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Articles by David Fenyo in JoVE
JoVE General
MALDIサンプル調製：超薄層法
Laboratory of Mass Spectrometry and Gaseous Ion Chemistry, Rockefeller University
このビデオでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI - MS）でペプチドやタンパク質を解析するための超薄型行列/分析物層の準備を示しています。
Other articles by David Fenyo on PubMed
レーダー、マススペクトルのプロテオーム解析を自動化するバイオインフォマティクスのソリューションは、タンパク質同定の最適化し、リレーショナル データベース内のデータのアーカイブします。
レーダーは、高スループット プロテオーム マススペクトル データ処理とストレージの迅速で自動化されたデータのアーカイブおよび検索のソフトウェアのシステムを説明します。質量分析計のデータ ファイルの大半は、一貫性のある処理用レーダーを使って互換性です。システムは、自動的に未処理のデータ ファイルを受け取り、silico データベース検索、経由で蛋白質を識別し、カスタマイズされたレポートに適したリレーショナル データベースでは、処理済みのデータと検索結果を格納します。システムは、24/7 の操作でに複数のユーザーがイントラネット web ブラウザーを介しての仮想プライベート ネットワークでは、監視されるかもしれないし、安全ですアクセス使用堅牢です。レーダーは、1 つまたは多数のコンピューターで使用するためのスケーラブルでは、複数のプロセッサ システムに適しています。それは FASTA 形式で任意のローカル データベースを組み込むことができ、タンパク質および DNA データベースをオンライン検索できます。主な特徴を視覚化ツールのスイートです (多くの利用可能な無償）、手のアノテーションを再解析、スペクトルの安易な操作を可能とするすべてのプロシージャにアクセスします。またソナー MS/MS の小説、検索プロセスごとの 40 mb 以上の RAM をゲノムに対して必要とする迅速な検索エンジンを使用するまたは EST データベース内のすべての六つの読書フレーム翻訳します。レーダーその効率的なアルゴリズムによって分析のコストを削減： ソナー MS/MS 質量とタンパク質タグなし identifiy 蛋白質親イオンの正確な知識がなくてもことができます。統計のスコアリング方法は閉じるの専門家の精度を提供、専門家でないユーザーに堅牢なデータ解析をもたらします。
ランダムな質量マッチングとその使用の質量分析によるプロテオーム解析でのテスト自動化の意義のモデル。
タンパク質のアイデンティティの意義をテストするための迅速かつ正確なメソッドは質量分析によるタンパク質ダイジェストとゲノム データベース検索の分析を提示決定。メソッドは、ランダムな測定と理論的蛋白分解ペプチド大衆のマッチングの統計モデルを用いて直接計算に基づいています。タンパク質同定アルゴリズムは通常タンパク質質量分析によって得られた大衆と理論的蛋白分解ペプチドの大衆データベース蛋白質の間のマッチの数に基づいてスコアに応じてゲノム データベースのランクします。ランダム実験と理論の大衆のマッチング偽の結果があります。結果だけ結果を特徴づけるスコア大幅にからの偽の結果を予想スコアから逸脱した場合に重要です。得点分布 （の数と一致する） ですランダム (false) の結果を計算の意義のいずれかに該当のテストことができますランダムなマッチングの直接我々 のモデルから実験および制約の検索データベース。タンパク質同定データの質の大規模プロテオーム プロジェクトを模倣するためには、低-高品質の蛋白質分解ペプチドの大量のデータ silico の生成し、その後意義テストを含めるように直接計算に基づく設計されたデータベース検索プログラムを提出されました。このシミュレーションの手順は、直接の意義を自動的にペプチッド シーケンス解析に例えばタンデム質量分析による蛋白質のアイデンティティを決定するために受ける必要がありますサンプルのスクリーニング テストの有用性を示します。
プロテオミクスにおける情報とデータの管理。
プロテオミクス大量の実験データと解釈された結果によって支配さになっています。この実験データは、その情報コンテンツの基本構造を理解し、その知識から抽出方法で情報を表すことがなく効果的に使用できません。このレビューはこの情報に関して 3 つの根本的な問題の構造を探る: raw データ、関与プロジェクトの規模とタンパク質同定結果の統計的有意性の抽出の関連情報。
モジュラー架橋タンパク質相互作用を探るためのアプローチ
方法は、新規な架橋試薬と質量分析を用いたタンパク質 - タンパク質相互作用の解明に記載されている。方法は、架橋試薬を生成するための（1）モジュラー固相合成戦略、（2）濃縮microconcentratorsを使用して架橋タンパク質の消化、架橋ペプチドの（3）質量分析、（4を組み込んだ架橋データの）包括的な計算解析。この統合アプローチは、ヘテロ二量体タンパク質複合体負の因子2のコンポーネント間の架橋結合の研究に適用されています。
一般的なスコアリング方式を用いた質量分析法を用いたタンパク質同定の統計的有意性を評価するメソッド。
