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Articles by Elizabeth Ottesen in JoVE
JoVE General
Extraction d'ADN de l'microbes de l'intestin des termites (Zootermopsis Angusticollis) et Visualisation microbes de l'intestin
Department of Environmental Science and Engineering, California Institute of Technology - Caltech
Cette vidéo illustre la technique d'extraction d'ADN à partir des espèces de microbes réside dans l'intestin postérieur des termites. La préparation d'une lame de montage humide, ce qui est utile pour visualiser la communauté microbienne intestinale est également illustré, et une tournée à travers les riches en espèces environnement intestinal est donné.
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DGC Ou Ne Pas DGC : Oxygène Gardiennage Dans Le Termite Zootermopsis Nevadensis (Isoptera : Termopsidae)
La capacité de certains insectes à s'engager dans des orchestrations complexes d'échanges gazeux trachéale a été bien démontrée, mais son origine reste obscure. Selon une hypothèse proposée récemment, insectes peuvent employer des stigmates contrôle des échanges gazeux pour protéger les tissus contre les dommages oxydatifs à long terme en utilisant le cycle des échanges gazeux discontinu (DGC) pour limiter la pression partielle de l'oxygène interne (PO2). Ce manuscrit décrit une approche différente à l'oxygène gardiennage dans le termite inférieur Zootermopsis nevadensis. Ces insectes n'affichent pas un GCR mais répondent à des concentrations élevées d'oxygène en limitant la zone de stigmates, résultant en une diminution transitoire des émissions de CO2. Des concentrations élevées de CO2 internes sont alors maintenues ; restauration normoxie entraîne une augmentation transitoire de la réciprocité dans les émissions de CO2 causées par la libération de CO2 endotrachéal excédentaire. Ces changements stigmatique zone reflètent active sur la protection des faibles concentrations de O2 internes et démontrent que règlement d'hypoxie endotrachéal prévaut physiologiques sur la prévention de l'accumulation de CO2. Cette adaptation peut refléter la nécessité de protéger les symbiotes sensible à l'oxygène (ou gut bug gardiennage). Les termites peuvent évitent la GCR parce qu'un rinçage périodique du système trachéal avec de l'air peut nuire les anaérobies obligatoires dont dépendent les termites inférieurs pour la survie sur leur alimentation native de bois mâchées.
Microfluidique Numérique PCR Permet L'analyse Multigénique Des Individuels Bactéries De L'environnement
L'inventaire des gènes et des techniques ont permis d'exploration métagénomiques rapide de la diversité bactérienne et les physiologies potentiels présents au sein des communautés microbiennes. Cependant, il reste non négligeable pour découvrir l'identité des bactéries de l'environnement portant deux ou plusieurs gènes d'intérêt. Nous avons utilisé la réaction microfluidique numérique en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier et d'analyser les multiples gènes différents obtenus à partir de simples cellules bactériennes récoltées dans la nature. Un gène codant pour une enzyme clé impliquée dans la symbiose mutualiste survenant entre les termites et leur flore intestinale a été utilisé comme un crochet expérimentale pour découvrir le jusqu'alors inconnu ARN ribosomal basée sur l'identité des espèces de symbiotes plusieurs. La capacité d'identifier systématiquement les bactéries porteuses d'un gène particulier et de relier deux ou plusieurs gènes d'intérêt pour les espèces individuelles résidant dans des écosystèmes complexes ouvre de nouvelles possibilités pour la recherche sur l'environnement.
Analyse Métagénomique Et Fonctionnelle Du Microbiote Intestin Postérieur D'un Termite De Bois D'alimentation Supérieur
De point de vue de la recherche fondamentale et la biotechnologie, il ya un intérêt considérable pour parvenir à une compréhension plus claire de la diversité des mécanismes biologiques utilisés lors de la dégradation de lignocellulose. Globalement, les termites sont un groupe extrêmement réussie de bois dégradantes organismes et sont donc importants à la fois pour leurs rôles dans le chiffre d'affaires de carbone dans l'environnement et comme des sources potentielles de catalyseurs biochimiques pour les efforts visant à convertir le bois en biocarburants. Ce n'est que récemment ont données pris en charge un rôle direct pour les bactéries symbiotiques dans l'intestin des termites dans la cellulose et l'hydrolyse du xylane. Ici, nous utilisons une analyse métagénomique du résident de la communauté bactérienne dans la panse intestin des espèces d'un bois-alimentation Nasutitermes «supérieurs» (qui ne contiennent pas de cellulose de fermentation protozoaires) pour montrer la présence d'un grand ensemble diversifié de gènes bactériens pour la cellulose et l'hydrolyse du xylane. Beaucoup de ces gènes ont été exprimés in vivo ou avaient une activité cellulase in vitro, et d'autres analyses impliquent spirochète et des espèces dans la dégradation de la lignocellulose Fibrobacter intestin. De nouvelles avancées dans d'autres importantes fonctions symbiotiques y compris le métabolisme H2, CO2-réductrice acétogénèse et la fixation de N2 sont également fournis par cette analyse du gène l'échelle du système premier d'une communauté microbienne à la dégradation de la lignocellulose spécialisée plante. Nos résultats soulignent la complexité même un environnement de 1-microl peut être.
