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Articles by Eric Kuhn in JoVE
JoVE General
Quantificazione delle proteine Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, 3Broad Institute of MIT and Harvard, 4Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 5Plasma Proteome Institute
Standard di isotopi stabili e cattura da anticorpi anti-peptide (SISCAPA) affinità arricchimento coppie di peptidi con diluizione degli isotopi stabili e spettrometria di massa (MRM-MS) per fornire la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. Qui descriviamo il protocollo utilizzando particelle magnetiche in un formato parzialmente automatizzato.
Other articles by Eric Kuhn on PubMed
Disturbo Da Stress Post-traumatico E Funzionamento Psicosociale All'interno Di Due Campioni Di Sopravvissuti MVA
Per esaminare le variabili criterio F di PTSD, il funzionamento psicosociale dei due campioni di veicolo a motore è stato studiato sopravvissuti incidente (MVA). All'interno di ciascun campione, i confronti tra i sopravvissuti MVA con e senza PTSD sono state condotte su quattro indici di funzionamento psicosociali in tre punti temporali. Inoltre, sono state esaminate le relazioni tra cluster di sintomo specifico PTSD e indici di funzionamento psicosociali. Lo studio ha rivelato che, in generale, i sopravvissuti MVA con PTSD evidenziato funzionamento psicosociale più povere di fatto sopravvissuti senza PTSD. I sintomi emotivi paralizzante del PTSD è emerso come i predittori più coerenti degli indici di funzionamento psicosociali. Vengono discusse le implicazioni di queste scoperte per il trattamento completo di PTSD.
Di "crash" E "incidenti", Un Commento Su Stewart E Signore
A. E. Stewart e J. H. Lord (2002) chiamare per abbandonare l'incidente automobilistico di termine e sostituendo il crash di veicolo a motore per motivi di cura paziente e definizione. Siamo in disaccordo su definizionali motivi e a causa della mancanza di dati empirici da sopravvissuti incidente per sostenere le loro contese.
Studi Della Traumatizzazione Vicaria Di Studenti Universitari Per L'11 Settembre Gli Attacchi: Effetti Di Prossimità, Di Esposizione E Di Connessione
Da metà ottobre 2001 fino alla fine del novembre 2001, abbiamo raccolto abbastanza grandi insiemi dei questionari da studenti di tre università pubbliche (Albany, NY, n = 507, Augusta, GA, n = 336, Fargo, ND, n = 526) per valutare il tasso di disturbo da stress acuto (ASD) e livello di sintomi ASD segue gli attacchi dell'11 settembre, il tasso di corrente traumatico da stress (PTSD) e livello dei sintomi del PTSD, e attacchi del livello attuale di sintomi depressivi conseguenti dell'11 settembre. Abbiamo anche raccolto informazioni su esposizione alla copertura mediatica degli attacchi, connessione per il World Trade Center (WTC) e personale c'e il grado di coinvolgimento in atti riparativo come dà sangue, frequentando veglie. Abbiamo trovato livelli elevati di ASD, ASD sintomi di PTSD e i sintomi del PTSD in funzione della prossimità geografica a New York City (e all'interno del sito di Albany, vicinanza delle case degli studenti) e di genere. Esposizione (ore di TV guardato) era un predittore in alcuni casi come connessione alle vittime WTC. I sintomi ASD sono stati il più forte predittore di successivi sintomi di PTSD. Modelli di percorso rappresentavano oltre il 60% della varianza nei sintomi del PTSD.
