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Articles by Eric Kuhn in JoVE
JoVE General
La quantification des protéines à l'aide d'enrichissement d'immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, 3Broad Institute of MIT and Harvard, 4Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 5Plasma Proteome Institute
Normes des isotopes stables et capture par anticorps anti-peptide (SISCAPA) l'enrichissement affinités couples de peptides avec des isotopes stables de dilution spectrométrie de masse (MRM-MS) pour fournir une mesure quantitative des peptides comme substituts pour leurs protéines respectives. Nous décrivons ici le protocole en utilisant des particules magnétiques dans un format partiellement automatisés.
Other articles by Eric Kuhn on PubMed
Stress Post-traumatique Et Fonctionnement Psychosocial Dans Deux échantillons De Survivants MVA
Pour examiner les variables critère F du SSPT, le fonctionnement psychosocial de deux échantillons de véhicules automobiles, survivants de l'accident (MVA) a été étudiée. Au sein de chaque échantillon, des comparaisons entre les survivants MVA avec et sans le PTSD ont été réalisés sur quatre indices de fonctionnement psychosociales à trois points dans le temps. En outre, les relations entre les regroupements de symptômes de PTSD spécifiques et des indices de fonctionnement psychosociales ont été examinées. L'étude a révélé que, en général, survivants MVA d'ESPT montrent fonctionnement psychosocial plus pauvres que les survivants sans PTSD. Les symptômes émotionnels engourdissement de l'ESPT a émergé comme facteurs prédictifs plus cohérentes des indices de fonctionnement psychosociales. Les auteurs discutent les implications de ces résultats pour le traitement complet de l'ESPT.
Des « Incidents » Et « Accidents, » Un Commentaire Sur Stewart Et Seigneur
A. E. Stewart et J. H. Lord (2002) réclament l'abandon de l'accident de voiture à terme, de motor vehicle accident sur les motifs du patient et pour la définition des soins. Nous sommes en désaccord sur le terrain pour la définition et à cause de l'absence de données empiriques provenant des survivants d'accidents à l'appui de leurs prétentions.
Études Sur Le Traumatisme Vicariant D'étudiants Du Collège Par Le 11 Septembre Attaques : Effets De Proximité, De L'exposition Et De Connectivité
Depuis la mi-octobre 2001 jusqu'à la fin de novembre 2001, nous avons recueilli assez grandes séries de questionnaires d'étudiants de premier cycle à l'Université publique (Albany, NY, n = 507, Augusta, GA, n = 336, Fargo, ND, n = 526) pour évaluer le taux de l'état de stress aigu (ASD) et niveau de symptômes de TSA suite des attentats du 11 septembre, le taux de courant de stress post-traumatique (SSPT) et niveau de symptômes du SSPT, et les attaques du niveau actuel des symptômes dépressifs résultant du 11 septembre. Nous également recueilli des informations sur l'exposition à la couverture médiatique des attentats, connectivité au World Trade Center (WTC) et là le personnel et degré d'engagement dans des actes réparatrices comme don du sang, participation à des manifestations silencieuses. Nous avons trouvé des niveaux plus élevés de l'ASD, ASD PTSD, les symptômes et les symptômes du SSPT en fonction de la proximité géographique à New York (et au sein du site Albany, à proximité des résidences d'étudiants) et le sexe. Exposition (heures de télévision ont regardé) était un prédicteur dans certains cas comme la connectivité aux victimes WTC. ASD symptômes étaient le prédicteur le plus puissant des symptômes du SSPT ultérieures. Chemin d'accès modèles expliquent plus de 60 % de la variance dans les symptômes du SSPT.