本稿は生存関数や期待値タンパク質同定実験の結果を評価するために使用を調査します。これらの関数は、様々 なタンパク質同定のスコアリング方式は、一般的な簡単に interpretably の表現を減らすために使用できる標準の統計的尺度です。スコアリング システムの相対的な利点は、このアプローチとして主識別パラメーター変更の効果を使用して検討しました。我々 は、簡単かつ統計的に有意な方法でその結果を比較できる異なる同定アルゴリズムの簡素化および標準化のタンパク質同定の結果, 自信のレポートにこれらの単純な統計的尺度の普及を主張したいです。メソッドは、スコアリング アルゴリズム、シーケンス データベースと質量スペクトルの任意の組み合わせに固有の正確な生存関数その結果ほとんどの蛋白質の識別検索エンジンによって破棄されている情報を使用してこれらの分布を測定するために説明します。
正確な割り当て、結果の統計的有意性と誠実さ：、タンパク質・同定・ アルゴリズム。
タンパク質同定アルゴリズムは質量分析による蛋白質分解ペプチド マッピングに基づいて、ゲノム データベース検索提示されます。アルゴリズムはランダム一致の確率の直接計算に基づくデータベース蛋白質のランクし、各結果に統計的有意性を割り当てます。アルゴリズムの性能をシミュレーションにより調査し、アルゴリズムにランダムなデータ応答する希望の方法で統計的有意性の計算を特定識別結果が偽であることのリスクを示すことを示します。
タンパク質同定結果の統計的有意性蛋白質シーケンスの数の関数としての検索。
真の質量分析によるタンパク質同定結果を得るため潜在的なアルゴリズムの選択および質量分析データの情報コンテンツに影響を与える実験的要因によって異なります。決定的に、結果は true ですがの適切な選択アルゴリズムの結果が false である統計のリスクの測定を提供できます現在の方法ことを証明することができます決してすなわち、統計的有意性。最近、アルゴリズム、統計の意義各結果に対して割り当てます誠実を示した。ための任意の選択アルゴリズムの統計的に有意な結果を得ることの難しさで検索シーケンス コレクションのタンパク質配列の数によって異なります。ランダムなタンパク質同定と誠実アルゴリズムを用いたシミュレーションにより、我々 ここで明示的にどのように統計の意義で検索シーケンスの数に依存実証します。また統計的有意性の分類学的制約の開業医の選択にどのように影響に関する例を提供します。
プロテオミクスは、吸収の研究、分布、代謝、排泄、および毒性へのアプローチ
プロテオミクスのアプローチは、候補薬剤による治療後のマウスで変更されたレベルが表示された肝臓のタンパク質を同定するために使用された。候補薬剤または治療で処置したマウスの肝臓からのサンプルを調製し、定量化し、CyDye DIGEのフルールで標識し、二次元電気泳動に供した。つの異なる等電点電気泳動間隔からゲルのスキャンとイメージング（3-10、7-11、6.2から7.5）に続いて、自動化されたスポット処理は、処理の間に20％以上異なることが判明したものを含むゲルスポットの多数で行われたと未処理の状態。その後、差動調節タンパク質は、（b）はポストソース分解、化学的に支援フラグメンテーションを利用して、（）マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析ペプチドマス·フィンガープリンティングを用いた質量分析の3段階のアプローチを行ったおよび（c）液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析。このアプローチを用いて、我々はこれまでのところ、候補薬剤を持つマウスの治療後に121差動調節タンパク質を解決し、これらを使用して質量分析法の110を同定した。そのようなデータは潜在的に薬物と同様に治療後の潜在的な毒性に関与するタンパク質の代謝に改善された分子の洞察力を与えることができます。差動調節タンパク質は代謝研究の目標として、あるいは毒性のマーカーとして使用することができます。
うろつきを用いたタンパク質シーケンスを見つけます。
うろつき質量分析から派生した入力データを使用して、タンパク質配列の同定のためのツールのコレクションです。質量分析計の様々 な種類の実験データは、うろつきのコンポーネント ソフトウェアに直接入力できます。このユニットは個々 のうろつきツールのいくつかのプロトコルを提案する.具体的には、PepFrag のタンデム質量分析法から派生した単一スペクトル解析できます。GPM、その一方で、複数の MS/MS スペクトルを解析するためを提供します。追加議定書 ProFound ペプチド大量データの指紋採取の単一スペクトル分析を紹介します。
評価、比較、およびいくつかの公開されている MS/MS の正確なベンチマーク検索アルゴリズム: 感度と特異性の解析。
