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Articles by Erik Hill in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Création d'Epstein-Barr Virus croissance transformées lignées lymphoblastoïdes
1Stony Brook Children's Hospital, State University of New York at Stony Brook, 2Department of Pediatrics, State University of New York at Stony Brook, 3Department of Molecular Genetics, State University of New York at Stony Brook, 4Department of Microbiology, State University of New York at Stony Brook
Nous décrivons une méthode pour générer des lignes cellulaires transformées B à l'aide d'Epstein-Barr virus. Nous avons également illustrer un nouveau test qui permet d'identifier les cellules B destiné à subir une transformation aussi tôt que trois jours après l'infection.
Other articles by Erik Hill on PubMed
Récompense De La Cocaïne Abolie Chez Les Souris Avec Un Transporteur De La Dopamine De La Cocaïne-insensible
Il ya trois connus de haute affinité des cibles pour la cocaïne: le transporteur de la dopamine (DAT), le transporteur de la sérotonine (SERT), et le transporteur de la noradrénaline (NET). Des décennies d'études en charge de la dopamine (DA) l'hypothèse que le blocus de la DAT et l'augmentation subséquente de DA extracellulaire principalement médiation récompense de la cocaïne et de renforcement. Contrairement aux attentes, DAT knock-out (DAT-KO) chez la souris et le SERT ou souris knockout NET encore l'auto-administrer de la cocaïne et / ou afficher préférence de place conditionnée (RPC) à la cocaïne, ce qui a conduit à la réévaluation de l'hypothèse DA et la proposition de la redondance circuits de récompense. Pour étudier le rôle des DAT en récompense de la cocaïne, nous avons généré une lignée de souris knockin portant un DAT fonctionnelle qui est insensible à la cocaïne. Chez ces souris, la cocaïne supprimé l'activité locomotrice, ne pas élever DA extracellulaire dans le noyau accumbens, et ne produisent pas de récompense, telle que mesurée par le RPC. Ce résultat suggère que le blocage de DAT est nécessaire pour la récompense de la cocaïne chez la souris avec un DAT fonctionnelle. Ce modèle de souris est unique en ce qu'il est spécifiquement conçu pour différencier le rôle de la DAT à partir des rôles de NET et SERT en induite par la cocaïne effets biochimiques et comportementaux.
Preuve Directe Que Deux Cystéines En Transporteur De La Dopamine Forment Un Pont Disulfure
Nous avons généré un mutant de transporteur (DAT) de dopamine entièrement fonctionnel (dmDATx7) avec tous les cystéines supprimés sauf les deux cystéines en boucle extracellulaire 2 (EL2). Mutagenèse aléatoire à un ou les deux cystéines de EL2 ne produire pas de n'importe quel mutants transporteur fonctionnelle, ce qui suggère que les deux cystéines ne peuvent être remplacés par n'importe quel autres acides aminés. Le réactif de cystéine spécifique MTSEA-biotine étiqueté dmDATx7 qu'après un traitement de TNT, ce qui réduit la liaison disulfure. Puisqu'il n'y a aucune autres cystéines dans dmDATx7, l'étiquetage des MTSEA-biotine doit être sur du EL2 cystéines mis à disposition par le traitement de la TNT. Ce résultat fournit la première preuve directe que les cystéines EL2 forment un pont disulfure. Fait intéressant, le traitement de la TNT avait peu d'effet sur le transport activité ce qui suggère que la liaison disulfure n'est pas nécessaire pour la fonction de capture de DAT. Nos résultats et les résultats antérieurs sont compatibles avec la notion que la liaison disulfure entre les cystéines EL2 est nécessaire pour la biosynthèse DAT ou sa livraison à la surface des cellules.
