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Articles by Edward Avezov in JoVE
JoVE General
Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen
Wir beschreiben ein Verfahren zur Analyse der Veränderung der N-Glycane durch das frühe Leben von Glykoproteinen nach ihrer Biosynthese in Säugetierzellen. Dies wird durch Puls-Chase Analyse der metabolisch markierten Glykane, enzymatische Freisetzung von Glykoproteinen und Prüfung durch HPLC erreicht.
Other articles by Edward Avezov on PubMed
PERK-abhängige Untergliederung Der ERAD Und Entfaltet Protein Reaktion Maschinen Bei ER Stress
Anhäufung von misfolded Proteine in dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) aktiviert die ER-Membran-Kinasen PERK und IRE1 führt zu die entfaltet Protein-Reaktion (UPR). Wir zeigen hier, dass die UPR-Aktivierung löst PERK und IRE1 Segregation von BiP und ihre Sortierung mit misfolded Proteine zum Qualitätskontrolle ER abgeleiteten Fach (ERQC), ein Pericentriolar-Fach, die wir zuvor identifiziert hatte. PERK phosphorylates Übersetzung Faktor eIF2alpha, die dann Zytosolische auf der die ERQC ansammelt. Dominante negative PERK oder eIF2alpha(S51A) Mutanten verhindern die Untergliederung, während eIF2alpha(S51D) Mutant, die konstitutiven Phosphorylierung imitiert, sie fördert. Dies deutet auf eine Feedback-Schleife, in denen eIF2alpha Phosphorylierung Pericentriolar Konzentration auf die ERQC bewirkt wiederum die UPR wiederum verstärken. ER-assoziierte Abbau (ERAD) ist ein UPR-abhängigen Prozess; Wir finden auch, dass ERAD-Komponenten (Sec61beta, HRD1, p97/VCP, Ubiquitin) zu den ERQC rekrutiert werden macht es einen wahrscheinlich Standort für Retrotranslocation. Darüber hinaus zeigen wir, dass Autophagy ist vorgeschlagen, um die Beseitigung der aggregierte Proteine eine Rolle spielen, nicht im Zusammenhang mit Protein Akkumulation in der ERQC.
Endoplasmatisches Reticulum (ER)-Mannosidase Ich Aufgeteilt Und Für N-Glykan Trimmen Zu Man5-6GlcNAc2 in Glykoprotein ER-assoziierte Abbau Erforderlich Ist
Wir hatten zuvor gezeigt, dass Endoplasmatisches Reticulum (ER)-assoziierten Degradation (ERAD) der Glykoproteine in den Säugetier-Zellen beinhaltet Trimmen von drei bis vier Mannose Rückstände aus der N-chromosomale Oligosaccharid Man(9)GlcNAc(2). Als möglicher Kandidat für diese Tätigkeit ER Mannosidase ich (ERManI), beschleunigt den Abbau von ERAD Substraten beim Pleuramesotheliom. Obwohl in vitro, in niedrigen Konzentrationen ERManI wird nur eine bestimmte Mannose-Rückstände entfernt, in sehr hohen Konzentrationen kann es bis zu vier alpha1, 2-linked Mannose Rückstände Verbrauchsteuern. Anhand kleiner interferierender RNA Niederschlag von ERManI zeigen wir, dass dieses Enzym für trimmen, Man(5-6)GlcNAc(2) und ERAD in Zellen in vivo führt zu die Ansammlung von Man(9)GlcNAc(2) und Glc(1)Man(9)GlcNAc(2) auf ein Modell-Substrat erforderlich ist. Trimmen von ERManI auf die kleinere Oligosaccharide würde somit das Glykoprotein aus Reglucosylation und Calnexin Bindung Zyklen entfernen. ERManI ist auffallend konzentriert zusammen mit dem ERAD-Substrat im Pericentriolar ER abgeleiteten Qualitätskontrolle Fach (ERQC), das wir zuvor beschrieben hatte. ERManI Niederschlag verhindert Anhäufung von Substrat in den ERQC. Wir schlagen vor, daß die ERQC eine hohe lokale Konzentration von ERManI bietet und Passage durch dieses Fach Timing der ERAD, möglicherweise durch eine Radsport-Mechanismus erlauben würde. Beim frischgebackenen Glykoproteine richtig falten können nicht, führt Transport durch die ERQC zu trimmen einer kritische Anzahl von Mannose-Rückstände, ein Signal für die Verschlechterung auslösen.