MS/MS と関連付けられているデータベース検索アルゴリズム ペプチドを識別するための不可欠プロテオーム ツールです。彼らの普及により, 様々 なアルゴリズムの系統的解析は、現在使用中を実行する時間になりました。HUPO プラズマ プロテオーム プロジェクトで使用される血液標本を使用して、我々 は 5 つの検索アルゴリズム感度および特異性に関して検討を行った、それら指定された偽陽性 (FP) レートに基づいてベンチマークも正確に。スペクトルのミル、SEQUEST 感度の面でよく実行されるが、マスコットに劣っていた X ！タンデム、およびソナー特異性の面で。全体的にみて、マスコット、確率的探索アルゴリズムが正しく指定された FP 率に基づくほとんどのペプチッド識別。Rescoring のアルゴリズムは、PeptideProphet、SEQUEST アルゴリズムの全体的なパフォーマンスの強化し同様、FP エラー率の予測を提供します。理想的には、各ペプチド スペクトル、または最低でも、逆シーケンス検索から派生して、検証済みのデータ セットに基づく本研究で示したようにスコアのしきい値を計算する必要があります。X などのオープン ソースの検索アルゴリズムの空室状況 ！タンデム、それをさらにすなわち、「コンセンサスを得点」に基づいて検証プロセス （手動または自動) を改善するために実現可能な FPs の補数の数を減らすために複数の （少なくとも 2 つ) の検索アルゴリズムの使用になります。
ホスホチロシン シグナル伝達ネットワークにおける上皮成長因子受容体の扁平上皮癌細胞の過剰。
過剰発現と強化された活性化上皮成長因子 (EGF) 受容体の予後と相関関連づけひとがんで頻繁なイベントです。抗ホスホチロシンおよび抗 EGFr のアフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、同位体コーディング号-MS/MS、および immunoblot メソッドを記述し、EGF 受容体活性化および薬理学的抑制に関連付けられたネットワークの信号を測定する結合しました。EGF 受容体の染色と持続的な受容体キナーゼの活性化が表示されます、モデル システムとして、エルロチニブによる EGF 受容体キナーゼの薬理作用の阻害が著しく基板自動リン酸化、トータル EGF 受容体タンパク質を増加させながら Src 家族リン酸 EGFR Y845 で減少を使用した、扁平上皮癌細胞株 HN5。機能性タンパク質のリン酸化または複合どちらか蛋白質チロシン紛らわしい, 主含む EGF 受容体と Src 家族キナーゼ シグナル伝達複合体 (18%) 主 1) 即時 EGF 受容体を介しての親和性選択によるクラスが明白に識別された知られていると悪いの多様なセットを記述; 2) 錯体接着と細胞の接点 (34%); と 3) 受容体内在化と劣化関与信号。小説と既知のリン酸化サイト ペプチド混合系の複雑さにもかかわらず見つかりませんでした。複数のシグナリング アダプター Grb2、SHC、SCK、NSP2 やり取りに加えて、HN5 細胞における EGF 受容体フォーム直接的または間接的な物理との相互作用追加キナーゼ ACK1、焦点接着キナーゼ (FAK) を含むことが示された Pyk2、はい、EphA2、および EphB4。薬理学的に抑制エルロチニブによる EGF 受容体キナーゼ活性をされた下流のシグナリング、たとえば Cbl/Cbl-B を通じて、ホスホリパーゼ Cgamma (PLCgamma) の減少のリン酸化 Erk1/2、PI 3 キナーゼ, および STAT3/5。焦点接着タンパク質, FAK Pyk2、paxillin、ARF/GIT1、plakophillin ダウン規制によって過渡 EGF 刺激細胞接着錯体のコントロール成長誘導因子キナーゼとホスファターゼ活動間の複雑なバランスを示唆していた。Igf-1 受容体、リゾホスファチジン酸 （LPA） シグナル、および EGF 受容体間の機能的相互作用が認められた、両方直接・間接的フォスフォ Akt フォスフォ-Erk1/2 とフォスフォ リボソームタンパク S6 に。
複雑な混合物中のタンパク質の同定。
この紙蛋白分解ダイジェスト複雑なタンパク質混合試料の大量データに基づいて成功質量分析によるタンパク質同定の展望を調査します。セット消化タンパク質混合物の様々 な数字を表す蛋白分解ペプチド大衆の silico で生成されました。各セットは、異なる蛋白質が蛋白質シーケンス コレクションから選ばれた、各蛋白質のシーケンスのカバレッジは、特定の政体 (15-30 ％ または 30-60%) 内でランダムに選択されました。私たちがで反復的なプロシージャを採用、ランダムな干渉の最適の公差は、によって特徴付けられる、誠実アルゴリズムが正しく識別することができますを示す目希望意義レベルで混合物の蛋白質の 95 ％ で構成される現実的な質量分析法による実験的制約の下でイースト蛋白質の何百もの。豊富な蛋白質の分布のモデルを使用して、識別情報の手順の適切な選択によって達成することができます蛋白質の混合物の非常に高効率質量分析によるダイナミック レンジの制限によって妨げられていることを示すため。結果は、潜在的の低豊富な蛋白質を識別する可能性を制限、ダイナミック レンジなど本当に重要な問題に焦点を当てて、包括的なプロテオーム解析の慎重に実験的プロトコルを選択する欲望をストレスします。
タンパク質の質量基づく指紋同定のための検索条件を最適化します。