Les Mutations Fonctionnelles En Transporteur De La Noradrénaline De Souris Réduisent La Sensibilité à L'inhibition De La Cocaïne
Les transporteurs de la dopamine, la noradrénaline et la sérotonine sont des cibles moléculaires de la cocaïne, amphétamines et thérapeutiques antidépresseurs. Les résidus impliqués dans la liaison de ces drogues sont inconnus. Nous avons effectué plusieurs séries de mutagénèse aléatoire et dirigée dans le transporteur de la noradrénaline de souris et projeté des mutants avec une sensibilité altérée à l'inhibition de la cocaïne de captation de substrat. Nous avons identifié une mutation triple qui conserve à proximité de la fonction de transport de type sauvage, mais affiche une 37-fold diminution de sensibilité de la cocaïne et 24-fold diminution de sensibilité de la désipramine. En revanche, sensibilités de mutant d'amphétamine, méthamphétamine ou le méthylphénidate sont légèrement modifiées. Nos données révèlent des résidus importants contribuant aux inhibitions puissant de l'absorption de ces médicaments importants. En outre, cet triple mutant résistant à la drogue peut être utilisé pour générer une ligne unique souris knock-in pour étudier le rôle du transporteur de la noradrénaline dans les effets provoquant une dépendance de la cocaïne et les effets thérapeutiques de la désipramine.
Puissances De Cocaïne Néfopam Sur Des Cibles Principales De Cocaïne Chez La Souris
Cocaïne néfopam (CM), un analogue de la cocaïne chargée, impossible de passer la barrière hémato-encéphalique. Il a été considéré que les effets systémiques cm représentent des actions de la cocaïne dans les tissus périphériques. Toutefois, les valeurs de l'IC (50) cm n'ont pas été clairement établis pour les cibles principales de cocaïne : les transporteurs de la dopamine, la noradrénaline et la sérotonine et les canaux sodiques. À l'aide de cellules transfectées avec les transporteurs individuels des souris et des synaptosomes de tissus striatum de souris, nous avons observé que les valeurs d'IC (50) inhibition d'absorption de monoamine de CM ont été 31-fold à 184-fold plus élevé par rapport à la cocaïne à chacun des transporteurs. Dans les neurones des ganglions de la racine dorsale, cocaïne inhibe les canaux sodiques avec une apparente IC (50) de 75 microM, tandis que CM a montré aucun effet observable à des concentrations pouvant atteindre 3 mM. Ces résultats indiquent qu'une dose égale de CM ne produira pas d'effet périphérique équivalent de cocaïne.
Interaction De La Tyrosine 151 En Transporteur De La Noradrénaline Avec Le Groupe 2β De Cocaïne Analogiques RTI-113
La cocaïne se lie et inhibe le transporteur de la dopamine (DAT), le transporteur de la noradrénaline (NET) et le transporteur de la sérotonine. Les résidus formant des sites de fixation de cocaïne sont inconnus. RTI-113, un analogue de la cocaïne, est plus puissant à inhiber DAT qu'inhibant NET 100 ×. Nous démontrons que retirer le groupement hydroxyle de résidus Tyr151 dans filet en le remplaçant par Phe, le résidu correspondant dans le DAT, augmente la sensibilité du NET à RTI-113, tandis que la mutation inverse en DAT diminué la sensibilité de DAT RTI-113. En revanche, RTI-31, un autre cocaïne analogique ayant la même structure que la RTI-113 mais avec le groupe phényle en position 2β remplacée par un groupement méthyle, inhibe les mutants du transporteur tout aussi bien qu'un groupe hydroxyle est présent au niveau du résidu ou non. Les données suggèrent que ce résidu contribue au site de liaison de cocaïne et se trouve à proximité de la position 2β des analogues de la cocaïne. Ces résultats sont compatibles avec notre modèle de liaison de cocaïne-DAT préalablement proposé où cocaïne lie au départ vers un site qui ne se chevauche pas avec, mais est proche de, le site de liaison de la dopamine. La modélisation informatique et amarrage moléculaire a produit un modèle de liaison qui explique les changements observés dans les dilutions de l'inhibition de RTI-113.
