転イベントのブレークポイントが長い内埋め込まれてことを実証 （目 100 kb) 倒立繰り返し発症誘因ビーズによる単一分子 haplotyping による繰り返し特異的マーカーのインバージョン ブレークポイントをブラケットに続いてハプロタイプ融合 PCR によってすることができます。ジェノタイピング主催 Yp 腕インバージョンによってこのメソッドを示すため目 300 kb の長さ倒立繰り返されます。私たちの方法、調査と遺伝子型の染色体逆転への一般性ゲノムの変異、遺伝病、がんの逆転の貢献の私達の理解を助けるべきであります。
人間の Y 染色体短腕に構造のバリエーション: アメロゲニン Y を取囲む再発の多重遺伝子族の削除。
構造多型はますます人間のゲノムの変化の主要な形式として認識され Y 染色体上特に流行しています。アッセイ Yp に Y アメロゲニン遺伝子 (AMELY) のテスト、DNA ベースのセックスで広く使用されているし、時々 間隙削除持っている男性を明らかにします。12 集団から 45 削除男性のコレクションは、タグ付きのシーケンス サイト マッピングの組み合わせを使用し、バイナリ マーカーおよび Y 短いタンデムこのバリエーションの構造的基盤を理解する haplotyping を繰り返します。45 削除男性の 41 の区別がつかない削除、3.0 3.8 Mb のサイズを運ぶ。ブレークポイントのマッピングは、TSPY 繰り返し、遺伝子を含むの近位の主要な配列と TSPY の単一の遠位部のコピーの間の非対立相同組換え機構強く関係づける;これは削除され、削除されていない男性で TSPY コピー数の推定によってサポートされます。残りの 4 つの男性は、非相同のメカニズムが原因かもしれない 3 つ異なる非再発削除 (2.5 4.0 Mb） を運ぶ。Haplotyping は、TSPY を介した削除 7 回独立サンプルで生じていないいるということを示しています。30 染色体ハプロ グループ J2e1 ※ 内インド起源の主によって表される 1 つのインスタンス/M241, は約 7700 1300 年の +/-の time-to-most-recent-common-ancestor。AMELY、に加えてすべて削除男性 PRKY と TBL1Y、遺伝子を欠いているし、稀削除クラスはまた PCDH11Y を欠いています。永続性と表現型の直接の証拠とともに、削除系統の拡大を示唆これらの遺伝子の不在が主要な有害な影響を与えません。
De Novo 減数分裂欠失と重複のいくつかのゲノム障害を引き起こしての生殖率を。
削除、重複、反転、転置、減数分裂組み換え類似性の高い重複シーケンス （での相同組換えは、ナイル川） 間を生成し、'としてゲノム障害' は、ほとんどの用量感受性遺伝子の変化のコピー数によって引き起こされる知られている遺伝的疾患の責任です。ナイル川のホット スポットはいくつか重複のシーケンス内で識別されています。我々 は相互の削除そして重複 4 ナイル川のホット スポットでの de novo 率を測定するために精子ベースのアッセイを開発しました。ナイル川の重複シーケンスの異なるペア間の相対的な料金を解剖するこれらの試金を使用します。私達は示す (i) これらのナイル川のホット スポットが特定の減数分裂には、(ii) 削除彼ら相互の重複オスの生殖細胞と (iii) これらのゲノムの疾患のいくつかは、おそらくされている臨床的に最も特にその 7q11、ウィリアムズ Beuren 症候群を引き起こして削除の逆数の重複から生じる underascertained ですよりも高いレートで生成されます。
ゲノム超並列ペアエンド シーケンスを用いた癌ペアエンド再編成の同定。
人間のがんは、しばしばいくつかの癌の開発に関与することが、多くのペアエンド ゲノムの再構成を運ぶ。ただし、再編成を特徴付けるための従来の戦略は骨の折れると低スループットと低感度や貧しい人々 の解像度があります。大量並列シーケンスを使用、肺癌を持つ 2 つの個人のゲノムから派生した短い DNA のフラグメントの両端からシーケンス リードを生成します。正しくお互いに関して参照ヒトゲノム上揃えでしたいないペアを読むの調査によって、306 の生殖構造変形と 103 の体細胞の再編成塩基対レベルの解像度に特徴づけられます。生殖細胞と体細胞の転位のパターンは著しく異なっていた。特にタンデム重複を含む、これらの地域外の語順換えも認められたが多く体細胞再構成 amplicons から.いくつかの体細胞の再編成は 2 つの内部タンデム重複からと染色体再配列によって作成された 2 つの融合成績などを含む異常の成績証明書につながった。生殖細胞系列は、主にしばしば AluY とラインの要素を含むレトロ転移によって仲介されました。結果は、この戦略を使用する癌と関連付けられる遺伝子の新しい収穫の見通しを引き上げ、複雑なひと癌のゲノム再編成の組織的、ゲノム広い特性評価の可能性を示します。
長距離、高スループットのハプロタイプ定量ハプロタイプ融合 PCR および結紮 Haplotyping を介して。
結紮 Haplotyping 堅牢で、新規メソッドのハプロタイプの実験的決定シーケンスと構造変異の試金に適用することができます、長い距離を介してです。シンプルさと染色体の大再編のジェノタイピングと haplotyping の方法の有効性、SNPs 長距離それ集団遺伝学と進化、疾患協会と継承、およびゲノムの変異の研究に有益になる方法論のレパートリーへの貴重な強力な付加を作る。約強く不妊を引き起こす XY 転座のと haplotyping での生殖細胞率に影響を与えるの 60 ％ 北西ヨーロッパ人男性では 16.4 kb 離れて 7、染色体にうそをつくし、全身性エリテマトーデスへの個々 の感受性に影響を与える 2 つの常染色体優性 SNPs 発見ジェノタイピング Yp 腕反転などによって両方のメソッドの汎用性を示しています。