Deux études De Morbidité Psychiatrique Chez Les Survivants D'accident Automobile 1 an Après L'accident
Nous avons évalué la comorbidité psychiatrique associée chronique stress post-traumatique (SSPT) (1-2 ans) secondaire aux accidents d'automobile des blessures (AVM) dans deux études. Dans l'étude 1, nous avons comparé les résultats des évaluations de SCID pour 75 demandes de traitement MVA survivants (51 SSPT) et 24 avec symptômes mais aucun PTSD. Dans l'essai 2, nous avons comparé les résultats semblables parmi les 132 survivants MVA qui avaient été suivies prospectivement pour 12++ mois après leur accident (19 d'ESPT, 32 qui avaient PTSD, mais qui avait remis et 81 qui jamais rencontré les critères pour le PTSD). Nous avons trouvé des niveaux comparables d'actuelle dépression majeure concomitante (53 %), des troubles de l'humeur (62-68 %), trouble d'anxiété (26 %) généralisée et une anxiété trouble (42 %) pour les deux groupes de participants d'ESPT chronique. Ces taux de comorbidité était plus élevés que ceux observés dans les groupes de comparaison non-PTSD avec des histoires similaires de MVA.
Quantification De La Protéine C - Réactive Dans Le Sérum Des Patients Atteints De Polyarthrite Rhumatoïde à L'aide De Réactions Multiples, Suivi Par Spectrométrie De Masse Et 13 Normes De Peptide De 14C
Une méthode générale pour la quantification des protéines dans le sérum humain a été développée à l'aide de la spectrométrie de masse (MS) et de peptides de synthèse étiquetés d'isotopes stables comme étalons internes. En utilisant cette approche, protéine C - réactive (CRP), un marqueur de diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde (PR), a été détectée dans des échantillons de sérum prélevés chez des patients atteints de pr érosive ou par et par rapport aux personnes bien portantes. Petits volumes d'échantillons de sérum ont été enrichis de protéines de faible abondance grâce à l'élimination sélective de l'albumine sérique humaine (HSA), immunoglobuline G (IgG) et l'haptoglobine. Après épuisement des protéines abondantes, la complexité du mélange protéique a été simplifiée à l'aide de la chromatographie d'exclusion stérique (SEC) pour fractionner des protéines dénaturées en plages discrètes de poids moléculaire. Fractions d'intérêt contenant du CRP, APW = 25 000, ont été regroupées, digestion par la trypsine, et puis des quantités fixes des peptides synthétiques ont été ajoutées au mélange. Le mélange de peptides tryptiques a été par la suite analysé par NANOFLUX chromatographie-tandem MS (nanoLC-MS/MS) à l'aide de surveillance multiple-réaction (MRM) sur un triple quadripôle masse spectromètre (TQ-MS). Le ratio des ions de transition dérivé les peptides endogènes et isotopiques marqués a fourni une mesure quantitative de la CRP dans les échantillons originaux tel qu'évalué par mesure indépendante de CRP dans les mêmes échantillons de patients en utilisant un test immunologique. L'utilisation de peptides synthétiques marqués isotopique et MRM est une méthode analytique puissante pour la présélection de biomarqueurs protéiques candidat dans le sérum humain avant l'apparition des anticorps et immunologique.
Utilisation De La Spectrométrie De Masse Pour Identifier Des Biomarqueurs Protéiques De La Gravité De La Maladie Dans Le Liquide Synovial Et Le Sérum Des Patients Atteints De Polyarthrite Rhumatoïde
Pour identifier un groupe de protéine candidate biomarqueurs de la polyarthrite rhumatoïde (PR) qui permet de prédire quels patients développeront une maladie érosive, invalidante.
Suivi éventuel D'un Et Deux Ans De Thérapie Cognitivo-comportementale Ou Psychothérapie De Soutien
Nous avons suivi jusqu'à plus de 90 % des 57 survivants accident automobile, qui ont terminé une comparaison contrôlée de thérapie cognitivo-comportementale (TCC) à la psychothérapie de soutien (SUPPORT). Les résultats d'un an a montré un avantage significatif continu sur diagnostic catégorique (PTSD ou non) et structuré entrevue mesures (CAPS) pour le CBT au fil de la prise en charge. D'autres mesures montrent généralement les mêmes résultats. À deux ans, nous avons suivi seulement 75 % des sortants d'un an. Bien qu'il existe toujours des différences arithmétiques favorisant CBT sur SUPPORT, avec ces atténué seules différences échantillons sur Checklist SSPT et Impact d'événements à l'échelle des scores et diagnostics catégorique dans l'ensemble étaient significatives. On note une amélioration très modeste de la fin du traitement pour le suivi de deux ans.
