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Articles by Erik Hill in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides
1Stony Brook Children's Hospital, State University of New York at Stony Brook, 2Department of Pediatrics, State University of New York at Stony Brook, 3Department of Molecular Genetics, State University of New York at Stony Brook, 4Department of Microbiology, State University of New York at Stony Brook
Se describe un método para generar líneas de células transformadas B con virus Epstein-Barr. También ilustra un ensayo de novela que pueda identificar a las células B destinada a sufrir una transformación tan pronto como tres días después de la infección.
Other articles by Erik Hill on PubMed
La Cocaína Abolido Recompensa En Ratones Con Un Transportador De Dopamina Cocaína Y Minúsculas
Hay tres conocidos de alta afinidad para los objetivos de la cocaína: el transportador de dopamina (DAT), el transportador de la serotonina (SERT), y el transportador de norepinefrina (NET). Décadas de estudios apoyan la dopamina (DA) hipótesis de que el bloqueo de DAT y el consiguiente aumento de DA extracelular, principalmente mediar recompensa de cocaína y el refuerzo. Contrariamente a lo esperado, por nocaut DAT (DAT-KO) ratones y SERT o ratones knock-out NET sigue autoadministrarse cocaína y / o mostrar preferencia de lugar condicionado (CPP) a la cocaína, lo que condujo a la reevaluación de la hipótesis del fiscal de distrito y la propuesta de los despedidos vías de recompensa. Para estudiar el papel de DAT en la recompensa de cocaína, hemos generado una línea de ratones knockin llevar a un DAT funcional que es insensible a la cocaína. En estos ratones, la cocaína suprime la actividad locomotora, no elevar la DA extracelular en el núcleo accumbens, y no produjo recompensa según lo medido por CPP. Este resultado sugiere que el bloqueo de DAT es necesario para la recompensa cocaína en ratones con un DAT funcional. Este modelo de ratón es único, ya que está específicamente diseñado para diferenciar el papel de la DAT de las funciones de red y Sert en el consumo de cocaína, efectos bioquímicos y de comportamiento.
Evidencia Directa Que Dos Cisteínas En El Transportador De Dopamina Forman Un Enlace Disulfuro
Hemos generado a un mutante del transportador (DAT) de dopamina completamente funcional (dmDATx7) con todos cisteínas quitados excepto los dos cisteínas en lazo extracelular 2 (EL2). Mutagénesis al azar en uno o ambos EL2 cisteínas no produjo a ningún mutantes transportador funcionales, sugiriendo que los dos cisteínas no pueden reemplazarse por otros aminoácidos. El reactivo específico de cisteína MTSEA-biotina marcados dmDATx7 sólo después de un tratamiento de TDT que reduce Enlace disulfuro. Puesto que no hay ningún otros cisteínas en dmDATx7, el etiquetado de MTSEA-biotina debe estar en las cisteínas EL2 puestos a disposición por el tratamiento de la TDT. Este resultado proporciona la primera evidencia directa que las cisteínas EL2 forman un enlace disulfuro. Curiosamente, el tratamiento de la TDT tuvo poco efecto sobre transporte actividad sugiriendo que el enlace de disulfuro no es necesario para la función de absorción de DAT. Nuestros resultados y los resultados son consistentes con la idea de que el enlace de disulfuro entre cisteínas EL2 es necesario para la biosíntesis DAT o su entrega a la superficie de la célula.
Las Mutaciones Funcionales En Transportador De Norepinefrina Ratón Reducen La Sensibilidad a La Inhibición De La Cocaína
Los transportadores de la dopamina, la noradrenalina y la serotonina son dianas moleculares de cocaína, anfetaminas y antidepresivos terapéuticos. Los residuos implicados en vinculante de estas drogas son desconocidos. Hemos realizado varias rondas de mutagénesis al azar y dirigida en el transportador de norepinefrina de ratón y defendido por mutantes con sensibilidad alterada a la inhibición de la cocaína de la absorción del sustrato. Hemos identificado una mutación triple que conserva cerca de función de transporte de tipo salvaje pero muestra una 37-fold disminución en la sensibilidad de cocaína y 24-fold disminución en la sensibilidad de la desipramina. En contraste, las sensibilidades de los mutantes anfetamina, metanfetamina y metilfenidato se cambian solamente levemente. Nuestros datos revelan residuos críticos contribuyendo a las inhibiciones de absorción potente por estos fármacos importantes. Además, este mutante triple resistente a los medicamento puede utilizarse para generar una línea única del ratón knock-in para estudiar el papel del transportador de norepinefrina en los efectos adictivos de la cocaína y los efectos terapéuticos de la desipramina.
Potencias De Cocaína Metiodida Objetivos Principales De La Cocaína En Ratones
Cocaína metiodida (CM), un análogo de la cargada de cocaína, no puede pasar la barrera hematoencefálica. Se ha asumido que los efectos sistémicos cm representan acciones de cocaína en los tejidos periféricos. Sin embargo, los valores IC(50) de CM no han sido claramente determinados por los objetivos principales de la cocaína: transportadores de la dopamina, norepinefrina y serotonina y los canales de sodio. Usando células transfectadas con transportistas individuales de ratones y sinaptosomas de tejidos de ratón estriado, observamos que los valores IC(50) de inhibición para la absorción de la monoamina cm fueron 31-fold a 184-fold superior en comparación con cocaína en cada uno de los transportadores. En las neuronas del ganglio de raíz dorsal, cocaína inhibe los canales de sodio con un aparente IC(50) de 75 microM, mientras CM no mostró ningún efecto observable a concentraciones de hasta 3 mM. Estos resultados indican que una dosis igual de CM no producirá un efecto equivalente periférico de cocaína.
Interacción De Tirosina 151 En Transportador De Norepinefrina Con El Grupo 2β De Cocaína Analógico RTI-113
Cocaína se une e inhibe el transportador de dopamina (DAT), transportador de norepinefrina (NET) y transportador de serotonina. Se desconocen los residuos formando sitios de unión de cocaína. RTI-113, un análogo de la cocaína, es más potente en la inhibición de DAT que inhibir NET 100 ×. Aquí mostramos que eliminar el grupo hidroxilo de residuos Tyr151 en red mediante su sustitución con Phe, el residuo correspondiente en DAT, aumentó la sensibilidad de la red para RTI-113, mientras que la mutación reversa en DAT disminuye la sensibilidad de DAT a RTI-113. En cambio, RTI-31, cocaína otro análogo que tiene la misma estructura que RTI-113, pero con el grupo fenilo en la posición de 2β substituida por un grupo metilo, inhibe a los mutantes de transportador igualmente bien si un grupo hidroxilo está presente en los residuos o no. Los datos sugieren que este residuo contribuye al sitio de unión de cocaína y está cerca de la posición de 2β de análogos de cocaína. Estos resultados son consistentes con nuestro modelo de enlace de cocaína previamente propuesto-DAT donde cocaína une inicialmente a un sitio que no se superpone con, pero está cerca, el sitio de unión a dopamina. Modelado computacional y acoplamiento molecular rindieron un modelo de enlace que explica los cambios observados en potencias de inhibición de RTI-113.