免疫沈降による DNA の分化系列決定メチローム解析のためのベイズ デコンボリューション戦略。
DNA のメチル化は、哺乳類のゲノムの発現を調整するために必要な不可欠なエピジェネティックな修飾です。DNA の分化系列決定メチローム解析のための免疫沈降ベースの方法でこのデータ生成からフィールド データ解析より良い分析ツールの開発を必要とするボトルネック急速にシフトしています。特に、絶対メチル化レベルを見積もることができないこと免疫沈降を用いた DNA メチル化のプロファイリングと関連付けられている分析の主要な困難のままです。この問題に対処するには、我々 は、メチル化の分析 （バットマン） のためのクロス プラットフォーム アルゴリズム ベイズ ツール開発-オリゴヌクレオチドのアレイ （MeDIP チップ） や次世代シーケンシング (MeDIP-seq) を使用して生成されるメチル化 DNA 免疫沈降 (MeDIP) プロファイルを分析します。高解像度全ゲノム DNA のメチル化プロフィール (DNA 分化系列決定メチローム) 哺乳類のゲノムの提供するために後者のアプローチを開発しました。これらの重亜硫酸塩の配列を使用して取得した成熟した人間の精子を使用して取得、我々 のデータの強い相関関係を示唆する MeDIP seq やバットマンと MeDIP チップ組み合わせて堅牢で定量的かつコスト効果の高い機能ゲノム戦略 DNA のメチル化の機能を解明するため提供します。
イルミナ シーケンス システムへの大規模なゲノム センターの改善。
ウェルカム ・信頼・ サンガー研究所、世界の最大のゲノム センターの一つですし、私たちシーケンスのかなりの量が次世代の大規模並列シーケンス テクノロジーで実行されます: 2008 年 6 月当社ゲノム アナライザー (イルミナ) プラットフォームによって生成される純度フィルター シーケンス データの量に達した 1 terabase と私たちの平均週間イルミナ生産出力は現在 64 102-125億塩基です。ここで我々 はバイアスを減らすために高スループット環境では、ライブラリの準備をより信頼できるように、標準のイルミナ プロトコルに挿入サイズ分布を強化し、高収率のデータを確実に入手した改善のセットについて説明します。
無料の増幅イルミナ シーケンス ライブラリの準備を容易に改善されたマッピングとアセンブリ (G + C)-バイアス ゲノム。
増幅アーティファクトのライブラリ、イルミナ ゲノム アナライザー備中導入割合がかなりこれらのシーケンスを重複するし、ターゲット シーケンスの領域を越えて読み取りカバレッジの偏在を引き起こす可能性が高くなります。結果として、特に、シーケンス ゲノムから極端に高または低 G + C の基本組成コンテンツですいつ短い読み取りからゲノム アセンブリと変動解析における困難の結果にこれらの不利な機能。ここでは無料の増幅の手法では PCR ではなくクラスター増幅ステップ完全結紮テンプレートの鎖のため読み取りマッピングと一塩基多型を呼び出すし、de novo アセンブリを助ける改善重複シーケンスの発生率を減らす豊かに、ライブラリの準備の存在します。我々 これを生成して非常に dna 塩基配列からの分析を示しています (G + C)-貧しい人々 （原虫）、（G + C) - 中立 (大腸菌) および (G + C) - リッチ （百日咳） ゲノム。
次世代シーケンシング脊椎動物実験生物の。
次世代シーケンシング技術革命生物ゲノムの転写因子結合部位のプロファイリング、トランスクリプトーム シーケンシング、およびより多くの最近では、全ゲノムを許可する順序。それは、現在次世代シーケンシング、シーケンスの長さと新しいアセンブリ アルゴリズム データ セットが大きいと相まってスループット、読み取りの改善による高等脊椎動物のゲノムの完全なデ novo アセンブリを生成することはできませんがすぐにこれを実現します。これらの開発はどのゲノムデータの革命を使用して遺伝学と疾患遺伝子探索のためのモデル有機体の使用方法を理解しますターン スポーンにされます。このレビューは現在次世代シーケンシング プラットフォームと次世代シーケンサー データ解析のための最新の計算ツールの概要を示します。またどのように次世代シーケンサーについて述べる脊椎動物のモデル生物の遺伝学のコンテキストに適用されることがあります。
イルミナ ゲノム アナライザー シーケンス システムのための改良されたプロトコル。
このユニットでは、我々 は確実に高収率データの取得、挿入サイズの分布を狭く、増幅バイアスを減らす、シーケンス処理より信頼性の高い、高スループット環境で確認する標準のイルミナ ゲノム アナライザー プロトコルにした改善のセットについて説明します。
TSPY1 コピー数変異は、精子形成に影響を与えるし、Y 系統間の違いを示しています。
TSPY1 は、約 21 35 コピーの配列形成ヒト Y 染色体上の縦列繰り返さ遺伝子です。精巣の表現のパターンと TSPY1 蛋白質の推定機能精子形成過程における関与の可能性が示唆された.ただし、データは異なる Y 系統での TSPY1 コピー数変異と精子形成過程におけるその役割に不足しています。
イルミナ技術を用いた指向性トランスクリプトーム シーケンスのための簡単な方法。
