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Articles by David A. Knecht in JoVE
JoVE General
ECIS /タクシーと細胞走化性の測定
1Molecular and Cell Biology, University of Connecticut, 2University of Connecticut
ECIS /タクシーシステムは、細胞走化性を測定する自動化された、リアルタイムのアッセイである。このアッセイにおいて、細胞は、ターゲット電極に到達するためにアガロースの層の下に移動します。携帯電話の動きはAC電流0〜抵抗の発症によって測定されます。
Other articles by David A. Knecht on PubMed
バインディング吸収・分解の速度論による細胞性粘菌キイロタマホコリカビ蛍光 (利用した DsRed) 細菌に住んでいます。
バインディング、吸収および蛍光タンパク質利用した DsRed 発現大腸菌を用いた植物細胞性粘菌アメーバによる細菌の分解の動力学を特徴されています。食作用の試金の細菌を利用した DsRed 発現を使用する大きな利点があります。蛍光蛋白質、利用した DsRed、安定した式リビング細菌における phagolysosomal 経路に degradable 明るい内部の蛍光信号を提供します。アッセイを化学的にラベル付けされた細菌またはラテックス ビーズのとは異なり、細菌は生きているし、自然な不変の外部表面の受容体相互作用を持っています。細胞性粘菌は急速にバインドし、利用した DsRed 細菌を貪食します。パルス追跡実験は約 45 分の半減期を利用した DsRed から派生した信号を低下することを示します。内面の細菌が表面にバインドから区別するには、アッセイ開発されたどのナトリウムのアジ化表面結合粒子を解放するために使用されました。驚いたことに、表面粒子リリース ミオシン II の機能の独立していることが表示されます。このアッセイを用いた細菌細胞への取り込みが非常に急速であることが示されました。1 分インキュベーション後、信号の 20 ％ は内面の細菌から派生します。内面の細菌からの信号の割合は徐々 に増加し、定常状態で 50 ％ に達する。この試金は貪食能と post-internalization 小胞輸送の分子機械の調査で役に立つでしょう。
マクロピノサイトーシスとエキソサイトーシス中アクチン ・ ダイナミクスの可視化。
マクロピノサイトーシスの新しく形成された存在して post-lysosomes のエキソサイトーシス F アクチン フィラメントを具体的にバインドする緑色蛍光タンパク質プローブを用いた可視化されています。マクロピノサイトーシスと F アクチン関連は V 形膜の infolding として開始されます。小胞の拡大は、V の近位ポイントの内部移動だけでなく外側の突出先端で、細長い陥入を形成する V のを介して発生します。突起は最終的にその遠位の余白で、小胞になることを閉じ、centripetally その円形の形状を回復している間に移動されます。小胞内在した後そのアクチン コート 1 分以内を失います。1 時間後、post-lysosomal の小胞は弱くアクチンまだ細胞質中に囲まれてになった。いくつかのこれらの小胞膜に移動、ドッキング、およびその内容を追放しました。少し前に小胞コンテンツが消え始めた F アクチン協会、小胞での増加が観察されました。内部のコンテンツがリリースされた後、これは、小胞の急速な収縮し、アクチン信号の消失によって続いた。これらの結果はアクチン フィラメント協会小胞膜の動的変化はエンドサイトーシス、エキソサイトーシス同行. します。
Rho キナーゼとミオシン II の制御貪食カップ形成 B-6-1010 CR、しかし FcgammaR ではないです。