Une Réaction De Couplage Basés Sur La Fluorescence Pour Surveiller L'activité De La Synthétase De NAD Humaine Recombinante
NAD synthétase est responsable de la conversion de l'acide nicotinique adénine dinucléotide nicotinamide adénine dinucléotide. Cette réaction fournit une voie de biosynthèse de la coenzyme et, ainsi, une source des équivalents réducteurs cellulaires. Modifications du potentiel réducteur oxydant de la cellule ont été impliquées comme un facteur contributif dans de nombreux États de la maladie. Ainsi, cette enzyme représente une nouvelle classe de cibles potentielles de drogue et, par conséquent, nos efforts visaient à développer une analyse robuste pour utilisation dans un écran de haut débit. À cette fin, nous décrivons un format de dosage enzyme couplée à la mesure de la synthétase de NAD humaine recombinante en employant la lactate déshydrogénase dans une réaction de cyclisme/amplification en fin de compte lié à la génération de la fluorescence de résorufine de résazurine via diaphorase. Nous présentons la cinétique de la réaction de la synthétase de NAD dans le dosage couplé format, conditions de l'optimisation et l'inhibition de la réaction de gossypol [1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-3,3'-dimethyl-5,5'-bis(1-methylethyl)-[2, 2'-binaphtalène]-8, 8'-dicarboxaldéhyde] et illustrent la robustesse du dosage en démontrant les statistiques de Microplaque 384 puits plaque uniformité. Ensemble, nos résultats montrent que la méthode de dosage est robuste et bien adapté pour cette classe d'enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse de NAD +.
Stress Post-traumatique Et Symptômes Dépressifs Chez Une Population De Collège Un an Après Le 11 Septembre : L'effet De Proximité
Comme suite à notre précédent rapport [Behav. Res. Ther., sous presse] au niveau des symptômes de stress post-traumatique (STP), symptômes dépressifs et la fréquence des diagnostics de probable du stress post-traumatique (SSPT) chez les élèves de collège à trois universités publiques (Albany, New York, Augusta, GA et Fargo, ND) résultant du 11 septembre 2001. Les attentats terroristes, nous avons inventorié des groupes comparables d'étudiants (total, n = 1313) de ces trois institutions dans les semaines suivant le premier anniversaire (2002) des attaques. Nous avons trouvé des effets de proximité (Albany supérieur à Augusta, qui était plus élevée que Fargo) pour les combinaisons et les symptômes dépressifs, mais pas pour les fréquence des diagnostics de l'ESPT probable. Dans les données de site de Albany, proximité du comté de résidence à New York City (NYC) a également montré un effet de proximité sur les combinaisons. Bien que les symptômes dépressifs étaient significativement différentes en 2002 par rapport à 2001, les différences arithmétiques en combinaison ou en fréquence des diagnostics de l'ESPT probable n'étaient pas significatives. Les attentats du 11 septembre ont continué d'exercer un péage psychique sur les étudiants du Collège un an plus tard.