蛋白質シーケンス コレクション MS データを検索することによって、タンパク質同定の 2 つの中央問題低豊富なタンパク質の同定と正確な割り当ての結果が false である確率ができるように実験的情報の最適な使用されます。包括的な MS ベースのタンパク質同定のため適切なアルゴリズムと最適な検索条件を選択する必要があります。PMF に基づいてタンパク質同定にそれぞれの結果の統計的有意性を割り当てます、確率アルゴリズムを使用して異なるシーケンス コレクション検索条件下での質の体系的な研究を報告します。2244 PMFs 2 デ区切られたひと血漿タンパク質から採用し、様々 な検索制約の下での同定を実行: 質量精度 (0.01 0.3 Da)、逃された谷間サイト （0-2） の最大数と、シーケンスのコレクションのサイズで検索 （4 1.8 x 10(5)) x 5.6。重大な結果 （有意水準 0.05、0.01, 0.001) の各状態の数を数えて、プロテオーム解析実験の結果を成功させる検索条件への影響を示します。ペプチドをマッチング アルブミンの質量偏差を利用した質量補正手順識別の統計的有意性を改善しようテストされ、反復検索各 PMF から複数のタンパク質の同定のために採用されました。
SwePep、内因性ペプチドおよび質量分析のために設計されたデータベース。
特に内因性ペプチドのために設計された新しいデータベース SwePep、質量分析法を利用した複雑な組織サンプルから識別プロセスを大幅にスピードアップに構築されています。特定のプロセスで実験的ペプチド大衆両方と可能な翻訳後修飾なしのデータベースに格納、ペプチド大衆と比較されます。この中間の識別手順は速く、潜在的な内因性ペプチド、タンデム質量分析データを後で確認できるペプチドをシングルします。この方法論の成功のアプリケーションが掲載されています。SwePep データベースは、MySql や Java を使用して開発するリレーショナル データベースです。データベースにはから 394 異なる種として 50 の新規ペプチド当研究室で識別される脳組織から発信されるさまざまな組織から 4180 注釈付き内因性ペプチドが含まれます。質量、等電点、シーケンス、および前駆体タンパク質を含むペプチド、についての情報もデータベースに格納されます。この新しいアプローチは、peptidomics のフィールドで識別処理中に発生するボトルネックを解消するための大きな可能性を保持します。SwePep データベースは公開しています。
LC MS を用いたタンパク質同定の再現性
液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS) データ、クロマト グラムと、対応する質量スペクトルを確認して、通常実行の伝統的な解析は、時間がかかり、困難です。詳細なデータ分析したがって、プロテオミクス アプリケーションでしばしば省略されます。複数のプロテオミクスのサンプルを分析する際、通常見直される最終的なリストの識別された蛋白質のみです。識別された蛋白質のリストの内容はタンデム質量スペクトルのコレクションをトリガーするための条件に大きく依存ためこれ不必要に複雑なや矛盾の結果につながる可能性があります。信号強度の異なる LC MS 実験におけるペプチドの小さな変化はタンデム質量スペクトル別では 1 つの実験のコレクションにつながることができます。また、タンデム質量分析法の実験の質は、他人ではないが、いくつかのケースでの成功の同定につながる異なることができます。新規イメージ分析アプローチを使用して、リテンション時間を使用して別の LC MS 実験全体ペプチドを照合することによって再現性の非常に高い繰り返し分析を達成し、質量電荷 （m/z) を親に可能です。また、最終的な結果を視覚的に確認するために簡単です。シロイヌナズナのオルガネラ濃縮分数から積分膜タンパク質のトリプシン ダイジェストを使用してこのアプローチ調査され、それは非常に非常に再現性、一貫性、および信頼性の LC MS データ解釈が行われることが実証されています。
成果物とペプチド 2次元信号強度マップ データの可視化を用いた液体クロマトグラフィー/質量分析法のデータの変更の検出。
我々 は、液体クロマトグラフィー/質量分析法のデータの可視化、2次元信号強度マップとしてを使用してデータ、確認ポスト翻訳の修正のためだけでなく、高分子の汚染物質や成果物を識別するための全体的な品質を評価する方法をデモンストレーションします。
タンパク質同定データ セットの全体的なメリットを決定する: Rho ダイアグラムと Rho スコア。
タンデム質量スペクトルを使用してペプチッド シーケンス割り当てのセットのメリットを決定する簡単なヒューリスティック法について述べる。メソッドは、シーケンスの割り当てアルゴリズムの既知の確率的挙動に関する特定のデータ セットから生成された割り当てに基づいて予測を比較する関与。この比較の特定の定式化はこのプロットからは、rho スコアを派生パラメーターと同様に、データ、rho ダイアグラムのプロットの建設を通じて定義されています。このプロットとパラメーター容易にペプチッド シーケンス割り当てのセットの相対品質を特徴付けるとプロテオミクス データの解釈のためのしきい値値確率の簡単な決定を許可することができることが示されました。このプロットは、アルゴリズムまたは一連の実験結果の統計的有意性を推定する使用得点方式の独立しています。むしろ、それらの見積りの正しさの客観的なテストとして使用できます。Rho スコアをパラメーターとして使用してプロテオーム種の分類カテゴリー間で作られたものなどのタンパク質同定の相対的なメリットを評価することもできます。
内因性ペプチドの特定および敏感な同定のための Neuropeptidomics 戦略。
