Translate this page to:
Chinese
In JoVE (1)
Other Publications (10)
- The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience
- Nature Neuroscience
- The Journal of Cell Biology
- Nature Methods
- The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience
- The Journal of Clinical Investigation
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Journal of Neurochemistry
- Neuron
- Science (New York, N.Y.)
Automatic Translation
This translation into Chinese was automatically generated.
English Version | Other Languages
Articles by Eugene V. Mosharov in JoVE
JoVE General
多巴胺的释放突触前货箱码头在个别的可视化与FFNs
1Departments of Neurology, Columbia University, 2Departments of Psychiatry and Pharmacology, Columbia University, 3Department of Chemistry, Columbia University, 4eMolecules, Inc., 5Departments of Neurology and Physiology, University of California School of Medicine, San Francisco, 6Division of Molecular Therapeutics, New York Psychiatric Institute
一种新的手段使用荧光多巴胺类似物的光学测量神经递质。
Other articles by Eugene V. Mosharov on PubMed
胞内修补电化学: 嗜铬细胞游离儿茶酚胺的调节。
改建中的游离池直接影响神经递质的合成和释放和建议中各种神经退行性疾病的关键因素。虽然此游离池是新陈代谢最活跃，它是袖珍型的相比的水泡变送器量和从来没有量化分开。在这里，我们介绍胞内修补电化学 (IPE)，一种技术，首次提供了单一的哺乳动物细胞胞浆可氧化态分子的直接测量。在安培模式中，公众环境研究中心检测总 catechols，而在循环伏安法模式中，它的优先措施儿茶酚胺。在肾上腺嗜铬细胞总游离儿茶酚浓度为 50-500 microm，其中约有 10%是儿茶酚胺。利血平、 囊泡单胺转运蛋白抑制剂，对儿茶酚胺池并无影响，但总的 catechols 的四倍至五倍。利血平结合 pargyline，单胺氧化酶抑制剂，增加由细胞溶质中的儿茶酚胺水平约了 6 倍。苯丙胺诱导瞬态游离儿茶酚胺的大约 5 倍积累和总 catechols 缓慢增加。孵化与 3，4-二羟基-L-苯丙氨酸 (左旋多巴） 的单元格，儿茶酚胺上升约引诱而总 catechols 增加了约四倍。游离的儿茶酚胺回到控制水平 < 或左旋多巴撤出以后，= 10 分钟，而总 catechols L 左旋自由媒体 1.5 小时孵化后仍然大约两倍甚至更高。我们的数据表明胞浆儿茶酚胺都严格定义的水平，能维持和药物诱导其浓度的增加导致其他儿茶酚胺衍生物，如代谢和 3，4-dihydroxyphenylethyleneglycol 的积累。这些衍生品驻留在细胞质液中几个小时后治疗，可能是与毒品有关的细胞毒性作用的一个根本原因。