Fréquence Cardiaque Des Survivants D'accident Automobile Dans Le Service Des Urgences, Réactions Psychologiques Péritraumatique, ASD Et PTSD Gravité : Une étude Prospective De 6 Mois
Cette étude à petite échelle étudie les relations entre la fréquence cardiaque des survivants d'accident automobile présente à l'urgence (ED) et état de stress aigu (ASD) et gravité des symptômes stress post-traumatique (ESPT). Il examine également les relations entre la fréquence cardiaque de la survie de ED et dissociation péritraumatique péritraumatique posttrauma de détresse signalés à 2 semaines. Cinquante survivants d'accident (MVA) de véhicules automobiles ont été mises en recouvrement de 2 semaines, 1 (N = 42), 3 (N = 37) et 6 mois (N = 37) post-MVA. La fréquence cardiaque dans l'ED prédit autodéclarée gravité des symptômes ASD et la sévérité des symptômes de PTSD clinicien au prorata à 6 mois, mais pas à 1 ou 3 mois. Fréquence cardiaque survivants dans l'ED une corrélation significative avec la dissociation péritraumatique mais pas péritraumatique détresse. Ces résultats supportent le rôle de la fréquence cardiaque élevée ED comme prédicteur de DMPS et gravité des symptômes chronique PTSD et peuvent contribuer à préciser les résultats discordants des études antérieures.
Dosages Quantitatifs, Multiplexés Pour Protéines De Faible Abondance Dans Le Plasma Par Spectrométrie De Masse Ciblée Et Stable Isotope Dilution
Découverte de Biomarker produit des listes des marqueurs de candidats dont présence et le niveau doivent être vérifiées par la suite dans le sérum ou le plasma. Vérification représente un changement de paradigme des approches découverte impartiale aux méthodes ciblées, fondée sur des hypothèses et se fonde sur des analyses spécifiques, quantitatives optimisés pour la détection sélective des protéines cibles. Plusieurs biomarqueurs protéiques de monnaie clinique sont présents dans le plasma égale ou inférieure à la plage de nanogramme/millilitre et ont été inaccessibles jusqu'à présent par les méthodes axées sur le MS. À l'aide de multiples suivi de réaction couplée à la spectrométrie de masse de dilution isotopique, nous décrivons ici le développement du quantitatif, multiplexés assays for six protéines dans le plasma qui atteignent les limites de quantification dans la gamme de 1 à 10 ng/ml avec des coefficients de pourcentage de la variation de 3 à 15 % sans enrichissement d'immuno-affinité des protéines ou de peptides. Exemple de méthodes de traitement avec un débit suffisant, la récupération et reproductibilité pour permettre la détection robuste et au dosage de biomarqueurs candidats ont été développé et optimisé par l'ajout de protéines exogènes d'immunoaffinité appauvrie plasma provenant d'un donneur sain. Quantitative, réaction de multiples essais de surveillance ont été conçus et optimisés pour les peptides signature dérivé de protéines test. D'après les courbes d'étalonnage à l'aide de concentrations connues de protéine enrichi dans le plasma, nous avons déterminé que chaque protéine cible avait au moins un peptide de signature avec une limite de quantification dans la gamme de 1 à 10 ng/ml et la linéarité en général 2 ordres de grandeur dans la plage de mesure de l'intérêt. Limites de détection étaient fréquemment dans la gamme haute picogramme/millilitre. Ces niveaux de performance du test représente jusqu'à 1000 fois par rapport à l'analyse directe des protéines dans le plasma par MS et ont été obtenus par le traitement de l'échantillon simple et robuste impliquant la déplétion de protéine abondante et fractionnement minimal par chromatographie échangeuse de cations forts au niveau du peptide avant LC-multiple réaction surveillance/MS. Les méthodes présentées ici fournissent une base solide pour l'élaboration des épreuves quantitatives basées sur des protéines de niveau faibles dans le sang.