高スループット シーケンス cDNA のゲノム規模を単一塩基解像度での真核生物の転写を研究に使用されています。細菌細胞の高リボヌクレアーゼ活動を補うために、RNA のサンプルの操作を最小限に抑える完全の原核生物トランスクリプトームの勉強のために最適化された同等のテクニックを考案しています。この新しいアプローチは、イルミナ技術方向や転写、ゲノム全体のレベルの情報の生成、シーケンス一本鎖 (ss) cDNA を使用します。プロトコル、および関連データ解析プログラム http://www.sanger.ac.uk/Projects/Pathogens/Transcriptome/から自由に利用可能です。我々 は、正常に細菌性病原体のサルモネラ bongori と肺炎球菌と酵母 2s3-am4 にこの手法を適用した.このメソッドは、silico 予測遺伝子機能の実験的検証を可能し、小説の成績証明書、ゲノム全体を簡単に識別できます。またからの ss cDNA の遺伝子発現のレベル間の高い相関の計算し、その ss cDNA シーケンスを起訴二重鎖 cDNA シーケンス、堅牢かつ適切な転写の定量的研究で使用するためですがあることを示す.したがって、この単純な方法は原核生物と真核生物のゲノムの注釈と遺伝子発現研究を支援に便利なツールを証明する必要があります。
100 万トランスポゾン変異体を用いたサルモネラの発疹チフスのあらゆる遺伝子の同時の試金。
非常に高スループット シーケンス テクノロジーは我々 ゲノム シーケンスで現在の爆発をフルに活用している場合高スループット機能研究によって一致する必要があります。我々 の推定 110 万トランスポゾン変異株から成る、非常に大規模な細菌変異のプールを生成しているし、我々 はこの突然変異のプール、イルミナ ヌクレオチド シーケンスからゲノム DNA トランスポゾンとに隣接するターゲット DNA シーケンスから首相に使用しています。このメソッドには、私たちは TraDIS と呼んでいる （トランスポゾン監督挿入部位のシーケンス）、370,000 ユニークなトランスポゾン挿入サイト サルモネラ鶏卵の血清型の発疹チフス染色体にマップすることができた。前例のない密度と解像度のマップの挿入のサイト、1 つの平均すべて 13 の塩基対アッセイのあらゆる遺伝子のゲノムかんじんので同時に候補者必須遺伝子のゲノムワイドなリストを生成することができました。加えて、アッセイの半自然私たちの有利な遺伝子と標準研究室の条件下での成長のために不利なものはそれらを識別する許可。ウシ胆汁の有無での次の成長が有効になって胆汁耐性、任意の腸内細菌のチフスのキャリッジ胆嚢内に必要な特性への貢献のために試金するためすべての遺伝子変異のプールの比較この画面は、我々 は同時にすべて必須遺伝子特定のニッチを識別するゲノムにおける遺伝子を試金することができます我々 の仮説検証。
高スループット ハプロタイプ定量ハプロタイプ融合 PCR および結紮 Haplotyping による長距離。
ハプロタイプ融合 PCR (HF-PCR) を組み合わせると、結紮 haplotyping 実証決定長距離シーケンスと構造変化の試金に適用することができますハプロタイプの堅牢な高スループット方法です。対立遺伝子特定の PCR と長い PCR などのハプロタイプ定量への代替アプローチとは異なり HF PCR および結紮 haplotyping を経験しない mispriming テンプレートの切り替えエラーから。このメソッドでは、HF PCR は DNA シーケンス単一ヌクレオチドの多形 (SNPs) またはいくつかの kilobases によって区切られた paralogous 塩基配列変異 (PSVs) を含む単一分子テンプレートからを並置する使用されます。HF PCR はエマルジョン系融合急速に、96 ウェル フォーマットで実行できる PCR を使用します。その後、結紮ベースのアッセイ ハプロタイプを決定するため、HF PCR の製品に実行されます。製品は、キャピラリー電気泳動によって解決されます。最適化後は、プロシージャは一日段階的ハプロタイプからゲノム DNA を生成する半を取ってすぐに実行できます。
FRT Seq: 無料の増幅、ストランド固有のトランスクリプトーム シーケンス。
トランスクリプトーム シーケンスで逆転写反応、フローセルで起こるイルミナ ゲノム アナライザー用に代替的アプローチを報告します。増幅を行わないライブラリ調製時だからバイアスの PCR および重複の回避し、poly(A)(+) RNA の cDNA ではなく、テンプレートであるため、結果のシーケンスを必ずしもストランドに固有です。メソッド ペアまたはシングル エンドの配列と互換性があります。
次世代シーケンシング ターゲット濃縮戦略。
我々 はまだ全体真核生物ゲノムの多数のルーチンのシーケンスで実現可能なポイントを達していないとので通常興味のゲノム領域を選択してシーケンス処理する前にこれらの地域を豊かにする必要があります。いくつかの濃縮のアプローチは、それぞれ固有の長所と短所があります。ここで我々 の経験と最先端のターゲット濃縮技術、我々 は、実行の最適化、それぞれを使用して得ることができる典型的な結果について説明します。エンドユーザーの特定のプロジェクトのため感度, 特異性と均一性の最適なバランスを見つけることができますので、我々 はまた各技術の詳細なプロトコルを提供します。
神経 MeCP2 はヒストン 8 量体レベルの近くで表現され、グローバルにクロマチン状態を変更します。