目標とされたシーケンスのコレクションを使用して新しいアプローチは、内因性ペプチドを識別するために開発されました。このアプローチは、内因性ペプチドの高速、特定、および機密性の高い同定できます。3 つの異なるシーケンス コレクション本研究では、peptidomic サンプルを模倣するように構成された： SwePep 前駆体、SwePep ペプチドと SwePep を予測しました。これら 3 つのシーケンスのコレクションに対して実行される神経ペプチドの検索神経ペプチドの識別に用いられる全体マウス プロテオームに対して実行された検索と比較しました。これら 4 つのシーケンスのコレクション マスコットと X の両方で検索された ！タンデム。シーケンスのコレクションの評価は、手動で特定されたと以前確認されたペプチドのセットを使用して達成されました。3 つの新しいシーケンス コレクションを使用するはより正確に 3 倍も多くとマウス プロテオームの比較の 1 ％ 以下の偽陽性率とペプチドが大幅に同定されたサンプルを模倣します。シーケンスの新しいコレクションは、また以前未同定のペプチド脳組織から識別するために使用された;27 以前未同定のペプチドと潜在的生理活性ペプチドを同定しました。これら新規ペプチド ペプチド前駆体プロホルモンおのための特徴のサイトから切断され、いくつかの特徴的な神経ペプチドのポスト翻訳の修正があります。異なる種のターゲット蛋白質シーケンスのコレクションは、SwePep からダウンロード可能な公開です。
タンパク質数度分布において、実験デザインをモデリング プロテオーム解析の成功率を向上します。
真に包括的なプロテオーム解析システム生物学、バイオ マーカー探索の努力で非常に望ましいです。しかし、完全なプロテオーム解析タンパク質元素存在度の非常に広い範囲には不十分である、実験的デザインの動的範囲と検出感度によって妨げられています。包括的な分析的な努力の実験デザインによる消化タンパク質の質量分析法を用いた同定続く分離を伴います。結果は、一般的に識別を逃されたプロテオームの割合に関する情報はないのコレクションとして報告されているので、彼らは困難を評価して潜在的に誤解を招くです。ここで実験のデザインの全体的なビューを取り、どんな与えられた実験の成功率を推定する計算機シミュレーションによってこの問題を解決します。我々 のアプローチは、典型的な実験的デザインの簡単な変更のプロテオーム解析成功率によって 5 - を 10 倍高めることができることを示します。
LC MS データをスキャンする自動化された方法を重要なペプチッドおよび蛋白質、定量的プロファイリング、対話型の確認などを設定します。
タンパク質やペプチドによる LC MS の微分の定量化について生物学的プロセスとバイオ ・創薬ターゲットを見つけるための知識を獲得する有望な方法です。ただし、LC-MS による差動タンパク質解析に適したソフトウェア ツールの欠如によって戻って開催されています。大量の実験データは簡単に蛋白質およびペプチッドの実験、プロファイリングで生成されますが、データ解析は時間がかかり、労力のかかる作業です。ここでは、生物学的に有意なペプチッドおよび蛋白質の LC-MS/MS データをスキャン、対話型の確認のためのサポートを含む、さらにプロファイリングを完全に自動化された手法を提案する.既知の組成のペプチド混合系を研究することによって、統計的検定を使用するためペプチド試料の異なるグループで異なる量存在自動的に上映することができることを示すため。線形応答はほぼ 3 さらにペプチドと興味の蛋白質のプロファイリングを容易に、桁違いに取得できます。また、パーキンソン病の症状を誘発する古典モデル薬物レセルピンの投与後のマウス脳線条体における内因性ペプチド レベルの変化を研究する手法を適用します。
情報学の発展： 課題とソリューション」MALDI 質量分析法。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI-MS) 生物学的質問トラフ タンパク質、ペプチド、核酸の分析の解明に正常に適用されました。ここでは、MALDI-MS によって生成されたデータを分析するため、さまざまなアプローチを確認します。分析の最初の手順は、検体に対応するピークを見つけるために raw データの処理です。ピークはそのエリア （または高さ） 特徴付けられるその重心と。ピーク面積は試料量のメジャーとして使用できる、重心使用検体の質量を確認できます。大衆は、検体のモデルに比べているとこれらのモデルはどれだけのデータに合わせてに従ってランク付けされ、その意義が計算されます。これは、検体の id (順序と変更) の決定ができます。蛋白質・核酸化学としてプロテオミクスのこの一般的なデータ解析ワークフローの適用方法を示します。
ナトリウム Sds-ポリアクリルアミドゲルによる再現性のあるタンパク質の分別用 DNA の梯子のゲルの電気泳動 (SDS-PAGE) 量的プロテオミクスを。
プロテオミクスで一次元 (1 D) ナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 広く蛋白質分画質量分析の前に分析のダイナミック レンジを強化して低豊富なタンパク質の同定を改善するために使用されます。蛋白質分離前にラベル付けされている場合このようなタンパク質 prefractionation quantitation の戦略をよく動作します。特に少量試料を分析するときは、ただし、大きく制限切削ゲルのスライスの貧しい再現性のため、無料のラベルとペプチド ラベリングの量的プロテオミクス手法に応用されています。この制限を克服するには、ページ分離する前に蛋白質のサンプルの DNA の梯子を混合新しい戦略を開発しました。ページの分離後、DNA の梯子簡単、精密、高再現性ゲル切削を許可するように汚れます。この末尾に目に見える DNA 染色法が開発されました。この染色法は、高速、高感度、質量分析法との互換性です。DNA の梯子アシスト ゲルの定量的蛋白質分画の切断の再現性を評価するには、細胞培養 (SILAC) のアミノ酸と安定同位体標識を使用しました。分別と関連付けられている量的エラー DNA アシスト分別を使用して最小化できる、複数のレプリケートのゲルの切削件します。結論としては、1 D ページ分別 DNA の梯子と組み合わせてラベル無料比較プロテオミクスの定量を損なうことなくが使用できます。