各受容体シグナル伝達経路の異なる使用していますが Arp2/3 複合体を介したアクチン重合貪食 Fcgamma 受容体 (FcgammaR) または補体受容体 3 (CR) が必要です。Rho アクチン アセンブリ CR phagosome で制御しながら Rac、Cdc42 はアクチンと FcgammaR b-6-1010 Arp2/3 複雑な募集が必要です。CR 貪食における Rho の役割を理解するには、貪食カップ形成および/または粒子の貪食に既知のターゲットの Rho、Rho キナーゼ (ROK) を制御するかもしれないという考えをテストしました。阻害剤と下流ターゲット ミオシン II (ML7, BDM, およびドミナント ネガティブ ミオシン II) 民国 ROK （ドミナント ネガティブ ROK と Y 27632） のこのアイデアをテストするために使用されました。その韓国--> Rho の抑制--> Arp2/3 複雑なの減少蓄積と F アクチン CR を介した貪食貪食の削減につながった連結粒子周り原因ミオシン II の経路を発見しました。FcgammaR を介する細胞貪食、対照的に、Rho または ROK の活動の独立していたし、だけミオシン II アクチン カップ形成ではなく、粒子内部化のために依存していた。ミオシンは以前我々 の知識の FcgammaR の貪食能に関与しているが、これは CR 貪食におけるミオシン II の役割の最初のデモです。
RacB 細胞性粘菌属における細胞骨格機能を調節します。
これまで、14 の同族体の哺乳類の Rac 蛋白質の細胞性粘菌の同定されています。各これらの遺伝子のユニークな機能がありますかどの程度まで彼らはアクチン細胞骨格組織内の冗長の役割を果たすかどうか明確ではないです。RacB の特定の機能を調査するには、我々 は野生型 （WT RacB）、支配的な負 (N17-RacB) を条件付きで表現し、恒常 （V12 RacB) バージョン蛋白質の活性化を持っています。[V12 RacB を発現する細胞の誘導、成長停止で、表面からデタッチ、mn-sod を高発現 WT RacB 表面に平らになった細胞ながら多数の球状表面突起を形成します。対照的に、過剰 N17 RacB 細胞は重大な形態学的異常を示さなかった。V12 RacB 細胞に見られる表面の突起は彼ら F アクチンが濃縮された、サイトカラシン治療によって inhibitable あったのでアクチン駆動突起のように見えます。V12 RacB 細胞の突起は、野生型細胞ストレスによって形成水疱からそれらを区別するミオシン II の活動は不要でした。最後に、機能的な結果の野生型および変異体 RacB の発現を検討しました。貪食、エンドサイトーシス、および流体相の流出率 RacB 蛋白質を表現するすべてのセルの行では減少したが V12 RacB を発現する細胞の最大の減少が観察されました。これらの結果から我々、Rho の他のメンバーのような家族、RacB はアクチンの重合を誘導するが活性化の結果が調べたところ、他の細胞性粘菌の Rac 蛋白質から異なって表示される細胞の別の形態や機能の変化の結果を締結します。
アクチン フィラメントのミオシン II 架橋皮質整合性と制限の厳しい環境における細胞運動への主要コントリビューターであります。
細胞は、頻繁に歩行など、血管外漏出または転移性侵入中の物理的制限ローカル環境で移動する必要があります。これらのイベントをモデル化するために、我々 の走化性葉酸 [G. Laevsky、ネヒト、D. A. (2001 年)。 ソースに向かって agarose の層の下での栄養細胞性粘菌アメーバを受けるアッセイを開発しました。Biotechniques 31, 1140年-1149年]。Agarose の濃度 0.5% から 3% に増加するとセルがますます下で agarose を移動する彼らの能力で抑制されます。この制限する環境における細胞運動にタンパク質を架橋アクチンとミオシン II の貢献は、現在検討されています。ミオシン II の重鎖 （mhcA -） に欠けているセルは agarose オーバーレイ 0.5 ％ 以上の下に移行することであり、この濃度でも彼らはトラフからわずかな短い距離を移動します。移動しようとしている間に、セルは伸ばして、彼らから撤回する彼らの無力による断片化になります。Agarose の高濃度 mhcA 細胞が agarose の下で仮足突出しますが、細胞体の下にあるをプルすることはありません。ミオシン II の役割と一致して一般的な皮質の安定性、GFP ミオシン動的に agarose 下移動細胞の外側と後部皮質へローカライズします。