Due Studi Di Morbilità Psichiatrica Tra Autoveicolo Sopravvissuti Incidente 1 Anno Dopo L'incidente
Abbiamo valutato la comorbilità psichiatrica associata cronica traumatico da stress (PTSD) (1-2 anni) secondaria ad incidenti automobilistici di lesioni personali (MVAs) in due studi. In studio 1, abbiamo confrontato i risultati delle valutazioni di SCID per 75 trattamento-cerco MVA sopravvissuti (51 con PTSD) e 24 con sintomi ma senza PTSD. In studio 2, abbiamo confrontato i risultati simili tra 132 superstiti MVA, che erano stati seguiti prospetticamente per 12++ mesi dopo loro incidenti (19 con PTSD, 32 che aveva PTSD, ma che aveva rimesso e 81 che mai ha incontrato i criteri per PTSD). Abbiamo trovato livelli comparabili di depressione maggiore co-morbidità corrente (53%), qualsiasi disturbo dell'umore (62-68%), disturbo d'ansia (26%) generalizzato e qualsiasi ansia disturbo (42%) per entrambi i gruppi di partecipanti con PTSD cronico. Questi tassi di comorbilità erano superiori a quelli trovati in gruppi non-PTSD confronto con simili storie MVA.
Quantificazione Della Proteina C - Reattiva Nel Siero Dei Pazienti Con Artrite Reumatoide Mediante Monitoraggio 13 Del Peptide C-etichetta Standard E Spettrometria Di Massa Multipla Di Reazione
Un metodo generale per la quantificazione delle proteine nel siero umano è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa (MS) e peptidi sintetici marcato con isotopo stabili come standard interno. Utilizzando questo approccio, proteina C - reattiva (CRP), un marcatore diagnostico di artrite reumatoide (RA), è stata rilevata in campioni di siero prelevati da pazienti con RA o erosiva o nonerosive e rispetto ai soggetti sani. Piccoli volumi di campioni di siero sono stati arricchiti per basso-abbondanza proteine attraverso l'asportazione selettiva di siero albumina umana (HSA), immunoglobulina G (IgG) e aptoglobina. Dopo deplezione delle proteine abbondanti, la complessità della miscela proteica è stato ulteriormente semplificata mediante cromatografia di esclusione di formato (SEC) di frazionare le proteine denaturate in intervalli discreti peso molecolare. Le frazioni di interesse contenenti CRP, m = 25 000, sono state messe in comune, digerito con tripsina, e quindi quantitativi fissi dei peptidi sintetici sono stati aggiunti alla miscela. La miscela di peptidi triptico è stato successivamente analizzata da nanoflow chromatography-tandem MS (nanoLC-MS/MS) mediante monitoraggio multiplo-reazione (MRM) su un triplo quadrupolo mass spectrometer (TQ-MS). Il rapporto degli ioni di transizione deriva i peptidi endogeni e marcato con isotopo forniti una misura quantitativa della CRP in campioni originali come valutato da indipendente misurazione della CRP in campioni pazienti stessi utilizzando un dosaggio immunoenzimatico. L'uso di peptidi sintetici marcato con isotopo e MRM è un potente metodo analitico per il prescreening dei biomarcatori proteina candidato nel siero umano prima dell'anticorpo e immunodosaggio sviluppo.
Seguito Potenziali Di Uno E Due Anni Di Terapia Cognitivo-comportamentale O Psicoterapia Di Supporto
Abbiamo seguito fino oltre il 90% di 57 superstiti di incidente automobilistico, che hanno completato un confronto controllato della terapia cognitivo-comportamentale (CBT) alla psicoterapia di sostegno (supporto). Risultati di un anno ha mostrato un significativo vantaggio continuato su diagnosi categoriale (PTSD o non) e strutturato intervista misure (CAPS) per CBT sopra il supporto. Altre misure che in genere hanno mostrati gli stessi risultati. A due anni, siamo stati in grado di follow-up solo il 75% di un anno completers. Anche se ci ha continuato ad essere differenze aritmetiche favorendo CBT su supporto, con questi attenuato differenze solo campioni sul gol di PTSD Checklist and Impact of Event Scale e nella diagnosi categoriche nel complesso sono stati significativo. C'è stato molto modesto miglioramento dalla fine del trattamento per i due anni di follow-up.
Uso Della Spettrometria Di Massa Per Identificare Proteine Biomarcatori Della Gravità Della Malattia Nel Liquido Sinoviale E Siero Dei Pazienti Con Artrite Reumatoide
Per identificare un pannello di proteine candidato biomarcatori dell'artrite reumatoide (RA) che possono predire quali pazienti svilupperanno malattia erosiva, invalidante.