大腸菌RNAポリメラーゼのバクテリオファージT4でエンコードされた変更の迅速な分離と同定：バクテリオファージ/ホスト相互作用を研究するためのジェネリックメソッド
バクテリオファージは、細菌細胞に感染する細菌ウイルスであり、それらは細菌のRNAポリメラーゼを変更するには、独創的なメカニズムを開発しました。バクテリオファージT4-感染細胞から大腸菌RNAポリメラーゼを精製するために急速に、特定の、シングルステップのアフィニティ分離プロシージャを使用して、我々は宿主RNAポリメラーゼのバクテリオファージT4-依存性の変更を同定した。我々は、この方法論は、ホストの合成機械のバクテリオファージ依存変化を同定するための広く適用可能であることを示唆している。
質量分析リン酸化ペプチドフィンガープリントによるリン酸化の効率的な同定
我々は、リン酸化ペプチドの同定、我々は長期的質量分析（MS）リン酸化ペプチドフィンガープリンティングのための迅速かつ効率的な方法を説明します。メソッドは、ネイティブに対して完全に脱リン酸化タンパク質のタンパク質分解ペプチドの定量的な比較が含まれます。セリン、スレオニン、チロシン残基のリン酸化は、フッ化水素（HF）と分離したタンパク質のゲル内治療により達成される。以前にリン酸化ペプチドに対応するそれらの修飾されていないペプチドの濃縮には、この化学脱リン酸化の結果。のピークの信号対雑音比の定量的な比較治療に対する未処理のサンプルはタンデム質量分析（MS / MS）により確認し、さらに検討することができるリン酸化ペプチドを同定するために使用されます。我々は、8つのアフリカツメガエルのオーロラの既知のリン酸化部位キナーゼと同様に、アフリカツメガエルの染色体パッセンジャー複合体（CPC）のいくつかの新しいサイトを識別するためにこのメソッドを適用しました。
タンデム質量スペクトルのデータベースを使用して内因性ペプチドの同定の検証。
SwePep データベースは内因性ペプチドおよび質量分析のために設計されています。前駆体タンパク質と潜在的な翻訳後修飾ペプチドに質量、pl などに関する情報が含まれています。ここでは、我々 を改善しているとタンデム質量スペクトルと SwePep データベースはローカルでキュレーションのバージョンのグローバル プロテオーム マシン データベース (GPMDB) を追加することによって拡張します。Peptidomic 実験実習では、複数のタンデム質量スペクトル別の品質と多くのペプチッド シーケンスが含まれています。新しいタンデム質量スペクトル データベース SwePep の高品質タンデム質量スペクトルを用いた低品質スペクトルの検証ことができます。検証は、スペクトルとの相関係数を計算するためのアルゴリズムを使用して 2 つのスペクトルの分裂パターンを比較することによって実行されます。本研究は、タンデム スペクトル データベース スペクトル スペクトル同定ペプチドの同定の伝統的な蛋白質シーケンス データベース検索を使用する代わりに使用できる内因性ペプチドの最初のステップです。
SILAC を使用して Orbitrap - 線形イオン トラップ質量分析計とエフェクタをシグナリング EphB のスクリーニング。
エリスロポエチン産生肝細胞癌 （Eph） 受容体は開発、神経可塑性、ガンで重要な役割を果たします。我々 は Orbitrap 質量分析計と細胞培養 (SILAC) のアミノ酸によって安定同位体標識を識別し、定量化の 204 蛋白質 antiphosphotyrosine immunoprecipitates で大幅に変更された豊富な ephrinB1 Fc 刺激後使用。EphB 受容体下流既知エフェクターすべての半分以上は EphB シグナル伝達のための多数の小説候補と同様にこの研究で同定されました。
比較プロテオミクス細胞培養中のアミノ酸によって安定同位体標識を使用するための試料作製における変異の評価。
比較プロテオミクス研究では、サンプルの準備に関連付けられている変動を知ることが重要です。本研究では、我々 （によって細胞培養中のアミノ酸の安定同位体標識) SILAC を使用しての戦略報告定量的プロテオミクス用試料作成における変化の影響を評価します。変動は同量の光と重い SILAC サンプルの平行、同じ試料前処理を受けるし、相対タンパク定量用質量分析法による 2 つのサンプルを混在しているときに測定できます。高い定量精度 SILAC の小さな変化のキャラクタリゼーションのためことができます。まず、免疫沈降 (IP) およびゲルの消化力の再現性を評価し、定量的精度複製数の影響が特徴だった。第二に、我々 は 3 つの連続したサンプルの準備のステップを含むワークフローを比較の全体的な変動評価: IP、SDS ページ分別とゲルの消化力。個々 のサンプルの準備手順の評価は実験的なデザインの非常に貴重だった: 複製の各手順の最適な数を容易に判断でしたし、ワークフローの全体的なバリエーション関与の個々 のステップの変化から推定できます。情報に基づいた実験的なデザインを使用して、サンプル調製の比較実験の複数のステップに関連付けられたエラーは適度に低いレベルに制限することができますを示した。