MeCP2 ヒストン脱アセチル化酵素を募集できるメチル化された DNA の親和性と核蛋白質であります。MeCP2 の過剰または欠乏細胞分子の数が正確に規制される必要があることを示唆、重度の神経学的問題を引き起こします。我々 は MeCP2 神経核の定量化し、ヒストン 8 量体としてほど豊富であることがわかった。この高い豊富にもかかわらず MeCP2 優先的メチル化領域と関連付けます、そのゲノム結合メチル CpG 密度トラックと高スループット シーケンスを示した。MeCP2 欠乏は神経細胞クロマチン構造を高架のヒストンのアセチル化ヒストン H1 の倍増などのグローバルな変更の結果します。どちらも変更が MeCP2 より低いレベルで発生するグリア細胞で検出可能です。突然変異体の脳はまた高架転写反復的な要素を示しています。我々 のデータは、MeCP2 ニューロンの特定遺伝子転写リプレッサーとして行動することがないが代わりに転写ノイズ ゲノムワイドな DNA メチル化依存的に水を差すかもしれないことを主張します。
ひと生殖 CNVs のブレークポイント シーケンスによって明らかになった変異スペクトル。
正確に番号の変形 (CNVs) のブレークポイントを特徴付ける機能への影響を評価するため非常に重要です。ただし、既知の生殖 CNVs の 10 ％ 未満、単一ヌクレオチドのレベルにマッピングされています。3 つの無関係な個人の以前のアレイ ・ ベースの CNV 探索実験で検出されたすべての CNVs のデータセットからシーケンス ブレークポイントを特徴とします。ハイブリダイゼーションによる DNA の標的捕獲および 454 315 削除含む 324 の CNV ブレークポイントのシーケンスにシーケンスを使用しました。我々 は 2 つの主要なブレークポイント署名観察: 1 367 bp 挿入されたシーケンスの削除ブレークポイントの 33 ％ が含まれるに対し、削除ブレークポイントの 70% は 1 30 bp microhomology があります。Microhomology と挿入されたシーケンスの共起 (10%) は少なくとも 2 つの異なる変異のメカニズムを示唆、低です。約 5% のブレークポイントの切り替え機構ベースのレプリケーションのストランドを示唆して、ローカルの microinversions を含むより複雑な再編成を表しています。DNA 修復プロセスの豊富な文献にもかかわらずこれらの突然変異の各生成する分子のイベントの復興は、まだことはできません。
CpG の島 CpG 結合蛋白質 Cfp1 によるクロマチン構造に影響を与えます。
CpG の島 (Cgi) は哺乳類のゲノム彼ら GC 豊富な基本組成と高密度 CpG のジヌクレオチドのおかげで顕著であります。ほとんどの人間の遺伝子のプロモーター DNA のメチル化が不足し、転写活性に関係なくヒストン H3 リジン 4 複合体 (H3K4me3) のサイトと一致している Cgi の内で埋め込まれます。これらの相関関係の興味をそそるにもかかわらず、メチル化非 CGI シーケンス クロマチン構造と転写に関しての機能的意義が知られています。すべての Cgi に共通しているタンパク質の探索を実行すると、ここで我々 は in vitro での非メチル化 Cpg を選択的に結合する Cfp1 の高濃縮を示します。クロマチン免疫沈降モノラル allelically メチル化された CGI の Cfp1 具体的に非メチル化 CpG サイトを in vivo で関連付けることを確認しました。高スループット シーケンス Cfp1 バインド クロマチンの注目に値するのコンコー ダンス非メチル化された Cgi およびマウス脳における H3K4me3 のサイトを識別しました。Cgi で H3K4me3 のレベルは Cfp1 した細胞では著しく減少した, 一貫性を見つけるとその Cfp1、h3k4 トリメチル化メチルトランスフェラーゼ Setd1 アソシエイツ (refs 7、8）。非メチル化 CpG 密なシーケンスは H3K4me3 のドメインを確立するために十分であるかどうかをテストするには、マウスのゲノムに統合された人工の CpG クラスターを分析しました。プロモーターの不在は、にもかかわらず、挿入 Cfp1 を採用、H3K4me3 の新しいピークを作成します。データは、メチル化非 Cgi の主な機能遺伝子と Cfp1 とおそらく他 CpG 結合蛋白質相互作用によってローカル クロマチン修飾状態に影響することを示します。
ICLIPは、個々のヌクレオチド解像度でスプライシングのhnRNP粒子の機能を明らかに
真核細胞の核内に、新生転写物は、それらの豊富にもかかわらずのhnRNP Cで核されている粒子が、しかし、それはこれらの粒子はpre-mRNAの処理を制御するかどうかは不明のまま異種核リボヌクレオタンパク質（のhnRNP）に関連付けられています。ここでは、スプライシングの調節にのhnRNP Cの役割を研究するために個々のヌクレオチド分解能UV架橋および免疫沈降（iCLIP）を開発しました。 iCLIPデータは、のhnRNP CはのhnRNP粒子の組織との一貫性のある定義されている長期の間隔でウリジン管を認識していることを示しています。のhnRNP粒子はイントロンとエクソンの両方で組み立てるが、一般的にスプライス部位から除外されたままになります。 "RNAマップ"にトランスクリプトーム全体のiCLIPデータと選択的スプライシングプロファイルの統合はのhnRNP粒子の位置が別のエキソンを含めることでその効果を決定する方法を示しています。この調節機構への洞察を提供するために、高解像度のiCLIPデータの能力は、他の高次のリボ核タンパク質複合体の研究のための可能性を秘めています。
孤立したCpGアイランドは哺乳類のゲノムの多数の保存食のプロモーターを識別します