Una Reazione Di Accoppiamento Di Fluorescenza-based Per Il Monitoraggio Dell'attività Della Sintetasi Di NAD Umana Ricombinante
Sintetasi di NAD è responsabile per la conversione di acido nicotinico adenina dinucleotide nicotinammide adenina dinucleotide. Questa reazione fornisce un percorso biosintetico del coenzima e, quindi, una fonte di equivalenti riducenti cellulare. Alterazioni del potenziale riduttivo ossidativo della cellula sono stati implicati come un fattore che contribuisce in molti Stati di malattia. Così, questo enzima rappresenta una nuova classe di potenziali bersagli di droga e, quindi, nostri sforzi erano incentrati sulla sviluppando un robusto dosaggio per l'utilizzo in uno schermo ad alto rendimento. Verso quel fine, descriviamo un formato di dosaggio enzimatico accoppiato per la misurazione della sintetasi di NAD umana ricombinante mediante l'impiego di lattato deidrogenasi in una reazione di amplificazione/ciclismo collegati in definitiva per la generazione di fluorescenza di resorufin da resazurina via diaphorase. Vi presentiamo la cinetica della reazione della sintetasi NAD nel dosaggio accoppiato formato, condizioni di ottimizzazione e inibizione della reazione di gossipolo [1,1',6,6',7,7'-hexahydroxy-3,3'-dimethyl-5,5'-bis(1-methylethyl)-[2, 2'-binaphthalene] -8, 8'-dicarboxaldehyde] e illustrare la robustezza del dosaggio dimostrando statistiche di uniformità piastra microtiter 384 pozzetti. Collettivamente, i nostri risultati mostrano che il metodo di dosaggio è robusto e adatto per questa classe di enzimi coinvolti nel percorso biosintetico NAD +.
Lo Stress Post-traumatico E Sintomi Depressivi in Una Popolazione Di College, Un Anno Dopo Gli Attentati Dell'11 Settembre: L'effetto Di Prossimità
Facendo seguito alla nostra precedente relazione [Behav. Res. Ther., in stampa] al livello di frequenza di diagnosi di probabile traumatico da stress (PTSD) tra gli studenti universitari di tre università pubbliche (Albany, NY, Augusta, GA e Fargo, ND) derivanti dall'11 settembre 2001, i sintomi depressivi e sintomi di stress post-traumatico (SPP). Attacchi terroristici, abbiamo esaminato paragonabile gruppi di studenti (totale, n = 1313) da queste tre istituzioni nelle settimane seguenti il primo anniversario (2002) degli attacchi. Abbiamo trovato effetti di prossimità (Albany superiore di Augusta, che era superiore a Fargo) per spp e sintomi depressivi, ma non per la frequenza di diagnosi di PTSD probabile. All'interno i dati del sito di Albany, prossimità della contea di residenza a New York City (NYC) inoltre ha mostrato un effetto di prossimità su spp. Anche se i sintomi depressivi erano significativamente differenti nel 2002 contro 2001, le differenze aritmetiche in spp o nella frequenza di diagnosi di PTSD probabile non erano significative. Gli attacchi dell'11 settembre ha continuato ad esercitare un pedaggio psichico su studenti universitari anche un anno più tardi.