4 つのヒストン変異トリパノソーマ シストロン転写単位の境界をマークします。
通常は真核生物の遺伝子の転写による RNA ポリメラーゼ II （ポル II） トリパノソーマにシストロン転写単位に配置しないされます。1 つの例外、ポル II プロモーター モチーフが特定されていないと転写を開始する方法、謎が残ります。T. brucei が 4 つのヒストン変異: H2AZ、H2BV、H3V、および H4V。クロマチン免疫沈降 (ChIP) を使用してと (チップ seq) 我々 はヒストンの H4K10ac、H2AZ、H2BV、および、ブロモ ドメイン表示クロマチン コンポーネントのゲノム広い分布を調べるためシーケンシング因子 BDF3 は濃縮最大 300 可能性ポル II 転写開始部位 (TSSs) で。また、H2AZ と H2BV を含むヌクレオソームが正規のヌクレオソームよりも少なく安定していることを示す.我々 の分析をまた識別目 60 の予想外の TSS の候補者と長いグアニンの存在実行可能性 TSSs。 で明らかにユニークなトリパノゾーマに H3V と H4V の追加のヒストン変異は豊かにありそうなポル II 転写終了サイトで明らかにします。ヒストン修飾とヒストン変異転写開始における重要な役割を果たすし、終端トリパノゾーマとその不安定にヌクレオソームのヒストン変異によって進化的古代と一般的な機構による一般のポール II のトランスクリプション要因とらえどころのないされている有機体で実証、転写開始です示唆
システインリッチペプチド毒成分の急激な感度分析
そのようなヘビ、クモ、サソリ、特定の海洋カタツムリなどの動物からジスルフィド豊富なペプチド毒は、生物活性分子の自然の偉大な多様性ライブラリのいずれかを表しています。海洋円錐シェルの様々な種を単独で> 50,000別個のペプチド毒を生成すると推定されている。これらのペプチドは、ために強力に特定のイオンチャネルの機能を変更する能力のかなりの関心を刺激した。現在までに、この巨大なリソースのほんの一部が原因で10〜80、AA間のサイズの範囲である彼らの主要な構造を解明の難しさに特徴付けられている、最大5つのジスルフィド結合に含まれており、広範な翻訳後修飾を含むことができます。原油毒や関心の生物の多くは、DNAデータベースの欠如の異常な複雑さは、主要な分析課題を提示します。ここでは、粗毒のサンプルの成熟ペプチド毒素成分の解明のために質量分析を使用する戦略を説明します。この戦略の鍵は、電子移動解離（ETD）、全体のペプチドバックボーンを介して配列情報を生成することができ、質量分析フラグメンテーション技術の私たちの使用することである。しかし、包括的なシーケンスカバレッジETDのみ生成するため前駆体ペプチドイオンの電荷状態が十分に高いとm / z比が低く、我々の充電状態システイン含有ペプチド毒素を高めるためにターゲットを絞った化学的誘導体化戦略とETD組み合わせた場合。この戦略を使用して、我々は、単一の円錐カタツムリ（CONUS繊維）の毒腺から粗毒のわずか7％を使用して、31のペプチド毒素の全配列を取得しています。
ベンチマークLC-MSプラットフォームのパフォーマンスのための酵母の性能標準の特性室間共同試験
LC-MS/MSプラットフォームのパフォーマンスを最適化する、高品質のプロテオミクスデータを生成することが重要です。個々の研究所は品質管理のサンプルを開発しているが、コミュニティ内の異なる研究室間の複雑な生物学的プロテオーム解析のためのプラットフォームのパフォーマンスのベンチマークのための生物学的複雑さのない広く利用可能な性能基準（および関連付けられた参照データセット）はありません。酵母Saccharomyces cerevisiaeプロテオームの個々の製剤は、LC-MSプラットフォームの性能を特徴付けるためにプロテオミクスコミュニティの研究所で広く使用されています。それが最も広範囲に特徴付け複雑な生物学的プロテオームとすべての検出可能なタンパク質の存在量を推定するいくつかの大規模な研究に関連付けられている唯一のものですので、酵母プロテオームは、パフォーマンスの基準として一意に魅力的です。本研究では、酵母プロテオームは、長期を満たすために、認証標準物質として開発中である国立標準技術研究所を通じた地域への酵母の性能標準およびオファーのアリコートの大規模生産のための標準のオペレーティング·プロトコルについて説明します。コミュニティのニーズ。結果は、独自のパフォーマンスをベンチマークに研究室の基礎を提供し、現在の方法を改善するために、LC-MSの性能を特徴づけるメトリックのシリーズを使用して、我々は、参照データは、専門家の研究室で一般的に使用されるイオントラップ計器プラットフォームの標準的な性能を発揮セットを提供、新しい技術を評価する。さらに、我々はそれによって評価し、最小限に抑えるために、事前にメトリックを提供し、ヒトのタンパク質でスパイクした酵母の参照は、ベンチマークに複雑なマトリックス中の濃度の異なるレベルで発現差のタンパク質の検出のためのプロテオミクスプラットフォームのパワーを使用することができる方法を示しています比較プロテオミクス実験の分析と分析のバリエーション。