必須軽鎖のミオシン II (できる,-) に欠けているセルは、測定可能なミオシン II の運動活性がない、まだ通常すべての agarose 濃度下で移動することができた。ABP 120 または α-アクチニンのいずれかに欠けている突然変異体はまた agarose 野生型細胞に似てレートで下に移動することができた。ミオシンはアクチン皮質そのモーターの機能ではなく、その架橋活動を通して安定し、このアクティビティは必要かつ十分な細胞運動制限の厳しい環境での皮質の整合性の維持ですを仮定します。アクチン ゲルビーズ α-アクチニンと ABP 120 ミオシン II としての役割は、この皮質の整合性を提供する主要なを再生するは表示されません。
シリカによるアポトーシス誘導マウス肺胞マクロファージのライソゾーム酵素活性によって開始されます。
過去の研究私たちの研究室では、そのシリカを示している （-石英) 粒子曝露がマウス肺胞マクロファージ細胞ライン （MH-S） の elicits ミトコンドリア脱分極とカスパーゼ 3 および 9 の活性化、アポトーシスに貢献。ただし、これらの成果につながる細胞の細道を広く調査されてしてはいません。初期研究シリカの露出が 1 時間後に、リソソームの透過性を引き出す fitc デキストランとアクリジン オレンジのリークによって証明されるようを明らかにしました。ライソゾーム酸性コンパートメントにおけるアポトーシスの役割次評価します。セル lysosomotropic 弱い基本減少カスパーゼの活性化とアポトーシス DNA フラグメンテーションを示したリソゾームの pH を高めるため塩化アンモニウムと、前処理しました。ペプスタチン ライソゾーム カテプシン D の阻害物質を前処理 MH S 細胞では、減少のカスパーゼ 9 と 3 アクティベーションとなったアポトーシス細胞の割合が減少を示した。DNA 断片化およびカスパーゼ 9 と 3 アクティベーションも細胞のライソゾーム酸性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤 despiramine を前処理で減少した.シリカ アルミニウム削減乳酸 (鈍表面反応サイト） にカスパーゼ活性化とアポトーシスを前処理しました。アルミニウム乳酸扱わがシリカまだライソゾーム透 （FITC デキストランによって） すきま, リソソームの整合性と関数の 1 つのメジャー程度および/またはライソゾーム傷害の性質の削減 (によるアクリジン オレンジ保持) 示唆します。シリカによるアポトーシス誘導に加えてライソゾーム酵素の別経路を探索する活性酸素種 (ROS) の役割を調べた。ただし、ROS の役割は明白ななかった。したがって、シリカ暴露に続いて、リソソーム傷害アポトーシス、先行し、アポトーシス シグナル伝達経路にはが含まれていますカテプシン D および酸性スフィンゴミエリナーゼ。
ホスファチジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸加水分解アクチンリモデ貪食中に指示します。
における Rho gtp アーゼ b-6-1010 アクチン重合を開始する重要な役割を果たします。対照的に、F アクチン病気貪食空胞の核分裂のために必要な分解を演出要因を定義します。蛍光キメラ蛋白質を使用成形ファゴソームとアクチンとアクティブ Cdc42 と Rac1 の関連付けのダイナミクスを監視します。アクチン形成ベースから消えることがわかったがファゴソーム封をする前に、は完全だった、Rac1/Cdc42 活動終了 GTPase 活性のアクチン分解の主要な決定要因ではないことを示唆して、永続化します。さらに、完全に恒常少し関連する F アクチンを示したアクティブ Rac1 とを関連付けるために設計された phagosome を内面化。ホスファチジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸の消失 (PI(4,5)P(2)) phagosomal 膜から密接に並列アクチン分解のコース。さらに、私の PI(4,5)P(2) 加水分解またはホスファチジルイノシトール リン酸キナーゼの過剰発現による増加 PI(4,5)P(2) 生成の阻害を防止アクチン分解貪食の完了のために必要な。これらの観察は加水分解の提案する PI(4,5)P(2) を指示アクチン貪食能を修了するために必要な改造します。