Une évaluation Contrôlée De La Thérapie Cognitive De Groupe Dans Le Traitement Du Syndrome Du Côlon Irritable
Nous avons randomisé, sur deux sites, 210 patients avec Rome II reçu un diagnostic de syndrome du côlon irritable (IBS), de sévérité au moins modérée, à l'une des trois conditions suivantes : groupe-based cognitive therapy (CT; n = 120), groupes de soutien psychopédagogique (n = 46) comme un contrôle actif, ou symptôme intensive et surveillance quotidienne du stress (n = 44). Cent quatre-vingt - huit participants ont achevé le traitement initial. Ceux de symptôme de surveillance ont été ensuite traversés au CT. Pour l'intention de traiter l'analyse sur une mesure composite de symptôme de GI provenant de tous les jours des agendas de symptôme, les CT et les groupes de soutien psycho-éducatives ont été nettement plus améliorées que celles dans le symptôme intense surveillance de condition, mais le CT et groupe de soutien psycho-éducatives ne diffère pas. Parmi les finissants de traitement sur la même mesure composite de symptômes gastro-intestinaux, encore une fois, les CT et psychopédagogique des groupes de soutien étaient statistiquement supérieures à la surveillance de symptôme mais ne diffèrent pas sur le composite de symptôme, ou sur toute autre mesure. Sur les symptômes du SCI, appui CT tant psycho-éducatives ont été statistiquement supérieure au symptôme suivi des réductions dans la tendresse et la douleur abdominale et des flatulences. Patients cotes globales à la fin du traitement a montré les deux conditions actives statistiquement supérieure au symptôme de surveillance sur les changements dans la régularité intestinale, avec CT supérieur au symptôme de surveillance sur la réduction de la douleur globale et amélioration de la sensation de bien-être. Données de suivi de trois mois sur 175 patients a révélé la maintenance d'amélioration sensible ou importante amélioration continuent tous les symptômes du SCI, y compris le Questionnaire de douleur de McGill. Groupe CT et psychopédagogique groupes Suites ne pas de différer toute mesure de soutien. Nous concluons donc que groupe CT n'est pas supérieur à une condition de contrôle placebo attention.
Le Rôle Du Stress Dans L'exacerbation Des Symptômes Chez Les Patients D'IBS
Recherche de traitement plus de 200 patients atteints du syndrome du côlon irritable syndrome (IBS) complété les mesures prospectives quotidiennes du stress et des symptômes gastro-intestinaux ainsi que des mesures rétrospectives du stress (événements de la vie plus de 12 mois, tracas, plus de 1 mois) de 4 semaines. Nous avons aussi obtenu des mesures de contrainte sur 66 contrôles nonill. Patients atteints du syndrome du côlon irritable rapportent tracas plus fréquents que chez les témoins et un plus grand impact de contraintes que celles des témoins. À l'aide de modélisation d'équation structurelle, nous avons constaté que les données étaient conformes à un modèle d'autocorrélation robuste effets de ces deux indices de symptôme de semaine gastro-intestinal (GI) (r =. 84) et les indices de stress (r =. 73), ainsi que de forts effets simultanés de stress sur les symptômes du SCI (r =. 90) et vice versa (r =. 41). Les données étaient également conformes à un modèle où il y avait des effets du stress en semaine t sur les symptômes digestifs hauts semaine t + 1 et t + 2, mais ils ont été véhiculées à travers les effets concomitants de la semaine et/ou des effets de l'autocorrélation. Il n'y a aucune voie indépendants statistiquement significative du stress au cours de la semaine t aux symptômes digestifs hauts en semaine t + 1 ou j + 2. Il y a donc plus de soutien pour une relation réciproque entre le stress et les symptômes qu'il est pour une relation causale.
Liés à L'abus De Mortalité Chez Les Patients Psychiatriques VA Mâles D'âge Mûr
Cette étude a évalué la mortalité et les causes de mortalité sur une période de sept ans parmi les patients psychiatriques mâles d'âge mûr avec et sans troubles liés aux substances utilisent trouble.
Développement Multiplexés Assays for Troponine I Et Interleukine-33 Dans Le Plasma Par Enrichissement D'immunoaffinité Peptide Et Spectrométrie De Masse Ciblée
Candidats biomarqueurs protéiques de protéomique de découverte doivent être vérifiées quantitativement dans des échantillons de patients avant qu'ils peuvent évoluer vers la validation clinique. Nous démontrons que l'enrichissement de peptide d'immunoaffinité assorti de dilution isotopique, spectrométrie de masse (SISCAPA-MRM) peut être utilisée pour configurer des essais de performance approprié pour vérification de biomarqueurs candidats. Comme preuve de principe, nous avons configuré des essais de SISCAPA de troponine I (cTnI), un biomarqueur établi une lésion cardiaque et interleukin 33 (IL-33), un marqueur immunologique et cardiovasculaire émergent pour les immunoessais robustes ne sont actuellement pas disponibles.