Analyses De Développement Et Quantitative D'un Universel ARNR-soustraction Protocole Pour Metatranscriptomics Microbiens
Metatranscriptomes générés par pyroséquençage un potentiel considérable pour décrire les processus fonctionnels complexes dans les communautés microbiennes. Réunion ce potentiel nécessite des protocoles qui optimisent la récupération ARNm en réduisant l'abondance relative de l'ARN ribosomal, ainsi que des comparaisons systématiques pour identifier les artéfacts méthodologiques et d'essai pour la reproductibilité dans les ensembles de données. Ici, nous mettons en œuvre un protocole pour l'hybridation soustractive des ARNr bactérien (16S et 23S) qui utilise l'échantillon des sondes spécifiques et est applicable dans divers échantillons de l'environnement. Pour tester cette méthode, les ARNr et soustrait transcriptomes non soustraites ont été séquencés (technologie 454 FLX) à partir de communautés bactérioplancton à deux profondeurs dans l'océan oligotrophe ouvert, ce qui donne 10 ensembles de données représentant environ 350 Mbp. Hybridation soustractive réduite bactérienne abondance de transcription ARNr par 40-58%, plus la récupération de non-ARNr séquences jusqu'à quatre (de 12% à 20% de séquences totales à 40-49%). En testant cette méthode, nous avons établi des critères pour détecter des séquences répliquées via artificiellement erreurs pyroséquençage et identifiée de telle réplique comme un élément important (6-39%) de pyroséquençage Nombre de lectures. Après l'enlèvement répétition, des comparaisons statistiques de gènes de référence (identifiée par BLASTX à NCBI-nr) entre répétitions et technique entre les ARNr soustrait et des échantillons non soustraites a montré de faibles niveaux d'abondance transcription différentielle (<0,2% de gènes de référence). Cependant, le chevauchement des gènes entre des ensembles de données a été remarquablement faible, sans deux ensembles de données (y compris les pistes en double à partir du modèle de bibliothèque pyroséquençage même) de partage supérieur à 17% des gènes de référence uniques. Ces résultats indiquent que pyroséquençage capture un petit sous-ensemble de la diversité ARNm total et souligne l'importance de la fiabilité des procédures de soustraction ARNr pour améliorer la couverture de séquençage à travers la piscine transcription fonctionnelle.
La Diversité Des Synthétases Formyltétrahydrofolate Dans Les Entrailles De La Punctulatus Bois-alimentation Et La Blatte Cryptocercus Omnivore Blatte Periplaneta Americana
Nous avons examiné la diversité d'un gène marqueur de homoacetogens dans les communautés de blattes deux microbienne intestinale. Formyltétrahydrofolate synthétase (FTHFS ou FHS) préparés à partir de bibliothèques un cafard bois alimentation, Cryptocercus punctulatus, ont été dominés par des séquences affiliées à tréponèmes estomac des termites. Pas de séquences-spirochète comme ont été récupérés à partir du omnivores americana gardons Periplaneta, qui a été dominée par Firmicutes séquences de type.