CpGアイランド（CGIが）ほとんどの遺伝子のプロモーターを含む脊椎動物のゲノムのランドマークであり、しばしばDNAのメチル化を欠いている。彼らの明白な重要性を照会し、CGIの数は異なる種で大きく異なりますし、多くの注釈付きのプロモーターと共局在しませんが報告されている。我々は、マウスとCXXCアフィニティー精製に加え、ディープシーケンシング（CAP-SEQ）を用いて、ヒトのゲノムのCGIの数を定量化するために設定してください。また、注釈付きの成績証明書に関連付けられていないCGIが知られているプロモーターでそれらを持つプロパティを共有しているかどうか尋ねた。我々は、以前の推計に反して、ことが判明し、ヒトとマウスでCGI豊富な非常に似ており、多くの遺伝子の相対的に保存された位置にある。それぞれの種におけるCpG密度は、これらの2つのプロパティが機械的に相互に依存しているという仮説を支持する、H3K4トリメチルの程度と正の相関関係があります。哺乳類のCGIの約半分（> 10,000）が注釈付きのプロモーターに関連付けられていない "孤児"である。多くの孤児のCGIは開発中の転写開始および動的な発現の証拠を示しています。既知のプロモーターでCGIが異なり、孤立したCGIは開発中に頻繁にDNAのメチル化の対象であり、これは積極的なプロモーターの機能の損失を伴っている。大腸腫瘍では、しかし、孤児CGIが優先的にメチル化ではありませんが、その癌を示唆して発生プログラムを再現していません。ヒトとマウスのゲノムには、既知のプロモーターからのリモートの半分以上は、そのうちのCGIの同様の番号を持っています。孤立したCGIはそれにもかかわらず、彼らは多くの可能性プロモーターのCGIよりも開発中にメチル化され、したがって、これらのプロパティを失うことになろうとしているものの、機能的なプロモーターの特性を持っています。データは、孤立したCGIが、その転写活性の開発中に機能的役割を果たす可能性が未検出のプロモーターに対応していることを示しています。
全ゲノム配列線虫の研究所家畜化と関連付けられる遺伝的変化を強調表示します。
種の個体別に成長し、多くの世代を越えてを発散すると変異の風景を定義する形質の進化への洞察を提供できます。これの具体例どこ同じ野生株の異なる行独立して別の標準的な環境で培ったいない家畜化に関連付けられている変更する必要があります。そのような線の全ゲノム配列の比較ゲノム データベースで突然変異率の推定, 遺伝子の先祖状態の推論と既存系統の祖先とシーケンス エラーの訂正を許可します。ここで我々 線虫ブリストルひずみの家畜化モデル、およびレポート LSJ1 のゲノム シーケンスとして勉強 （ブリストル）、標準の c. の elegans 参照野生型 N2 の兄弟 （ブリストル）。線虫を固定する方法が開発されるまでブリストルひずみが分離された後、LSJ1 と N2 行は別途直後から栽培されていました。我々 は、この期間中に 2 系統 1208年遺伝の相違を蓄積されているが見つけます。表現型の変異 N2 と LSJ1 の間に胚開発、生産卵の敷設と摂食行動、post-isolation の変更のすべての結果で卵の成熟率率を記述します。元のブリストルの先祖代々 の対立遺伝子を分離し、2038年可能性がシーケンス エラー元 N2 参照ゲノム シーケンス内の強調表示を推測します。これらの変更の多くはゲノムの注釈を変更します。我々 の研究は、遺伝子型-表現型の関連付けをさらに調査する出発点を提供し、研究室の家畜化の結果として選択のプロセスへの洞察を提供しています。
EpiChIP: 遺伝子による遺伝子の定量化におけるエピジェネティクス遺伝子レベルの。
クロマチン免疫沈降次世代シーケンシング技術 （チップ seq) との組み合わせはゲノムワイドなファッションで蛋白質 DNA 相互作用をマップする、ますます人気の強力な方法です。このデータを分析する従来の方法に沿って読み取りの背景よりも有意に高い染色体シーケンシング ピークを同定することです。ヒストン修飾とその他のエピジェネティックなマークについては、しばしばシーケンス読み取り遺伝子アノテーション基準の濃縮の特徴的な領域を検索することが望ましいです。例えば、多くのヒストンの修正は通常転写開始部位の周りを濃縮されています。この濃縮について説明します最適な窓を計算する各個々 の遺伝子の変更レベルを定量化することができます。データ セットには、H3K9/14ac のヒストン修飾 Th 細胞とそれに伴う IgG コントロール用を使用して、単一の遺伝子間交互にグローバル データ配布レベルと実験的背景と信号の明確な区別ができます解析戦略を提案する.曲線のあてはめ未変更対変更として遺伝子の虚偽の発見率に基づいて分類できます。我々 はこのタイプとの統合と遺伝子発現データの可視化を含む解析のうちを運ぶ EpiChIP と呼ばれるソフトウェア パッケージを開発しました。
CEP152 セッケル症候群における中断ゲノム メンテナンス蛋白質であります。
DNA 損傷応答経路の機能障害は、増加のゲノム不安定性に します。ここでゲノムの完全性と細胞 DNA 損傷反応の新しい調節因子としての centrosomal 蛋白質 CEP152 について説明します。同胞のマッピングおよびエキソームを使用して、我々 セッケル症候群における CEP152 突然変異を識別および CEP152 機能障害 ATM シグナル伝達の強化された活性化を介して複製ストレスから生じると H2AX のリン酸化を増加ゲノムの欠陥の蓄積につながることを示した。
次世代シーケンシング プラットフォームの臨床プロテオミクスに向かって。