Quantification Des Biomarqueurs Cardiovasculaires Dans Le Plasma De Patient Par Spectrométrie De Masse Ciblée Et Dilution D'un Isotope Stable
Vérification de biomarqueurs candidats exige des tests spécifiques pour sélectivement détecter et quantifier les protéines cibles dans des sujets accessibles. L'objectif principal de la vérification est de biomarqueurs potentiels écran pour s'assurer que seuls les candidats de plus hautes qualité de la phase de découverte on tient avant validation préclinique. Puisqu'il existe souvent des réactifs d'anticorps pour un immunodosage de grade clinique pour un petit nombre de candidats, les méthodes alternatives sont tenus de credential candidats nouveaux et non prouvées dans un nombre statistiquement viable d'échantillons de sérum ou de plasma. En utilisant de multiples de surveillance couplé avec la dilution d'un isotope stable MS, nous avons développé des dosages quantitatifs, multiplexés dans le plasma pour six protéines de pertinence clinique de lésion cardiaque. Le processus décrit ne nécessite pas d'anticorps pour l'enrichissement d'immuno-affinité des protéines ou de peptides. Limites de détection et de quantification pour chaque peptide de signature utilisé comme substituts pour les protéines cibles ont été déterminées par la méthode des ajouts dosés à l'aide de peptides synthétiques et le plasma d'un donneur sain. Limites de quantification varie entre 2 et 15 ng/ml pour la plupart des protéines cibles. Des mesures quantitatives ont été obtenues pour un ou deux signature peptides dérivés de chaque protéine cible, y compris les marqueurs protéiques de faible abondance de lésion cardiaque dans la gamme de nanogramme/millilitre comme les troponines cardiaques. Les coefficients de variation intra - et interassay ont été principalement < 10 à 25 %, respectivement. L'essai multiplex configurée a été ensuite utilisé pour mesurer les niveaux de ces protéines à travers trois points dans le temps en six patients subissant une ablation septale d'alcool pour une cardiomyopathie hypertrophique obstructive. Ces résultats sont la première démonstration d'un test multiplexé, axée sur les MS pour la détection et la quantification des changements dans la concentration de protéines associées à une lésion cardiaque dans la plage basse nanogramme/millilitre. Nos résultats démontrent également que ces tests de conservent la précision nécessaire, la reproductibilité et sensibilité à appliquer au roman et de biomarqueurs candidats indéterminé pour la vérification des protéines dans le sang.
Agressif Et Dangereux Au Volant Chez Les Vétérans Mâles Recevant Un Traitement Résidentiel Pour PTSD
Conduite agressive et dangereuse a été examinée chez 474 vétérans mâles recevant un traitement résidentiel de combattants pour stress post-traumatique (ESPT). Plus précisément, les auteurs ont évalué si PTSD a été associée à la conduite agressive et dangereuse, et si les vétérans d'Irak et Afghanistan guerre étaient à risque plus élevé que d'autres vétérans de la guerre. Environ les deux tiers de l'échantillon rapporté à vie de conduite agressive et un tiers déclarés actuelle conduite agressive. Gravité du trouble de stress post-traumatique a été associée à la conduite agressive, mais pas d'autres formes de conduite dangereuse. Vétérans d'Irak et d'Afghanistan a approuvé des taux plus élevés d'et plus fréquentes agressifs au volant que fait autres anciens combattants. Compte tenu de la gravité de PTSD, âge, revenu et l'état matrimonial est un vétéran de l'Irak et Afghanistan guerre prédit fréquence de conduite agressive et utilisation peu fréquente de ceinture de sécurité.