Frequenza Cardiaca Di Sopravvissuti Incidente Veicolo a Motore Nel Reparto Di Emergenza, Peritraumatic Reazioni Psicologiche, ASD E PTSD Gravità: Uno Studio Prospettico Di 6 Mesi
Questo studio su piccola scala indaga le relazioni tra la frequenza cardiaca di sopravvissuti incidente automobilistico presentando nel reparto di emergenza (ED) e disturbo da stress acuto (ASD) e severità di sintomo di stress post-traumatico (PTSD). Esamina inoltre le relazioni tra frequenza cardiaca di reversibilità nel ED e dissociazione di peritraumatic e peritraumatic posttrauma di angoscia segnalati 2 settimane. Cinquanta sopravvissuti incidente (MVA) di veicolo a motore sono state valutate 2 settimane, 1 (N = 42), 3 (N = 37) e 6 mesi (N = 37) post-MVA. La frequenza cardiaca ed il predetto segnalati spontaneamente ASD sintomo gravità e severità di sintomo PTSD voto clinico a 6 mesi, ma non a 1 o 3 mesi. Frequenza cardiaca superstiti nel ED era significativamente correlato con dissociazione peritraumatic ma non peritraumatic afflizione. Questi risultati supportano il ruolo dell'elevato tasso di cuore ED come predittore di ASD e di severità di sintomo PTSD cronico e possono aiutare a chiarire i risultati discrepanti della ricerca precedente.
Analisi Quantitative, Multiplexate Per Proteine Bassa Abbondanza Nel Plasma Di Spettrometria Di Massa Mirata E Diluizione Dell'isotopo Stabile
Scoperta del biomarker produce liste di marcatori candidati cui presenza e il livello devono essere verificati successivamente nel siero o nel plasma. Verifica rappresenta un cambiamento di paradigma dalla scoperta imparziale approcci ai metodi mirati, basati su ipotesi e si basa su saggi specifici, quantitative ottimizzate per la rilevazione selettiva delle proteine bersaglio. Molte proteine biomarcatori clinico valuta presentano a o sotto la gamma nanogrammi/millilitro nel plasma e sono stati inaccessibili a data dai metodi basati su MS. Utilizzando più reazione monitoraggio accoppiato con spettrometria totale diluizione isotopo stabile, descriviamo qui lo sviluppo di tipo quantitativo, multiplexed saggi per sei proteine nel plasma che raggiungere i limiti di quantificazione nel range 1-10 ng/ml con percentuali coefficienti di variazione dal 3 al 15% senza arricchimento immunoaffinity di proteine o peptidi. Metodi di lavorazione con sufficiente velocità effettiva, recupero e riproducibilità per abilitare il rilevamento robusto e quantificazione di biomarker candidati proteine erano sviluppate e ottimizzate con aggiunta di proteine esogene al plasma immunoaffinity impoverito da un donatore sano del campione. Reazione più dosaggi di monitoraggio sono stati progettati e ottimizzati per i peptidi firma derivata da proteine prova quantitativa. Basato su curve di calibrazione utilizzando concentrazioni note di proteina a spillo nel plasma, abbiamo determinato che ogni proteina bersaglio aveva almeno un peptide firma con un limite di quantificazione nella gamma di 1-10 ng/ml e linearità in genere su 2 ordini di grandezza nel range di misura di interesse. Limiti di rilevamento erano frequentemente in gamma alta picogrammo/millilitro. Questi livelli di performance test rappresentano fino a un di miglioramento rispetto ai analisi diretta delle proteine nel plasma di MS e sono stati ottenuti dalla lavorazione di campione semplice, robusto che coinvolgono la deplezione di proteine abbondanti e frazionamento minimo mediante cromatografia a scambio cationico forte a livello di peptide prima reazione LC-multiplo di monitoraggio/MS. I metodi qui presentati forniscono una solida base per lo sviluppo di analisi quantitative MS-based di basse livello proteine nel sangue.
