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Articles by Dor Salomon in JoVE
JoVE General
酵母の菌タイプIIIエフェクターの発現により誘導される増殖阻害表現型の同定
Department of Plant Sciences, Tel Aviv University
このビデオでは、我々は酵母における細菌のタイプIIIエフェクターの発現とエフェクター誘導性成長抑制の表現型を同定するための手順を説明します。そのような表現型は、その後、エフェクター機能と目標を明らかにするために悪用される可能性があります。
Other articles by Dor Salomon on PubMed
小分子リガンドとトマトのPTO耐性タンパク質のキナーゼ活性をバイパス
トマト（Solanum lycopersicum）のプロテインキナーゼPTOは、Pseudomonas syringaeのPVへの耐性を付与する。トマト細菌はAvrPtoとAvrPtoBエフェクタータンパク質を発現する。 PTOは、特に免疫応答の活性化を誘発する直接の物理的相互作用により、両方のエフェクターを認識しています。ここでは、PP1、ATP競合小分子阻害剤の類似体にPTOを敏感に化学遺伝学的手法を使用していました。感PTO（PTO（）など）との組み合わせでPP1類似体を使用することによって、我々はエフェクターの認識とシグナル伝達のPTOキナーゼ活性の役割を検討した。驚くべきことに、しばらくPP1類縁体を効率的に酵母two-hybridシステムのAvrPtoとAvrPtoBとPTOの彼らが強化された相互作用（など）を、in vitroでPTOのキナーゼ活性を（など）を阻害した。加えて、PP1アナログ、PTO（など）をバイパスする変異はPTO-AvrPtoの相互作用の重要な自己リン酸化部位または触媒残基のいずれかで不可欠の存在下で、両方のエフェクターと相互作用する。また、アナログPP1 3メガバイト-PP1の存在下で、PTOのキナーゼ欠損型（AS）は足底でAvrPto依存過敏感反応を引き起こした。これらの知見は、コンフォメーション変化はおそらくPTOにおける自己リン酸化によって引き起こされるとPTOにおけるリガンド結合（など）によって模倣ではなく、それ自体がリン酸化よりも、ことを示唆している細菌のエフェクターを認識するための前提条件です。認識後、キナーゼ活性は、植物体のPTOシグナリング用に不要と思われる。化学遺伝的戦略は、PTOの特定の小分子阻害剤を開発するためにここに適用されたin vivoでの他の植物蛋白質キナーゼの生物学的機能の研究のための非常に貴重なツールを表します。
植物プロテインキナーゼの機能解析のための化学遺伝学的アプローチ
植物のゲノムは、正確な機能とリン酸化ターゲットが同定されており、それらのごく一部はまだ、プロテインキナーゼ、数百をエンコードします。最近、我々はPP1、ATP-競争力と細胞透過性小分子阻害剤の類縁体にトマトのセリン/スレオニンキナーゼPTOを感作する化学遺伝学的手法を適用した。 PTOキナーゼは細菌エフェクターの特異的認識に免疫応答を活性化することにより、PSTの細菌に対する抵抗性を付与する。アナログ敏感なPTOとの組み合わせでPP1類似体を使用することによって、我々はエフェクターの認識とシグナル伝達のPTOキナーゼ活性の役割に新たな光を当てる。ここでは別の防衛関連の植物蛋白質キナーゼ、MAPキナーゼLeMPK3この化学遺伝学的アプローチの使用を広げる。さらに、そのアナログと小文字を区別しなく野生型キナーゼが興味のキナーゼのタギング直接リン酸化ターゲットに悪用される可能性がありますphosphodonorsとして不自然なN（6） - 変更されたATPアナログを使用することができますを示しています。したがって、小分子阻害剤PP1およびATPの類似体キナーゼの感作は、細胞機能や植物プロテインキナーゼのリン酸化基質の発見のための効果的なツールとなることができます。
Ssz1 小胞体関連タンパク質分解欠陥 Cdc48-ufd1-npl4 複雑骨折 Cdc48 によって発現細胞を復元します。
小胞体 (ER)-関連付けられている蛋白質分解 (ERAD) 経路異常タンパク質小胞体からを排除します。Cdc48p-Ufd1p-Npl4p の重要な役割を示す出芽酵母における障害者 ERAD によって任意の複雑な変異を有する酵母の遺伝子。我々 は SSZ1 cdc48 10 サプレッサーの遺伝的画面で識別し、それを示すトランスフォーミング Cdc48p 多面薬剤抵抗 (PDR) ネットワーク経由で。復元 pSSZ1 プラスミド ERAD-M の 6myc への Hmg2 の cdc48 10、ufd1 2 npl4 1 障害者 SSZ1 の削除には効果があるありませんでしたが。Ssz1p Pdr1p、ラオスのマスター調節因子をアクティブにします。