GINSモーション複製フォークの進行は、酵母のゲノム全体に非常に均一で明らかに
これまでの研究では、DNAの複製は、出芽酵母ゲノムの異なる部分上の変数の速度で進行する前記画像につながっている。新生DNAの生産に焦点を当て、これらの従来の実験は、複製フォークの進行のダイナミクスが強く局所クロマチン構造/アーキテクチャの影響を受け、機械との相互作用により転写、修理およびエピジェネティックなメンテナンスを制御していることを意味すると解釈されています。ここでは、全ゲノムGINS複合体のマイクロアレイ解析を組み合わせた時間分解クロマチン免疫沈降、複製フォークの不可欠なメンバーを使用してレプリケーションのダイナミクスを測定するための補完的なアプローチを採用しています。驚くべきことに、我々のデータは、この複合体は酵母内でその複製フォークの動態を明らかに関係なく、ゲノムの位置の非常に均一な速度で進行することを示している、以前は想定よりも単純で、より均一である。さらに、実験とモデリングの相乗使用は、新規生物学的な洞察に導く方法を示しています。特に、倹約モデルでは、私たちは正確にゲノム全体にフォークの動きをシミュレートすることができ、また、我々は低周波のフォークの停止に起因すると解釈微妙な現象を明らかにした。
アジア オセアニア人間プロテオーム組織膜プロテオミクス イニシアチブ。準備と標準の炭酸を洗った膜のキャラクタリゼーション
アジア オセアニア人間プロテオーム機構 （大栗) 目標の膜タンパク質の発見と膜のプロテオームの分析のための戦略の系統的比較と膜プロテオミクス イニシアチブに着手しています。この multilaboratory のプロジェクトは、小胞体と他の細胞器官を含むマウス肝臓から細胞画分の分析に基づいています。本研究では, 作製と炭酸塩-洗浄のステップ豊かに積分と脂質アンカー型膜タンパク質の検証を含む膜のサンプルは、初期評価のために使用戦略を提案する.17 の独立したデータ セット 5 種類のプロテオームのワークフローからの解析は進行中です。
グローバル プロテオーム マシンを使用して質量分析によるタンパク質の同定。
質量分析法によるタンパク質の同定は、生物学の研究で広く使用されます。ここで、タンパク質の同定と検証結果のためにはグローバル プロテオーム マシン （GPM） の使用方法を説明します。我々 は期待値、rho-図とスペクトル データベースを使用して結果の検証と同様にタンパク質シーケンス コレクションとスペクトル ライブラリを検索することによって識別をカバーします。
質量分析計を用いたタンパク質の定量
質量分析は、多くの生物学的研究では低濃度のタンパク質やペプチドを定量するための最適な方法です。ここでは、発見し、統合質量分析ペプチドのピークを、サンプル中に存在するタンパク質の量の堅牢な測定を得るために干渉を検出するためのメソッドを含むタンパク質およびペプチドの定量の計算面の範囲を記述します。
プロテオミクスの実験デザインのモデリング。
プロテオームの複雑さ良い実験デザインは成功捜査のために不可欠であります。ここでは、どのようにプロテオミクス実験モデル化できるし、これらのモデルのコンピュータ シミュレーションを使用して、実験的デザインを改善する方法について説明します。
質量分析法を用いたタンパク質解析をモデリング。
質量分析に基づいてプロテオミクスの成功は、データ分析の効率的な方法によって異なります。これらのメソッドは、データの情報の価値の詳細に理解が必要です。ここで、合成データを用いたシミュレーションを実行することによって情報の価値を解明する方法を説明します。
高容量イオントラップなしスキャン損失で包括的なリンクスキャンの飛行時間型質量分析計に結合
飛行時間型（TOF）質量分析計に結合された高容量イオントラップは、イオントラップ内のすべてのストアドイオンの包括的なリンクされたスキャンの分析を行うために開発されました。アプローチを低下させる、その性能に影響を与えずに10（6）よりイオン（範囲800〜4000メートル/ z）を格納することができます小説テーパージオメトリ高容量イオントラップが含まれます。イオンは衝突でTOFにより断片化し、分析し、m / zの関数として保存され、高容量イオントラップからスキャンされます。正確な質量分析は、前駆体とイオントラップから排出されるすべての種のフラグメントイオンの両方で実現しています。我々はそれらに対応する非リン酸化ペプチドとの混合物中のリン酸化の包括的なリンクされたスキャン識別するためのアプローチを示しています。
シーケンスと結合CD4ミミック幅広い、強力なHIV抗体の構造の収束
広くHIVの中和抗体の受動的な転送は、このような抗体を誘導するワクチンは保護になることを示唆している感染症を防ぐことができます。これまでのところ、しかし、自然に発生するいくつかの広く中和HIV抗体が特徴づけられている。これらの抗体は、関連する分子のより大きなグループの一部であるかどうかを判断するために、我々は4つの無関係な個人から576新たなHIV抗体をクローニングした。 4つのすべての個人は、CD4への結合を模倣する強力な広く中和CD4-結合部位抗体の拡大のクローンを作り出した。大規模な超変異にもかかわらず、新たな抗体は68免疫グロブリンH（IGH）鎖アミノ酸のコンセンサス配列を共有し、二つの関連のIgH遺伝子から独立して発生します。広く中和抗体VRC01に対する抗体のいずれかの結晶構造を比較すると、HIVスパイクに連絡先の保全を明らかにした。