識別し、蛋白質を定量化する最初次世代シーケンシング (NGS) アプリケーションを報告します。カスタマイズ蛋白質特定アプタマーの血清蛋白質情報読む NGS への直接変換を有効にアウト。高多重タンパク質検出と定量化商品技術には、さらなる進化を DNA シーケンシングの見通しと共にアプタマー シーケンスの固有の能力、小説、普遍的な診断パラダイムの中核を意味する可能性があります。
マウスのゲノムに巨大な PiggyBac トランスポゾンの動員。
哺乳類システムの大規模なゲノム DNA 断片の安定した配信できるようにする技術の開発は遺伝子療法のアプリケーションだけでなく、遺伝学的研究のために重要です。DNA トランスポゾン安定貨物転送を仲介する柔軟かつ効率的な分子車両として浮上しています。ただし、フラグメントの DNA を運ぶ能力目 10 kb が、ほとんどの DNA トランスポゾンの限られています。ここでは、我々 DNA トランスポゾン piggyBac 100 kb DNA 断片をマウス萌芽期の茎 (ES) 細胞を動員することができます大きな貨物容量を持つ唯一の知られているトランスポゾンを示します。中に移調貨物の整合性が維持されます、コピーの数を制御することができます、挿入された巨大なトランスポゾン ゲノム貨物表現。さらに、これらの 100 kb のトランスポゾンまたゲノムからな足跡を残すことがなく摘出することができます。大型貨物ベクトルとしての piggyBac の開発は遺伝子およびゲノム アプリケーションの広い範囲に容易になります。
バーコード画面エピジェネティックなレギュレータはヒストンの売り上げ高の複雑な NuB4/帽子-B のヒストンのアセチルトランスフェラーゼの役割を明らかにします。
ヒストン蛋白質の動的な変更は遺伝子の発現に重要な役割を果たしています。ただし、ヒストン自体も潜在的ヒストン修飾の安定性に影響を与える動的、することができます。ヒストンの売り上げ高の分子メカニズムを決定するには、DNA バーコード上のクロマチンの状態を分析することによってスクリーニング法エピジェネティックな規制当局の平行を開発しました。ヒストンの売り上げ高は、クロマチン免疫沈降や高スループット シーケンスと組み合わされた儀式と呼ばれる遺伝的パルス追跡技術を用いて, 定量化しました。この画面では、NuB4/に帽子-B 複雑な保存された B 型ヒストンのアセチルトランスフェラーゼ Hat1 を含むヒストン回転を促進することがわかった。予期せず、この複合体の 3 つのメンバーはお互いからだけでなく、知られている相互作用する因子とヒストン シャペロン Asf1 機能的分離可能性があります。したがって、体系的かつ直接尋問 DNA バーコードに関するクロマチン構造の遺伝子およびクロマチンの修飾とダイナミクスに関与する経路の発見につながることができます。
低バイアス、ストランド固有のトランスクリプトーム イルミナ シーケンス フローセル上の逆のトランスクリプション (FRT Seq) によって
第 2 世代シーケンス テクノロジーの統一機能は、単一のテンプレートの繊維は clonally シーケンス反応前の固体表面上に増幅されることです。添付ファイルをこの表面はマルチ ステップ ライブラリの準備が必要です用のテンプレートの繊維に互換性のある状態に変換するは通常 PCR によって増幅に culminates します。PCR は、データ集録の効率が低下する、本質的に一方に片寄ったプロセスです。フローセル逆のトランスクリプション シーケンス トランスクリプトーム シーケンスのメソッド イルミナ シーケンサーで逆転写反応フローセルで増幅されていない、アダプター結紮 mRNA としてテンプレートを使用して実行されるためです。このアプローチは、PCR バイアスおよび重複削除されますストランド固有ペアエンド データを生成する、再現性の高いです。プロシージャは、mRNA からクラスターを生成する 2 d を取ってすぐに実行できます。
正の選択信号の探査再データを用いた遺伝子型に基づいて人間のゲノムのスキャンから派生します。
選択の対象をより正確にローカライズできるし、生物学的洞察力増加したかどうかそのような余分な証拠につながることができるかどうかシーケンスに基づいてテストが適用されるとき正の選択の兆しがまた、ハプロタイプ構造をスキャンでゲノムの領域の正の選択の証拠を見るかどうかを調べた。我々 は 2 つのツールを使用: 中立または選択、および 2 つの領域として推定選択人間集団の HapMap2 プロジェクトによって識別の実験的検討の下でのシミュレーション。シミュレーションは、中立と選択した地域は容易に区別されなければならないし、それが選択したバリアントに 40 kb 以内に少なくとも時間の半分をローカライズすることが可能であることを示唆しました。シーケンシング 2 〜 300 kb の地域 （chr4:158 Mb、chr10:22 Mb） の既知のターゲット ハップマップ CHB 個人の選択の欠けている正の選択の各内の強力な証拠を提供し、マイクロ RNA 遺伝子の hsa-ミール-548 c 1 つの地域で最高の候補対象と他の精子タンパク質遺伝子 SPAG6 の変化として示唆します。
監督のトランスポゾン挿入サイト シーケンス上映牛における大腸菌 O157: H7 の署名タグ付きミニ Tn5Km2 変異株のライブラリへの遡及適用。
大量並列シーケンス トランスポゾン並ぶ領域の遺伝子型とフィットネス大腸菌 o157: h7 の変異体の以前牛の署名タグ変異 (STM) によるスクリーニングのスコアに 91 ％ を割り当てください。メソッドは、STM の限界 obviates、さらに動物を使用せずプロトタイプ大腸菌 o157: h7 ゲノムの機能アノテーションを著しく拡張します。