確かに、プラスミド PDR1 またはそのターゲット遺伝子 RPN4 の cdc48 10 p レベルを増加し、ERAD M cdc48-10 の復元します。Rpn4p プロテアソームのサブユニットと CDC48 の転写を調節する、したがって RPN4 削除 ERAD 廃止します。ただし、低下のプロテアソーム レベル Deltarpn4 では障害者の ERAD M 減少 Cdc48p の結果だったし、pCDC48 の発現によって復元されたに対し、ゾル性細胞質基質の分解に十分だった。修正された ERAD-M Cdc48 パートナー ufd1 2 や npl4-1 pCDC48 プラスミドによる形質の lrp 6 ハイポモルフ系統と cdc48 10 細胞 pcdc48 10 プラスミッドによって結合も pSSZ1 も pcdc48 10 ERAD-L の CPY ※ を復元することを見つけると-ハ、Ssz1p 抑制効果は骨折 Cdc48p によってもたらさ私たちの結論をサポートします。
白葉の発現。酵母におけるVesicatoriaタイプIIIエフェクターは、細胞の増殖や生存に影響を与える
グラム陰性細菌白葉。 vesicatoriaは、トマトと唐辛子のスポット病の病原である。 X.白葉。 vesicatoriaの病原性は宿主細胞にエフェクタータンパク質を提供するIII型分泌システムに依存します。我々は、いくつかのX.白葉という仮説を立てた。 vesicatoriaのエフェクターは、保存された真核生物の細胞プロセスおよび酵母での発現により誘導される表現型検査を対象としています。テスト21のエフェクターのうち、14は正常またはストレス条件下で酵母の増殖を抑制した。生存率アッセイはXopBとXopF2減衰細胞の増殖は、AvrRxo1ながら、XopX、とXopE1は細胞傷害性であることを明らかにした。酵母細胞の形態学的特徴およびDNA含有量の検査はXopXとAvrRxo1によって引き起こされる細胞毒性がG0 / 1で細胞周期停止に関連付けられていることが示された。興味深いことに、酵母の成長を阻害しXopB、XopE1、XopF2、XopX、とAvrRxo1は、ホストまたは非宿主植物のいずれかで表されるようなクロロシスと細胞死としての表現型を、原因となった。最後に、酵母と植物の表現型を引き起こすには、いくつかのエフェクターの能力は、彼らの推定触媒残基または局在モチーフに依存していました。本研究では、X.白葉の機能解析のための異種システムとしての酵母の使用をサポートします。 vesicatoria III型エフェクター、それらの真核生物の分子標的と作用機序の同定のための段階を設定します。
細菌のエフェクタータンパク質の標的宿主細胞プロセスを識別する単純な酵母ベースの戦略
III型分泌システムを介して宿主細胞に送達されている細菌のエフェクタータンパク質は、病原体の利益のために調節する種々の宿主細胞のプロセスによってグラム陰性菌の病原性に重要な役割を果たす。細菌のエフェクターが対象と細胞プロセスを識別するために、我々は、単一の96ウェルプレートに嵌酵母の欠失株の配列を使用する単純な戦略を開発した。配列は、それが欠失株の数が少ないにもかかわらず、酵母合成致死作用ネットワーク内の遺伝子の大部分をカバーしている計算のような最適化されたという点でユニークです。配列の欠失株は利益の細菌エフェクターの発現に対する過敏症についてスクリーニングされる。過敏性欠失株は、その後の細菌エフェクターの潜在的なターゲットを識別するために、それらの合成致死性相互作用のために分析されます。我々は、白葉タイプIIIエフェクターXopE2の標的細胞のプロセスから、このアプローチを使用して、識別を記述します。興味深いことに、我々はXopE2は、酵母細胞壁、小胞体ストレス応答に影響を与えることを発見。より一般的には、単一の96ウェルプレートを使用しても研究室にアクセススクリーニングプロセスを行い、短時間で細菌のエフェクター多数の分析が容易になります。したがって、細菌のエフェクターや他の病原性蛋白質の機能と細胞標的を研究するための有望なプラットフォームを提供します。
ATP競合分子によって特異的阻害に感作性植物プロテインキナーゼ
プロテインキナーゼ触媒ドメインと植物の細胞膜の低透過性の高度に保存された性質は、in vivoでの標的個々のプロテインキナーゼは、特定の阻害剤の開発への挑戦をもたらす。ここでは、特に野生型キナーゼを阻害しない細胞透過性小分子に個々の植物のキナーゼを感作する化学遺伝学的手法を記述します。このアプローチでは、単一のアミノ酸置換はATP競合分子の特異的結合を可能にする酵素のATP結合部位に導入されています。細胞透過性分子は、その後、特にキナーゼの野生型のフォームを発現しない遺伝子組換えシロイヌナズナにおける感対立遺伝子を標的とするために使用することができます。この戦略は、植物体中のタンパク質キナーゼの機能解析のために、それらが関与するシグナル伝達経路の解剖のために有用なツールを提供しています。