多巴胺神经元释放发射器通过闪烁的融合孔隙。
理解机制的神经递质释放的一个关键问题是发射机的是否融合孔隙的突触囊泡管制期间胞释放量。我们测量了从培养的大鼠脑腹侧神经元使用碳纤维安培的小突触小泡的多巴胺释放。我们的数据表明小突触囊泡融合毛孔闪烁一次或多次快速连续，与每个闪烁约 25-30%的水疱多巴胺的释放。与多个摇曳的事件的发生率也是相互受佛波酯和 staurosporine。因此，多巴胺神经元调节神经递质突触小泡发表控制每个高尔基事件融合孔隙闪烁的数量的金额。这种模式是胞的即神经元可以迅速重用水泡而经历的回收进程相对缓慢的潜在机制。
圈套可以促进彻底的融合和 Hemifusion 作为替代性成果。
使用细胞融合检测中，我们在这里展示，除了彻底的融合圈套还促进 hemifusion 作为另一种结局。大约有 65%的事件导致充分融合，并在 hemifusion ； 其余的 35 %人，约有三分之二是永久性的大约有三分之一是可逆。我们预测此成果之间的比较接近平衡可以倒的圈套，调节蛋白的绑定允许动态生理调控之间完全融合和可逆吻运行类似事件。
记录的安培的高尔基事件的分析。
安培广泛用于研究胞的神经递质和激素的各种细胞类型。在来自氧化的单胺类分子释放期间的个别分泌囊泡融合的安培峰值的形状分析提供了有关分子参与依赖于刺激的神经递质释放的步骤的信息。在这里我们目前的安培信号处理方法的概述，包括 (i) 安培信号采集和筛选，(ii) 的高尔基事件检测并确定穗形状特征和 (三) 数据处理和统计分析。这项检讨的目的是为执行安培录制的高尔基活动和解释结果基于形状特征的个别释放事件提供实务指引。
Α-synuclein 过表达增加游离儿茶酚胺浓度。
多巴胺稳态失调和发射器的游离级别提升有人建议，作为在帕金森病中的儿茶酚胺神经元的脆弱性。因为 α-synuclein 或野生型 (WT) 蛋白的表达中的几个已知的突变导致家族性帕金森病的形式，我们调查了 α-synuclein 发病机制和多巴胺稳态之间可能的联系。嗜铬细胞分离去 A30P α-synuclein 显示大大的转基因小鼠增加游离儿茶酚胺水平来衡量细胞内修补电化学、 而超量表达 WT 蛋白和那些从细胞敲动物没有不同的控件。同样，L 左旋治疗 PC12 细胞转基因 A30P 或 A53T 相比那些表示 WT α-synuclein，虽然左旋多巴的挑战后保持一个低游离多巴胺水平细胞的能力显著抑制由任一蛋白中儿茶酚浓度也较高。我们还发现孵化的 WT、 A30P 或 A53T α-synuclein 低 micromolar 浓度抑制 ATP 依赖维修的 pH 梯度中孤立嗜铬囊泡和 WT 蛋白是显著诱导质子漏不很有效。总之，我们表现出表达的不同类型的 α-synuclein 扰乱了水疱的 ph 值和胞浆邻苯二酚的物种，在可能的影响水平显著增加导致打开触发器细胞氧自由基的损害。虽然多个分子机制可能是负责游离儿茶酚胺稳态的扰动，这项研究提供了有关如何 α-synuclein 可能发挥其细胞毒作用和选择性地破坏细胞儿茶酚胺的关键证据。
多巴胺修改 α-synuclein 块伴侣介导自噬。
改变的退化的 α-synuclein (α-syn) 有牵连的帕金森病 (PD) 发病机制的研究。我们已经表明，α-syn 可以降级通过伴侣介导噬 (CMA)，选择性的溶酶体游离蛋白质降解的机制。致病性突变体的 α-syn 阻止溶酶体易位，损害他们自己以及其他 CMA 衬底的退化。虽然 α-syn 致病突变很少见，α-syn 经过翻译后的修改，可能就是其积累的游离在大多数形式的 PD.使用鼠标腹侧内侧神经元文化聚合、 SH SY5Y 细胞在文化和孤立的鼠标溶酶体，我们发现大部分的这些翻译后修改的 α-syn 损害由 CMA 此蛋白质降解，但不是会影响其他基质退化。修改多巴胺 α-syn，不过，不只差退化的 CMA，但也通过这个途径阻止其他基质降解。随着 CMA 堵塞增加细胞易受压力源，但我们建议抑制多巴胺诱导的自噬作用可以解释 PD 多巴胺能神经元选择性变性。