Una Valutazione Controllata Di Terapia Cognitiva Di Gruppo Nel Trattamento Della Sindrome Dell'intestino Irritabile
Abbiamo randomizzati, in due siti, 210 pazienti con Roma II diagnosticata la sindrome dell'intestino irritabile (IBS), almeno moderata gravità, ad una delle tre condizioni: terapia cognitiva basata su gruppo (CT; n = 120), gruppi di sostegno di graduare (n = 46) come un controllo attivo, o sintomo intensivo e lo stress quotidiano monitoraggio (n = 44). One hundred eighty - eight partecipanti ha completato il trattamento iniziale. Quelli sintomo di monitoraggio sono state poi attraversati a CT. Per l'intento di trattare l'analisi su una misura di sintomo GI composita derivata dal quotidiano diari del sintomo, sia CT e i gruppi di supporto graduare erano significativamente più migliorati rispetto a quelli del sintomo intensivo monitoraggio condizione, ma il CT e gruppo di sostegno di graduare non differiscono. Tra completers trattamento sulla stessa misura composita dei sintomi GI, ancora una volta, gruppi di sostegno sia CT e graduare erano statisticamente superiore a sintomo di monitoraggio ma non differiscono su composito sintomo o su qualsiasi altra misura. Sui singoli sintomi IBS, sia CT e graduare il supporto erano statisticamente superiore a sintomo di monitoraggio su riduzioni in tenerezza e dolore addominale e flatulenza. Paziente valutazioni globali alla fine del trattamento ha mostrato le due condizioni attive statisticamente superiore al sintomo di monitoraggio sul cambiamento nella regolarità intestinale, con CT superiore al sintomo di monitoraggio sulla riduzione in generale dolore e nel miglioramento del senso di benessere. Tre mesi follow-up dei dati su 175 pazienti ha rivelato la manutenzione di un miglioramento significativo o continuarono miglioramento significativo su tutti i sintomi IBS, compreso il questionario di dolore di McGill. Gruppo CT e graduare gruppi continuate a non differiscono su qualsiasi misura di sostegno. Concludiamo quindi che il gruppo CT non è superiore ad una condizione di controllo con placebo di attenzione.
Il Ruolo Dello Stress Nell'esacerbazione Di Sintomi Tra I Pazienti IBS
Oltre 200 cerca di trattamento pazienti (IBS) la sindrome dell'intestino irritabile completato 4 settimane di quotidiani misure potenziali di stress e sintomi gastrointestinali come pure retrospettive misure di stress (eventi oltre 12 mesi, fastidi oltre 1 mese di vita). Abbiamo anche ottenuto le misure dello stress su 66 controlli nonill. I pazienti di sindrome dell'intestino irritabile relazione fastidi più frequenti rispetto ai controlli e un impatto dello stress maggiore rispetto ai controlli. Utilizzando la modellazione di equazioni strutturali, abbiamo scoperto che i dati erano coerenti con un modello di autocorrelazione robusti effetti di entrambi indici a settimana gastrointestinali (GI) di sintomo (r =. 84) e indici di stress (r =. 73), così come forti effetti simultanei di stress sui sintomi IBS (r =. 90) e viceversa (r =. 41). I dati sono stati anche coerenti con un modello dove c'erano gli effetti dello stress in settimana t su sintomi GI in settimana t + 1 e t + 2, ma essi erano mediate attraverso effetti settimana simultanee e/o effetti di autocorrelazione. Ci sono stati non statisticamente significativi percorsi indipendenti dallo stress in settimana t ai sintomi GI in settimana t + 1 o t + 2. Così, non c'è più il supporto per una reciproca relazione tra stress e sintomi che c'è, per una relazione causale.
Abuso Di Sostanze-mortalità Tra I Pazienti Psichiatrici Del Maschi VA Mezza Età
Questo studio valutato mortalità e cause di morte in un periodo di sette anni tra i pazienti psichiatrici maschi mezza età con e senza sostanza coesistenti utilizzano disturbo.
Sviluppare Multiplexed Dosaggi Per La Troponina I E Interleukin-33 Nel Plasma Di Peptide Immunoaffinity Arricchimento E Spettrometria Di Massa Mirata
Candidati biomarcatore della proteina da scoperta proteomics devono essere verificati quantitativamente in campioni di pazienti prima che essi possono progredire a validazione clinica. Qui dimostriamo che arricchimento immunoaffinity peptide accoppiato con diluizione isotopo stabile, spettrometria di massa (SISCAPA-MRM) può essere utilizzata per configurare i dosaggi con prestazioni adatta per la verifica di biomarker candidati. Come prova di principio, abbiamo configurato le analisi SISCAPA per la troponina I (n), un biomarcatore stabilito di lesioni cardiache e interleuchina 33 (IL-33), un marcatore emergente immunologico e cardiovascolare per cui immunodosaggi robusti attualmente non sono disponibili.