メタロチオネインを仲介する白血球走化性
メタロチオネイン（MT）は、種々の薬剤によって誘導することができるシステインに富む金属結合タンパク質である。 MTレベルの調節は、特定の免疫機能を変更することが示されている。我々はMT遺伝子がケモカインCCL17とCx3cl1に地図を閉じることに気づいた。これらのケモカインを特徴付けるシステインモチーフはまた、MTはまた走化性因子として作用するかもしれないことを示唆しているMTシーケンスに記載されています。
キイロタマホコリカビの下で Agarose 走化性。
植物の状態では、多細胞の開発中は、彼らは内生する走化性になるに対しアメーバが細菌によってリリース pterins に向かって走化性は細胞性粘菌のキャンプを生産しました。様々 なアッセイを視覚化して走運動の定量化に使用されています。下で agarose の走化性高分解能イメージングおよび個々 のセルおよび透過光と蛍光顕微鏡による個体群の運動挙動の定量化可能シンプルかつ柔軟なアッセイを提供します。アッセイは、固体が柔軟なマトリックスを変形するセルが必要です;したがって、それはまたこれらの制限の厳しい条件で移動する変異細胞の能力に欠陥を測定する方法を提供します。
白血球走化性の自動リアルタイム測定
我々は以前葉酸勾配で細胞性粘菌アメーバの走化性運動を測定するための自動化システム（留学生センター/タクシー）に記載されている[Hadjout、N.、Laevsky、G.、クネヒト、DAとLynes、MA、2001。走化性細胞の運動性の自動リアルタイム測定。バイオ技術31、1130年から1138年。] ECIS /タクシーシステムでは、細胞は下のアガロース環境に移行し、その位置は、電極の表面にクロール細胞に起因するインピーダンス変化を測定することによって監視されています。本稿では、補完するため、応答内のプライマリおよび不死化白血球の走化性（アナフィラトキシン）は留学生センター/タクシーシステムを用いて測定することができたことを示している。ターゲット電極の設計には、いくつかの変更がテストされ、運動の方向に線状電極に垂直は、アッセイの感度および信頼性を高めることがわかった。最適化された留学生センター/タクシーアッセイを用いて、好中球およびWBC 265-9C細胞の用量反応を確立し、Boydenチャンバーアッセイと比較した。 ECIS /タクシーアッセイ系は、複雑な走化性勾配の効果を評価するために、または走化性運動における医薬品の効果を決定するために、異なる種類の細胞の動きを比較するために使用することができます。
牽引力顕微鏡で細胞性粘菌ミオシン II モータと偏極細胞運動におけるアクチン架橋活動のための個別の役割を明らかにします。
連続的な細胞運動のリーディング エッジで前方軍収縮力は、セルの背面との調整が必要です。ミオシン II は撤回を促進するために必要な収縮力を生成する必要があります;ただし、ミオシン II (mhcA-) 欠けている細胞性粘菌の細胞はまだ運動です。直接収縮におけるミオシン II の役割を調査するために我々 マグニチュードと野生型、ミオシン II 必須軽鎖 null (できる,-) および mhcA 細胞をランダムに移動することによって生成されたトラクション応力の動的な再分配を測定するのにゼラチン牽引力アッセイを使用しました。セル タイプごとに、期間の急速な監督のこと細胞運動トラクション ストレスの非対称的な配分がどのトラクション応力背面前面で有意に高値ですで存在する場合に発生する我々 のデータを見る。我々 セル速度の主要な決定要因率と周波数どのトラクションに応力の非対称性を開発、絶対等級トラクション ストレスのないことがわかった。取り消しは、リアの高いトラクション応力を促進するので一方低トラクション前面突起できるそのトラクション応力の非対称性は急速に、偏光の細胞運動の重要ですを締結します。アクチン架橋アクティビティがそれを安定させるために重要である一方ミオシン II 運動の活動率とどのトラクションに応力の非対称性を開発し、周波数を増加することを提案します。
アクチン結合ドメインのアクチン結合蛋白質細胞骨格の異なる場所に直接します。