记录的安培的单囊泡高尔基事件的分析。
在来自氧化的单胺类分子释放期间的个别分泌囊泡融合的安培峰值的形状分析提供了分子步骤参与依赖于刺激的神经递质释放的宝贵数据。安培的灵敏度允许检测的单胺类发布从单个水泡，让信息有关细胞内变送器稳态 （合成、 降解、 再摄取等） 和释放概率 （囊泡可用性和融合机械到 Ca(+2)) 的敏感性。此外，安培的时间分辨率允许实时释放动力学的单胺类胞吐过程的观察。在这里，我们提供电脑分析的重点是赋予穗参数上与不同的取样率、 信号到噪音水平、 穗工期、 录制的一贯决心的例程安培信号和周围信号的算法。
分泌囊泡反弹 Hyperacidification 和增加因暴露在长时间的甲基安非他明的量子大小。
急性暴露于安非他明 (AMPHs) 折叠分泌囊泡 pH 梯度，其中增加游离儿茶酚胺水平，同时融合活动期间减少的儿茶酚胺释放量子大小。AMPH 和甲基安非他明 (甲基)，但是，将保留在组织中在长时间内。我们使用光学和电子显微镜探针来衡量对分泌囊泡 pH 和安培和胞内修补电化学观察 neurosecretion 和游离的儿茶酚胺对体外培养大鼠嗜铬细胞长期 METH 暴露的影响。与急性 METH 影响，接触 10 microM 和较高的浓度在 6-48 h 为药物产生分泌囊泡浓度依赖性反弹 hyperacidification。5-10 MicroM 各级长期的 METH 增加量子的大小和恢复高尔基儿茶酚胺释放，虽然很高的药物，同时继续生产反弹 hyperacidification (> 100 microM） 水平不增加量子的大小。分泌囊泡反弹 hyperacidification 是依赖于最佳反应在大约摄氏 37 度的温度，未被拦截的转录抑制嘌呤，似乎是一般的补偿性反应，长时间暴露与 membranophilic 弱碱，包括 AMPHs、 哌醋甲酯、 可卡因、 氨。因此，在某些条件下长时间接触，AMPHs 和其他弱碱可以加强，而耗尽，水泡释放的儿茶酚胺通过补偿的响应，从而导致囊泡酸化。
游离多巴胺、 钙和 α-synuclein 原因选择性死亡的黑质神经元之间的相互关系。
选择性神经退行性疾病的特定神经元人口死亡的基础仍不清楚。帕金森病 (PD) 是 synucleinopathy (SN) 黑质多巴胺能神经元优惠损失的特点，而神经元腹侧被盖区 （VTA） 都不能幸免。使用胞内修补电化学直接测量游离的多巴胺 (脑细胞的神经元中的 DA(cyt))，我们确认提升的 DA(cyt) 和其代谢产物是神经毒性和遗传及药理活性的干预措施，减少 DA(cyt) 提供神经保护作用。左旋多巴增加 DA(cyt) SN 神经元到 2 到 3 倍水平高于 VTA 神经元，依赖于二氢吡啶类敏感 Ca2 + 通道，更易感性的 SN 神经元导致 L 左旋多巴诱发神经毒性反应。DA(cyt) 没有被篡改的 α-synuclein 删除，虽然缺乏 α-synuclein 的多巴胺能神经元抗 L 左旋多巴诱发细胞死亡。因此，Ca2 +、 DA(cyt) 与 α-synuclein 相互作用可能是依据 PD，暗示多个治疗目标 SN 神经元的易感性。
荧光假神经递质可视化多巴胺释放从单个突触前终端。
中枢神经系统传输信号通过突触囊泡融合过程的神经递质释放的神经元之间。为了观察神经递质吸收和释放从单个突触前终端直接，我们为基板的突触囊泡单胺转运体设计荧光假神经递质。我们在纹状体中使用这些探测器的图像多巴胺释放，取得若干意见有关的突触可塑性。我们发现释放每刺激神经递质突触小泡的分数依赖于刺激频率。动力系统独特的"保留"突触囊泡人口是这些实验的条件下观察不到。依赖于频率的非均质性的突触前码头透露这是部分取决于 D2 多巴胺受体，指示频率依赖的突触前选择编码的机制。