Formyltétrahydrofolate La Diversité Génétique Synthetase Dans Les Entrailles De Hausse Des Termites Avec Les Régimes Et Modes De Vie
Dans cette étude, nous examinons la diversité des gènes pour les formyl-tétrahydrofolate synthétase (FTHFS), une enzyme clé dans homoacetogenesis, récupéré à partir du microbiote intestinal de six espèces de termites supérieurs. Les «plus élevé» termites (famille Termitidae), qui représentent la majorité des espèces de termites existantes et les genres, se livrent à une plus grande diversité de l'alimentation et de nidification styles que les "inférieur" termites. Des études antérieures de homoacetogenesis estomac des termites ont mis l'accent sur le bois-alimentation inférieurs termites, à partir de laquelle la prépondérance des séquences FTHFS récupérés ont été liés à ceux de tréponèmes acétogènes. Bien que les séquences appartenant à ce groupe étaient présents dans les entrailles de tous les six termites supérieurs examinés, tréponème séquences de type FTHFS représenté la majorité des séquences récupérées en seulement deux espèces (un bois-alimentation Nasutitermes sp. Et une palme d'alimentation Microcerotermes sp.) . Les quatre autres espèces de termites analysé (sp Gnathamitermes. Et deux Amitermes spp. Qui ont été récupérés dans des nids souterrains avec les stratégies d'alimentation pour une période indéterminée et une litière Rhynchotermes-alimentation sp.) A abouti à de nouveaux clades FTHFS pas observé une baisse des termites. Ces termites donné lieu à deux groupes distincts de probables Firmicutes purinolytic et un groupe important de homoacetogens potentiels liés à des séquences précédemment récupérés à partir des entrailles de cafards omnivores. Ces résultats suggèrent que les environnements intestinale de différentes espèces de termites supérieurs peuvent choisir pour les différents groupes de homoacetogens, avec quelques espèces d'hébergement des populations homoacetogen tréponème dominés similaires à celles du bois-alimentation, la baisse des termites alors l'hôte d'autres Firmicutes dominé par des collectivités plus similaires à ceux des cafards omnivores.
Analyse Métatranscriptomiques Du Bactérioplancton Marin De Façon Autonome, Collectés Et Conservés
L'activité microbienne planctonique et structure de la communauté est dynamique et peut changer de façon spectaculaire sur des échelles de temps d'heures à plusieurs jours. Pourtant, pour des raisons logistiques, cette échelle temporelle est généralement sous-échantillonné dans le milieu marin. Afin de faciliter une résolution supérieure, à long terme d'observation de la diversité microbienne et de l'activité, nous avons développé un protocole pour la collecte automatisée et la fixation des microbes marins en utilisant le Sample Processor de l'environnement (ESP) plate-forme. Le protocole s'applique un conservateur (RNALater) à cellules collectées sur des filtres, pour stockage à long terme et la préservation de l'ARN cellulaire total. Échantillons microbiens conservés en utilisant ce protocole a donné de haute qualité d'ARN après 30 jours de stockage à température ambiante, ou à bord de l'ESP à la température in situ. Pyroséquençage de banques d'ADN complémentaires générés à partir de ESP-échantillons prélevés et conservés ont donné des profils d'abondance de transcription presque indiscernables de ceux provenant traités de façon conventionnelle des échantillons répétés. Pour démontrer l'utilité de la méthode, nous avons utilisé un amarré ESP à distance et de manière autonome la collecte d'eau de mer de la baie de Monterey pour l'analyse métatranscriptomiques. Communauté ARN a été extrait et pyrosequenced partir d'échantillons prélevés à quatre points dans le temps au cours d'une seule journée. Dans tous les quatre échantillons, l'oxygénique photoautotrophes étaient principalement eucaryote, tandis que la communauté bactérienne a été dominée par Polaribacter-comme Flavobacteria et une bactérie Rhodobacterales partager une grande similarité avec Rhodobacterales sp. HTCC2255. Cependant, chaque point de temps a été associée à l'abondance des espèces distinctes et les profils de transcription du gène. Ces tests de laboratoire et de terrain ont confirmé que la collecte et la préservation autonome est une approche réalisable et utile pour caractériser les gènes exprimés et les réponses de l'environnement des communautés microbiennes marines.
Sonder Individuels Bactéries De L'environnement Pour Les Virus à L'aide De Microfluidique Numérique PCR
Les virus peuvent très bien être des entités biologiques les plus abondants sur la planète. Pourtant, ni les études ni métagénomiques classiques des techniques d'isolement de phages ont mis en lumière beaucoup plus sur l'identité des hôtes de la plupart des virus. Nous avons utilisé une réaction microfluidique numérique en chaîne par polymérase (PCR) approche de la physique lier simples cellules bactériennes récoltées à partir d'un environnement naturel avec un gène marqueur viral. Lorsque nous avons mis en œuvre cette technique sur la communauté microbienne résidant dans l'intestin des termites, nous avons trouvé les schémas d'infection genre à l'échelle d'affichage sélectivité intragenus remarquable. Viral diversité allélique marqueur révélé limité mélangeant des allèles entre les hôtes, en indiquant limitée transfert latéral de gènes de ces allèles malgré la proximité d'accueil. Notre approche ne nécessite pas de culture hôtes ou des virus et fournit une méthode pour examiner les interactions virus-bactérie dans de nombreux environnements.