Evaluation De Développement à Grande échelle Quantitative Assay Protéomique Utilisant La Spectrométrie De Masse Peptide D'affinité à Base De
Normes des isotopes stables et la capture par des anticorps antipeptides (SISCAPA) d'enrichissement d'affinité couples de peptides avec la dilution des isotopes stables et la détection par spectrométrie de masse de réaction multiples surveillance pour fournir une mesure quantitative de peptides en tant que substituts pour leurs protéines respectives. Dans ce rapport, nous décrivons une étude de faisabilité afin de déterminer le taux de réussite pour la production d'anticorps appropriés pour les dosages SISCAPA afin d'informer les stratégies de développement test à grande échelle. Un flux de travail a été conçu comprenant une stratégie d'immunisation multiplexage dans lequel jusqu'à cinq peptides protéotypiques d'une cible unique protéine ont été utilisés pour immuniser des lapins individuels. Un total de 403 protéotypiques peptides tryptiques représentant 89 cibles protéiques ont été utilisés comme immunogènes. Les titres d'anticorps ont été antipeptide mesurée par ELISA et 220 anticorps antipeptides représentant 89 protéines ont été choisis pour la purification par affinité. Ces anticorps ont été caractérisés à l'égard de leur performance dans SISCAPA-multiples tests de contrôle de la réaction en utilisant la trypsine-plasma humain digéré la matrice. Plus de la moitié des dosages générés sont capables de détecter le peptide cible à des concentrations inférieures à 0,5 fmol / pi dans le plasma humain, qui correspond à la concentration de protéines de moins de 100 ng / ml. La stratégie de multiplexage cinq immunogènes peptidiques a réussi à générer un test de travail pour 100% des protéines ciblées dans cette étude d'évaluation. Ces résultats indiquent qu'il est possible pour un seul laboratoire à développer des centaines de tests par an et permettre la planification de rapport coût-efficacité des tests de génération SISCAPA.
Inter-laboratoires D'évaluation De La Automatisé, Multiplexée Enrichissement Immunoaffinité Peptide Couplée à La Spectrométrie De Masse De Réaction Multiple De Surveillance Pour Les Protéines Dans Le Plasma Quantification
L'incapacité de quantifier un grand nombre de protéines dans les tissus et biofluides avec une grande précision, la sensibilité et le débit est un obstacle majeur dans les études de biomarqueurs. Nous avons déjà démontré que le couplage d'enrichissement d'immunoaffinité utilisant des anticorps anti-peptide (SISCAPA) pour MRM-MS produit immuno-essais de GRM qui peuvent être multiplexés pour quantifier les protéines dans le plasma avec une grande sensibilité, la spécificité et de précision. Nous rapportons ici la première évaluation systématique de la performance inter-laboratoires des multiplex (8-plex) immuno-MRM-MS dans trois laboratoires indépendants. Une étude mise en scène a été réalisée dans lequel l'effet de chaque traitement et l'analyse étape sur le dosage CV, LOD, LOQ et la récupération a été évaluée. Les limites de détection étaient égaux ou inférieurs à 1 ng / mL pour les protéines dosées dans 30 uL de plasma. Reproductibilité du test était acceptable pour les études de vérification, avec une médiane CV intra-et inter-laboratoire-dessus de la limite de quantification de 11% et <14%, respectivement, pour le processus de dosage immuno-MRM-MS entier, y compris la digestion enzymatique du plasma. Digestion par la trypsine et sa manipulation de l'échantillon requise contribué la variabilité test le plus à la récupération et réduit de peptides cibles à partir de protéines digérées. En utilisant une protéine isotopes stables étiquetés comme une norme interne au lieu de peptides isotopes stables étiquetés pour tenir compte des pertes dans le processus de digestion a presque doublé la précision de dosage de ce tout en améliorant la précision du dosage de 5%. Nos résultats démontrent que multiplexée immuno-MRM-MS peut être fait reproductible dans des laboratoires indépendants et a le potentiel pour être largement adoptées pour le dosage de protéines dans des matrices aussi complexe que le plasma.