Quantificazione Dei Biomarcatori Cardiovascolari Nel Paziente Plasma Di Spettrometria Di Massa Mirata E Diluizione Isotopo Stabile
Verifica dei biomarcatori candidato richiede test specifici per rilevare e quantificare proteine bersaglio in accessibile ha selettivamente. L'obiettivo primario della verifica è di potenziali biomarcatori dello schermo per garantire che solo i candidati più alti qualità dalla fase di scoperta sono presi avanti in validazione preclinica. Perché reagenti dell'anticorpo per un dosaggio immunoenzimatico grado clinico spesso esistano per un piccolo numero di candidati, metodologie alternative sono tenuti a nuovi e non provati i candidati in un numero statisticamente valido di campioni di siero o plasma di credenziali. Utilizzando più reazione monitoraggio accoppiato con diluizione isotopica stabile MS, abbiamo sviluppato analisi quantitative, multiplexate nel plasma per sei proteine di rilevanza clinica a lesioni cardiache. Il processo descritto non richiede gli anticorpi per l'arricchimento di immunoaffinity di proteine o peptidi. Limiti di rilevamento e di quantificazione per ogni peptide di firma utilizzato come sostituti per le proteine bersaglio sono stati determinati con il metodo dell'aggiunta standard usando peptidi sintetici e al plasma da donatore sano. Limiti di rivelabilità variava da 2 a 15 ng/ml per la maggior parte delle proteine bersaglio. Le misure quantitative sono state ottenute per uno o due firma peptidi derivati da ogni proteina bersaglio, tra cui marcatori proteina bassa abbondanza di lesioni cardiache nella gamma come il cardiac troponins nanogrammi/millilitro. Intra - e interassay coefficienti di variazione sono stati prevalentemente < 10 e 25%, rispettivamente. Il test multiplex configurato fu usato per misurare i livelli di queste proteine attraverso tre punti di tempo in sei pazienti sottoposti ad ablazione del setto di alcool per la cardiomiopatia ipertrofica ostruttiva. Questi risultati sono la prima dimostrazione di un multiplex, basata su MS-saggio per il rilevamento e la quantificazione delle variazioni nella concentrazione di proteine associate con lesioni cardiache nella gamma bassa nanogrammi/millilitro. Anche i nostri risultati dimostrano che questi dosaggi mantengono la necessaria precisione, la riproducibilità e la sensibilità da applicare al romanzo e biomarcatori candidato atipici per la verifica delle proteine nel sangue.
Aggressivo E Pericoloso Guidare in Veterani Maschi Ricevono Un Trattamento Residenziale Per PTSD
Guida aggressivo e pericoloso è stata esaminata nel 474 veterani maschi ricevono un trattamento residenziale Veterans Affairs per traumatico da stress (PTSD). In particolare, gli autori hanno valutati se il PTSD era associato a guida aggressivo e pericoloso e se veterani di Iraq e Afghanistan guerra erano a rischio più elevato di altri veterani di guerra. Circa due terzi del campione riferito durata di guida aggressivo e un terzo segnalati attuale guida non aggressivo. Gravità del disturbo da stress post-traumatico è stato associato con guida non aggressivo, ma non altre forme di guida pericolose. Veterani di Iraq e Afghanistan approvato tassi più alti di e più frequenti di guida più aggressivo ha altri veterani. Dopo la contabilizzazione per gravità di PTSD, età, reddito e stato civile essendo un veterano della guerra di Afghanistan e Iraq predetto frequenza guida aggressiva e uso infrequente seatbelt.