フィラミン (FLN） と非筋 α アクチニンのアクチン結合のカルポニン相同ドメイン （CH-ドメイン） を利用する F アクチン架橋タンパク質の家族のメンバーです。これら 2 つの蛋白質が特徴付けられる広範囲が、少し何 F アクチン フィラメントのセルへの彼らの結合を調節するについて知られています。
蛋白質の第四紀構造および表現のレベルは、ペルオキシソーム-ターゲット シーケンス-1-介するペルオキシソームの輸入ヒト溶けるエポキシドの加水分解酵素に貢献します。
ペルオキシソームのターゲット シーケンス 1 (PTS1) はコンセンサス トリペプチド 1 (最もペルオキシソームのタンパク質の C 末端で発見した S/C/A)(K/R/H)(L/M)。ただし、ターミナル メチオニン PTS1 （SKM）、人間の溶けるエポキシドの加水分解酵素 (hsEH) を含む唯一の既知の哺乳類タンパク質ペルオキシソームとサイトゾルのローカライズは in vivo でを示しています。したがって hsEH の細胞内局在を調節するメカニズムは不明します。一過性かつ安定して transfected チャイニーズハム スター卵巣細胞における hsEH のペルオキシソーム ターゲティングを研究する緑色蛍光タンパク質 hsEH 融合コンストラクトを活用します。ペルオキシソームのインポート hsEH の 3 つの要因によって調節されていることが示唆されました。まず、SKM が、必須ではない十分なペルオキシソームのインポートであることを示します。第二に、蛋白質の表現のレベルを操作することによって、表現のレベルが高いときにだけ SKM 野生型 hsEH のペルオキシソームの輸入を仲介することを示します。第三に、我々 をサブユニット オリゴメリゼーションを下げ、おそらく SKM モチーフのアクセシビリティを高めるアミノ酸変更ペルオキシソーム低蛋白発現レベルでも対象とすることを示してください。我々 は hsEH で SKM 必要ですが非効率とコンテキストに依存する PTS1 であることを締結します。ペルオキシソーム インポート表現のレベルが高いとき、または SKM モチーフにアクセス場合に発生します。これらの結果は、hsEH の生体内での細胞および組織に固有のローカリゼーションを理解するため、機械的な基礎を提供します。
結晶性シリカ粒子によるマクロファージの貪食。
珪肺症結晶性シリカの吸入により慢性肺疾患です。結晶性シリカへの暴露培養マクロファージの細胞死につながる;ただし、機構細胞粒子間相互作用、粒子の運命と死の原因は不明です。タイムラプス イメージングは、熱心にマウスのマクロファージ細胞表面上に落ち着く粒子バインドことと細胞も遠く粒子をキャプチャする突起を拡張することを示しています。共焦点光学断面を使用して、シリカ粒子は、生きた細胞の細胞質のボリューム内に存在すること示されていた。さらに、電子顕微鏡および元素分析シリカ細胞内部のセクションで示した。貪食のプロセスを詳しく調べるには、粒子取り込みのキネティクス細胞が卵白アルブミン (OVA) さらされたアッセイを用いた定量化されました-被覆粒子と anti-OVA 抗体から内面粒子表面結合を区別するために使用されました。Fc 受容体を介した取り込み抗体をコーティングしたシリカ粒子の 5 分以内はほぼ完了しました。対照的に、この時点で内面化された OVA 被覆粒子はありません。30 分後にバインドされたシリカの 30% が内面化され、取り込みをゆっくりとその後に続けています。ラテックス ビーズ表面電荷に関係なく OVA コーティングは同様に遅い速度で内面化されました。マクロファージは、シリカを内面化し、そのリセプター貪食によって発生するこれらの結果を示す、一時的に、そしておそらく機械論的に、別個の経路 Fc から受容細胞貪食。マクロファージの 80 パーセント シリカ暴露の 12 時間以内に死にます。どちらも OVA コーティングも tetramethylrhodamine イソチオシアネート ラベリングが細胞死に影響を与える。興味深いことに、抗体のコーティングは、劇的にシリカ毒性を低減します。粒子のエントリと後続ファゴソーム人身売買のルート内面粒子の毒性に影響を与えることを仮定します。
津波、融合のキナーゼの細胞性粘菌の相同物は偏光と走化性が必要です。