高スループット フェノタイピング アフリカ トリパノソーマにおける RNA 干渉ターゲットの並列シーケンスを使用します。
アフリカトリパノソーマは人間と家畜の主要な病原体である、珍しい原虫生物学の研究のためのモデルを表します。RNA 干渉 （RNAi） ターゲット シーケンスまたは RIT seq は、イルミナ シーケンスを用いたフィットネス コストと RNAi をマップと呼ばれる高スループット フェノタイピング アプローチを説明します。我々 の豊富な得点目 90,000 統合 RNAi ターゲットの前に、と後の RNAi 誘導トリパノソーマ ライブラリから回復しました。7435 蛋白質のコーディング シーケンスは、データが表示される目トリパノソーマ brucei ゲノムの非冗長一連の 99 ％。血流と昆虫の分析段階のライフ サイクルとライブラリ明らかにゲノム スケール ノックダウン プロファイルの成長と発展に不可欠な機能以前未同定と「架空」の遺伝子の何千ものリンク、差別化します。転写後の遺伝子発現制御、鞭毛の運動性と解糖系、血流中とカルボン酸の代謝と昆虫のステージへの血流から分化中のリン酸化の重要性構成式重点を含めて、顕著な特徴トリパノソーマ生物学の根底にある遺伝子が強調表示されます。現在のデータ セットはまた新しい薬剤ターゲットを識別するために大いに必要な遺伝的検証を提供します。RIT seq ゲノム スケール機能解析とゲノム シーケンス データの開発のための汎用性の高い新しいツールを表します。
GENCODE Exome: 完全な人間 Exome のシーケンスします。
コーディング領域のシーケンス処理は人間のゲノムの exome は、低周波およびひと疾患特性と関連付けられるまれな亜種を識別するメジャーの現在の戦略の一つです。これまでのところ、最も広く使用されている商業 exome キャプチャ試薬は主にコーディング シーケンス (CCD) データベース コンセンサスをターゲットしています。GENCODE コンソーシアムからアノテーションに基づく、完全な人間の exome をキャプチャするためのターゲットの拡張セットの設計を報告します。追加の 5594 遺伝子の拡張セットをカバーし、10.3 Mb の現在の CCD ベース セットと比較しています。イオン チャネル活性および 70 の遺伝子にリンク 43 の遺伝子蛋白質キナーゼ作業にリンクなど追加の地域 exome 順序制御研究に以前はアクセスできない潜在的な病気の遺伝子があります。合計で、ここで開発された設定新しい GENCODE exome 47.9 Mb をカバーし、シーケンスの捕獲実験でよく実行されます。本研究で使用するサンプルのセットに我々 以上 5000 SNP 亜種 GENCODE exome ターゲット （24 ％） でより多くよりも、CCD ベースのエキソームの識別。
イルミナ シーケンスの増幅無料ライブラリの準備。
ライブラリの準備手順は、次世代シーケンサー データの品質を非常に重要です。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の使用標準のイルミナ ライブラリ準備のプロトコルの一部として、かなりの割合の少ない効率的な実行シーケンスを作って重複して得られたシーケンスの発生します。また、増幅、特に生成されたライブラリの複雑さを軽減、高または低の GC 含量とゲノムのバイアスを紹介します。これらの困難を克服するには、無料の増幅ライブラリ準備を開発しました。カスタム アダプターの使用により、増幅されていない, 結紮サンプル オリゴヌクレオチド フローセル表面上に直接交配させることができます。
96 プレックス イルミナ ゲノム アナライザーの分子のバーコード。
次世代シーケンス テクノロジーがあるシーケンスに標準サンガーに比べて gigabase あたりのコストを大幅に削減する大規模なスループット シーケンス。小さな地域やゲノムを配列するときこのスループットの最も効率的な使用をするのには、レーンあたり 96 以上のサンプルの多重化、バーコード方式を開発しました。メソッド定量的 PCR に基づく・ 3 読み取りイルミナ メソッドを使用してシーケンス処理の等モル比でのライブラリのバーコードをプーリング ライブラリ準備濃縮ポリメラーゼの連鎖反応中に (PCR) は各配列ライブラリに組み込まれて 8 bp タグを採用しています。
標高の高い適応コーカサスからの Daghestani の人口では。
15 高地順応候補遺伝子信号北コーカサス地方シーケンシングを用いたハイランダーズ ターゲットにおける正の選択のためのアンケートを行っています。合計 49 の無関係な Daghestani （アヴァール人、Kubachians、およびレークス) の 3 つの民族グループからの標高約 2,000 m に位置し、古代の村での生活が選ばれた研究対象集団として。白人 (Adygei 海で生活レベル、N = 20) と CEU (CEPH ユタ州住民と家系から北部および西部ヨーロッパ;N = 20) コントロールとして使用されました。候補者の遺伝子は 20 推定ニュートラル制御領域では、同じ個人を resequenced と比較しました。関心領域長 - 個々 に応じてプール、8 ヌクレオチド タグを追加することによってインデックス付け、イルミナ GAII プラットフォームを使用してシーケンス PCR によって増幅されました。1,066 SNPs 虚偽の発見と 〜 6 ％ の偽の負のしきい値を使用と呼ばれました。中性領域信号選択のための候補者の遺伝子と比較する、実証 null 配布提供。2 つの遺伝子が目立った。レークス、非同義バリアント内酸素代謝の改善と関連するには、すでに知られている HIF1A で再発見され、13 の SNPs のクラスター高い人口の分化を示した、節約されたイントロンで EGLN1 地域内で Kubachians が見つかりませんでした。これらの亜種は高高度の異なる集団への適応の両方は一般的な経路を例示し、軽度低酸素環境でも方を示す Daghestani の集団に固有の機能は、遺伝的適応につながることができます。
