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Articles by Daniel Anacker in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Génération des cultures organotypiques de Raft kératinocytes humains primaires
1Department of Microbiology & Immunology, University of North Carolina-Chapel Hill, 2Lineberger Cancer Center, University of North Carolina-Chapel Hill
Un
Other articles by Daniel Anacker on PubMed
PORF65 De Protéine De Capside Petit Est Essentiel Pour L'assemblage Des Capsides Herpèsvirus Associé Au Sarcome De Kaposi
Herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) est l'agent étiologique de tumeurs KS, la maladie de Castleman multicentrique et lymphomes effusion primaire. Comme autres herpèsvirus capsides, la capside KSHV est une structure icosaédrique composée de six protéines. La coquille de la capside est composée de la protéine majeure de la capside, deux protéines triplex et la petit de la capside. La protéine d'échafaudage et la protéase occupent l'espace interne. L'Assemblée des capsides KSHV est censée se produire d'une manière analogue à celle déterminée pour le virus herpès simplex de type 1 (HSV-1). Notre objectif était de rassembler les capsides KSHV dans des cellules d'insectes en utilisant le système de vecteur d'expression baculovirus. Six capside KSHV ouvert lecture trames ont été clonés et les protéines exprimées dans les cellules Sf9 : pORF25 (major de la capside), pORF62 (1 triplex), pORF26 (2 triplex), pORF17 (protéase), pORF17.5 (protéine d'échafaudage) et aussi pORF65 (petit de la capside). Lorsque des cellules d'insecte sont coinfectés par ces baculovirus, capsides angulaires qui contenait des structures internes principales ont été facilement observables en microscopie conventionnelle des cellules infectées. Capsides étaient aussi facilement isolés des cellules infectées en utilisant la sédimentation de la vitesse de taux. Avec les méthodes de microscopie immuno-électron, ces capsides étaient perçus comme étant réactif aux antisérums de pORF65 ainsi que les sérums humains KSHV-positif, indiquant la bonne conformation de pORF65 dans ces capsides. Quand un virus exprimant les protéines triplex a été omis de la co-infection, capsides ne pas assembler ; semblables aux observations faites dans les cellules infectées par le HSV-1. Si le virus exprimant la protéine d'échafaudage a été exclu, grandes coquilles ouverts qui n'a pas atteint la structure icosaédrique ont été observés dans les noyaux des cellules infectées. La présence de pORF65 était nécessaire pour l'assemblage de la capside, que capsides ne se forment pas si cette protéine était absente si l'on en juge par les deux par les analyses ultrastructurales des cellules infectées et les expériences de taux vitesse sédimentation. Ainsi, un nouveau résultat de cette étude est la constatation que la protéine de capside petit de KSHV, comme la majeure de la capside et protéines triplex, est essentielle pour l'assemblage de coquille de capside.
Différentiellement Conservées Staphylococciques Domaines De Liaison Paroi Cellulaire SH3b_5 Conférant Staphylolytic Accrue Et Streptolytic Activité à Un Domaine D'endolysin Prophage Streptococcique
Staphylocoques peptidoglycane hydrolases sont une nouvelle source potentielle d'agents antimicrobiens. Un vaste sous-ensemble héberge des domaines de liaison C-terminal SH3b_5 pariétaux. Ces domaines C-terminaux montrent est nécessaire à la reconnaissance précise des parois cellulaires et l'activité subséquente de staphylolytic pour certains endolysins. Les protéines plus d'une cinquantaine de staphylocoques ou origine phage contenant SH3b domaines étaient alignés, produisant cinq groupes hautement répétitifs des protéines. Extrémités C-terminales représentant de ces groupes de cinq et six protéines staphylococciques pour lesquelles aucun homologues n'ont été identifiés, ont été alignés, révélant deux sous-groupes distincts de SH3b_5 qui se chevauchent mais les résidus différentiellement conservées. Une prémisse derrière cette recherche est qu'il peut y avoir unique conférées par ces domaines staphylococciques qui pourraient être exploitées pour améliorer spécifiquement anti-staphylococcal efficacité dans les constructions de fusion des protéines hétérologues de propriétés de liaison de la paroi cellulaire. Pour identifier les différences fonctionnelles entre les deux sous-groupes, le domaine de liaison Cpl-7 pariétaux natif de la streptocoque endolysin LambdaSa2 ont été remplacé par staphylocoques SH3b domaines dans les deux sous-groupes. SH3b domaines de lysostaphine (bactériocine) ou LysK (phage endolysin) a entraîné une augmentation d'environ 5 x staphylolytic activité conféré sur le domaine de l'endopeptidase streptococcique et étonnamment ces fusions de mêmes maintenues une activité streptolytic, suggérant que les domaines SH3b staphylococciques ne sont pas toujours spécifiques à staphylocoques. Une comparaison des différences dans l'activité lytique conféré sur le domaine LambdaSa2 d'endopeptidase de soit LysK ou lysostaphine SH3b domaine différente pas de plus d'un facteur de deux. Par le biais de la collection de séquences de peptidoglycane hydrolase, trois nouveaux putatif contenant de l'intron phage endolysin gènes ont été identifiés dans des bases de données publiques pour les phages G1, X 2 et 85.