前方遺伝画面性粘菌走化性変異体では、融合のキナーゼの相同エンコーディング津波、指定機能喪失変異を識別しました。TsuA 関数に欠けているセルは、走化性を効果的に実行できませんでしたし、偏極になるまたは仮足遊走グラデーションで正しく方向づけることができませんでした。TsuA(-) 細胞カップル受容体結合占有ホスファチジルイノシトール (3,4,5) トリスリン酸 (PIP3) 生産とアクチン重合することができる間、PIP3 応答延長し、, 基底 F アクチンのレベルを増加しました。興味深いことに、TsuA は微小管ネットワークと細胞周囲で主に発見涙点をローカライズします。遺伝子解析小説我々 津波ホモロジー (TH) ドメインを指定の C 末端ドメインを発見しました。キナーゼ ドメインと TH ドメイン tsuA(-) 細胞の表現型の欠陥を救助する必要があります。キナーゼ作業が微小管へのローカライズは必要ありませんが、TH ドメインは不可欠です。したがって、微小管結合キナーゼ活性の局在は TsuA 関数のため重要です。微小管ネットワークとの関連付けの機能融合キナーゼ蛋白質の異なる生物の発散の役割の根底にあるかもしれないことを提案します。
バイオミメティック皮膜のチタン高荷重効果とその放出挙動とウシ血清アルブミンの取り込み
ウシ血清アルブミン (BSA) モデル蛋白質としてその載荷効率チタン基板上へのリン酸カルシウム (CaP) コーティングを用いて検討しました。コーティング システム擬似体液 (SBF) ボリュームなど、ソリューションの高さとコンテナーの選択、SBF 用の特定の構成を変化させることで効率積載タンパク質を調整できることを発見しました。90 ％ が達成されたと高効率積載 BSA とき、基板の比表面積 SBF (m SBF) ボリュームに 0.072 として高いだった。バイオミメティック皮膜から BSA のリリースも in vitro で調べた。BSA の大規模な量がまだコーティング リン酸緩衝液浸漬の 15 日後に閉じ込められたが持続的なリリースを実現しました。コーティングが注入されるときより速く解放率を in vivo 破骨細胞および酵素の積極的な関与により予想されるでしょう。
糸状仮足細胞遊走への貢献: 突起と収縮の間の機械的リンク。
多数の F アクチンを含む構造は膜で最先端の運動性細胞の突起の調節に関与しています。リーディング エッジとトレーリングのアクチン ネットワークの機能でイベントに関連する構造とダイナミクスの糸状仮足を調べた。我々 は並列のバンドル アクチンの糸状仮足を含めるが、驚くほど非一様時空分布アクチン結合蛋白質の含まれていることを発見しました。近位部は、主に α-アクチニンとコロニンによってバインドされている間主に T 間には単一 filopodium のアクチン フィラメントの長さに沿って、最も遠位部分が含まれます。いくつか糸状仮足は静止が横フィロポディア移動リーディング エッジに関して。彼らは細胞体のアクチン重合ネットワーク セルの前面とミオシンの運動活性間の機械的リンクを形成するために表示されます。外側の糸状仮足の動きの方向は、細胞の移動方向と関連付けです。セルの 1 つだけの側面に向かって移動外側フィロポディアがから開始すると、セル糸状仮足の流れの方向とは反対になります。したがって、このフィロポディア ミオシン II のシステム機械的に調整される収縮の力駆動突起軍とミオシン II のアクチン重合を介することができます。
ククルビタシン私は直接にアクチン ・ ダイナミクスと干渉による細胞運動を抑制します。
Cucurbitacins はヤヌス キナーゼ 2 (JAK2) の活性化を阻害する植物の自然な製品/トランスデューサーと性転写 3 (STAT3) の信号経路によってメカニズムは不明。彼らはまたアクチン細胞骨格の組織内の変更を引き起こす知られています。
貧食能および非晶質シリカの毒性。
結晶性シリカの吸入は炎症反応を引き起こす知られていると慢性曝露肺線維症につながるし、進歩することができます病気に、珪肺症。培養マクロファージ結晶性シリカ粒子をバインド、それら、貪食、アポトーシスおよび壊死の死を受けることに急速に。これによって粒子がバインドされ、内面し、理由粒子が有毒であるメカニズムは不明であります。非晶質シリカは以下に考えられている有毒なフォームがこのビューは物議を醸す。我々 は、取り込みおよび非晶質シリカ結晶性シリカの毒性を比較しました。