Valutazione Dello Sviluppo Di Analisi Proteomic Quantitativa Su Larga Scala Utilizzando La Spettrometria Di Massa Basata Su Affinità Del Peptide
Stabile agli standard dell'isotopo e catturare dall'arricchimento di affinità coppie anticorpi antipeptide (SISCAPA) di peptidi con diluizione isotopica stabile e rilevamento di reazione più monitoraggio spettrometria di massa per fornire una misura quantitativa di peptidi come surrogati per loro rispettive proteine. In questo rapporto, descriviamo un studio di fattibilità per determinare il tasso di successo per la produzione di anticorpi adatti per SISCAPA dosaggi al fine di informare le strategie per lo sviluppo di test su larga scala. Un flusso di lavoro è stato progettato che comprendeva una strategia di immunizzazione multiplex in cui fino a cinque proteotypic peptidi da un singola proteina bersaglio sono stati utilizzati per immunizzare i conigli individuali. Un totale di 403 proteotypic triptico peptidi che rappresenta 89 destinazioni della proteina sono stati utilizzati come immunogeni. Antipeptide anticorpali sono stati misurati con ELISA e 220 anticorpi antipeptide che rappresentano le 89 proteine sono stati scelti per la purificazione di affinità. Questi anticorpi sono stati caratterizzati rispetto alla loro performance nella reazione SISCAPA-multiplo monitoraggio analisi utilizzando la matrice di plasma umano digerite tripsina. Più della metà dei saggi generati sono stati in grado di rilevare il peptide di destinazione in concentrazioni inferiori a 0,5 fmol/μl a nel plasma umano, corrispondente a concentrazioni di proteina di meno di 100 ng/ml. La strategia di multiplazione cinque peptide immunogeni riusciva a generare un dosaggio di lavoro per il 100% delle proteine mirati in questo studio di valutazione. Questi risultati indicano che è fattibile per un unico laboratorio sviluppare centinaia di analisi all'anno e consentire la pianificazione per la generazione di conveniente SISCAPA dosaggi.
Valutazione Interlaboratorio Di Automatizzato, Multiplexed Arricchimento Immunoaffinity Peptide Accoppiato Alla Reazione Più Monitoraggio Spettrometria Di Massa Per Quantificare Le Proteine Nel Plasma
L'impossibilità di quantificare un gran numero di proteine nei tessuti e ha con alta precisione, la sensibilità e la velocità effettiva è un collo di bottiglia importante negli studi di biomarker. Abbiamo precedentemente dimostrato che giunto arricchimento immunoaffinity usando gli anticorpi anti-peptide (SISCAPA) a MRM-MS produce saggi immuno-MRM che possono essere multiplexati per quantificare le proteine nel plasma con alta sensibilità, specificità e precisione. Riportiamo che la prima valutazione sistematica delle prestazioni interlaboratorio multiplexed (8-plex) immuno-MRM-MS in tre laboratori indipendenti. È stato condotto uno studio in scena in cui è stato valutato l'effetto di ogni fase di elaborazione e analisi su analisi CV, LOD e LOQ recupero. Limiti di rilevamento sono stati pari o inferiore a 1 ng/mL per le proteine dosate in 30 uL di plasma. Riproducibilità del test è stato accettabile per verifica studi, con mediana intra - e inter - laboratorio CVs sopra il LOQ del 11% e < 14%, rispettivamente, per il processo intero saggio immuno-MRM-MS, compresa la digestione enzimatica del plasma. Digestione della tripsina e la sua gestione campione necessarie più per analisi di variabilità contribuito e ridotto il recupero dei peptidi di destinazione da proteine digerite. Utilizzando un isotopo stabile etichettato proteine come standard interno invece di un isotopo stabile etichettato peptidi per tenere conto delle perdite nel processo di digestione quasi raddoppiato il dosaggio precisione per questo migliorando la precisione di dosaggio 5%. I nostri risultati dimostrano che multiplex immuno-MRM-MS possono essere resi riproducibili attraverso laboratori indipendenti e ha il potenziale per essere adottato ampiamente per dosaggio proteine in matrici complesse come plasma.