高スループットの抗トリパノソーマ薬剤の効力および抵抗のデコード。
特定の疾患の化学療法の概念は世紀前に開発されました。染料、トリパノゾーマに対する選択性を表示ひ素化合物この作業には、中央と浮上して薬使用する人間のアフリカトリパノソーマ病 （HAT） を治療するために残る。選択的薬物作用と抵抗改善の帽子の治療法開発の基礎となるメカニズムを理解することの重要性が認識されて、しかし、これらのメカニズム主として未知のまま。ここ (RIT-seq) 画面トリパノソーマのシーケンシング、トランスポーター、オルガネラ、酵素と抗トリパノソーマ薬物作用を促進する機能代謝経路を明らかのゲノム スケール RNA 干渉ターゲットのすべての 5 つの現在の帽子の薬を使用します。RIT seq をプロファイリング知られて薬輸入業者と、唯一既知の pro-drug 活性剤を識別し、薬物作用する 50 以上の遺伝子をリンクします。血流のステージ固有不変の表面の糖蛋白質 (ISG75) 家族 suramin 取り込みを仲介し、AP1 adaptin 複雑な, ライソゾーム プロテアーゼと主要のライソゾーム膜貫通蛋白質と同様スペルミジンおよび n-アセチルグルコサミン生合成、すべて suramin アクションに貢献。さらに画面リンク ユビキノン可用性ニトロ薬物作用、プラズマ膜 P 型 H する (+)-Atpase ペンタミジン アクションと trypanothione、いくつかの推定のキナーゼ メラルソプ ロールのアクションを。また aquaglyceroporins ペンタミジン、メラルソプ ロールの交差耐性のための主要な役割を示します。これらの抗トリパノソーマ薬効と抵抗メカニズムの私達の理解の進歩は、薬剤耐性と闘うため、合理的な設計の新しい治療法とヘルプを援助し、抗トリパノソーマ薬の作用のモードの前例のない分子洞察を提供します。
イルミナ次世代シーケンシング ライブラリの準備のため非常に AT バイアス ゲノムを最適化します。
要旨： 背景： 大量並列シーケンス技術ゲノムと遺伝的研究へのアプローチの革新です。その登場以来、規模と効率の次世代シーケンシング (NGS) は改善している急速に。この成功にもかかわらずシーケンスのゲノムまたはゲノムの領域に極めて一方に片寄った基本組成物は、まだ現在利用できる NGS プラットフォームへの偉大な挑戦。いくつかの重要な病原体のゲノム (コンテンツで高) マラリア原虫と結核結核 (高い GC の内容) ディスプレイ極端基本組成のような。特に全体の不均一な読み取り範囲を引き起こす PCR 増幅を用いる標準ライブラリの準備の手順が示されている AT と GC の豊富な地域、ゲノムのアセンブリと変動の解析の問題に 。PCR 増幅を省略する代替ライブラリの準備のアプローチ開始材料の大量を必要し、それゆえは DNA の RNA の少量の臨床分離株からのそれらのように適していません。我々 は開発し、低量の出発原料に適してと寛容に非常に高いコンテンツ シーケンスでライブラリの準備手順を最適化しました。結果: 我々 弊社最適化された条件と並行して標準的な方法で非臨床からイルミナ シーケンス ライブラリを準備する使用しているし、臨床分離 （53 ％ ホスト汚染を含む） .parasites。分析し、生成シーケンス データの品質を比較する、こと PCR 添加剤 （TMAC) を含む私たち最適化された条件を示す、非常に豊富な地域の改善の範囲で増幅されたライブラリを生成、GC ニュートラル テンプレートに向かってバイアスを削減します。結論： 我々 は、堅牢で最適化された次世代シーケンシング ライブラリ増幅法非常に豊富なゲノムのために適したを開発しました。新しい増幅条件は大幅にバイアスを削減し、基本組成のいずれかの両極端の複雑さを保持します。この開発は大幅にしばしば増幅 DNA の開始材料の低質量期日を必要とする臨床サンプル シーケンスをご利用いただけます。
行動とターゲットは毒素産生クロストリジウム ・ ディフィシルの 2 つの異なる株のクェン トランスポゾン Tn916 を選定します。
イルミナ Solexa ハイスループット DNA シーケンシング Tn916 挿入ライブラリで 2 つの異なる臨床分離株のクェン トランスポゾン Tn916 嫌気性病原菌クロストリジウムディフィシルでの挿入サイトが判定した: 630ΔE、エリスロマイシンに敏感なデリバティブ 630 （ribotype 012) と、ribotype の 027 difficile C. 病の発生時に責任があった R20291 を分離します。コンセンサスシークエンス 15 塩基対 Tn916 挿入拡張コンセンサス シーケンス R20291 で観察されたが、両系統に類似していたが確認されました。Difficile C. 630 ゲノムの検索 Tn916 挿入モチーフ 100,987 回で約 63,000 遺伝子および遺伝子間領域で 35,000 にあるこれらのモチーフの存在が示されました。変異原物質として Tn916 の有用性をテストするには、小さなコロニーのバリアントの分離機能の画面を許可しました。この変異株鞭毛の生合成に関与する遺伝子挿入 Tn916 含まれています。
