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Articles by Eugene V. Mosharov in JoVE
JoVE General
Il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con FFNs
1Departments of Neurology, Columbia University, 2Departments of Psychiatry and Pharmacology, Columbia University, 3Department of Chemistry, Columbia University, 4eMolecules, Inc., 5Departments of Neurology and Physiology, University of California School of Medicine, San Francisco, 6Division of Molecular Therapeutics, New York Psychiatric Institute
Un nuovo mezzo per misurare la neurotrasmissione otticamente con analoghi della dopamina fluorescenti.
Other articles by Eugene V. Mosharov on PubMed
Elettrochimica Patch Intracellulare: Regolamento Delle Catecolamine Citosolici Nelle Cellule Cromaffini
Alterazioni nel pool citosolico direttamente influenzano il rilascio e la sintesi di neurotrasmettitori e sono suggeriti per essere fattori chiave in varie malattie neurodegenerative. Sebbene questo pool citosolico è metabolicamente più attivo, è minuscola rispetto alla quantità di trasmettitore vescicolare e mai è stato quantificato separatamente. Qui, presentiamo elettrochimica patch intracellulare (IPE), una tecnica che per la prima volta fornisce misurazioni dirette di molecole ossidabili citosolici in singole cellule di mammiferi. In modalità amperometrico, IPE rileva polifenoli totali, mentre in modalità ciclica voltammetrica, preferenzialmente misura catecolamine. Nelle cellule cromaffini colte, la concentrazione totale citosolico catecolo era microm 50-500, di cui circa il 10% erano catecolamine. Reserpina, un inibitore del trasportatore vescicolare di monoamine, ha avuto alcun effetto sulla piscina catecolamina ma quadruplicata catecoli totale al quintuplo. Combinato con pargyline, un inibitore della monoamino ossidasi, reserpina aumentati livelli di catecolamine nel citosol di approssimativamente sixfold. Amfetamina indotta da un transitorio circa quintuplo accumulo delle catecolamine citosolici e un lento aumento dei polifenoli totali. In cellule incubate con 3,4-diidrossi-L-fenilalanina (l-dopa), catecolamine è aumentato da circa 2.5-fold e polifenoli totali quadruplicata da approssimativamente. Catecolamine citosolici tornò a livelli di controllo < o = 10 min dopo il ritiro di l-dopa, considerando che i polifenoli totali è rimasto approssimativamente duplice elevati anche dopo un'incubazione di 1.5 hr in media L-DOPA-gratis. I nostri dati indicano che catecolamine citosolici sono rigorosamente mantenuti ad un livello definito, e farmaco-indotta aumenta nelle loro concentrazioni portano all'accumulo di altri derivati delle catecolamine, quali DOPAC e 3,4-dihydroxyphenylethyleneglycol. Questi derivati risiedono nel citosol per ore dopo il trattamento e possono essere una causa di fondo di citotossicità droga-correlati.
I Neuroni Della Dopamina Rilasciano Trasmettitore Tramite Un Poro Di Fusione Tremolante
Una domanda chiave nei meccanismi di comprensione del rilascio di neurotrasmettitore è se il poro di fusione di una Vescicola sinaptica regola la quantità di trasmettitore liberato durante esocitosi. Abbiamo misurato il rilascio di dopamina da piccole vescicole sinaptiche dei neuroni mesencefalo ventrale ratto coltivato utilizzando fibra di carbonio amperometria. I nostri dati indicano che i pori di fusione piccola Vescicola sinaptica sfarfallano o una volta o più volte in rapida successione, con ogni sfarfallano rilasciando circa 25-30% di dopamina vescicolare. L'incidenza di eventi con più sfarfalla reciprocamente era regolata da staurosporine ed esteri del forbolo. Così, i neuroni della dopamina regolano la quantità di neurotrasmettitore rilasciato da piccole vescicole sinaptiche controllando il numero di fusione poro sfarfalla per questo evento. Questa modalità di esocitosi è un potenziale meccanismo per cui i neuroni possono riutilizzare rapidamente le vescicole senza subire il relativamente lento processo di riciclaggio.
Insidie Possono Promuovere La Completa Fusione E Hemifusion Come Esiti Alternativi
Utilizzando un dosaggio di fusione delle cellule, mostriamo qui che oltre alla completa fusione insidie anche promuovono hemifusion come un risultato alternativo. Circa il 65% degli eventi ha portato a fusione piena e il restante 35% in hemifusion; di questi, circa due terzi erano permanenti e circa un terzo erano reversibili. Prevediamo che questo equilibrio relativamente stretto tra i risultati poteva essere ribaltato dal legame delle proteine regolatrici di insidie, permettendo di regolamento fisiologica dinamica tra fusione completa e reversibili bacio-e-esecuzione-come gli eventi.
Analisi Di Questo Eventi Registrati Da Amperometria
Amperometria è ampiamente utilizzato per studiare esocitosi di neurotrasmettitori e ormoni in vari tipi di cellule. Analisi della forma delle spighe amperometrico che provengono dall'ossidazione di molecole di monoamine rilasciato durante la fusione di vescicole secretorie individuale fornisce informazioni sui passaggi molecolari coinvolti nel rilascio di stimolazione-dipendente dal trasmettitore. Qui vi presentiamo una panoramica della metodologia di elaborazione del segnale amperometrico, compresa l'acquisizione del segnale amperometrico (i) e di filtraggio, (ii) rilevazione degli eventi questo e determinazione spike caratteristiche di forma e manipolazione (iii) dei dati e analisi statistica. Lo scopo di questa revisione è quello di fornire linee guida pratiche per eseguire registrazioni amperometrico di attività questo e nell'interpretazione dei risultati in base alle caratteristiche di forma del rilascio di singoli eventi.
Sovraespressione Di Alfa-sinucleina Aumenta La Concentrazione Citosolica Delle Catecolamine
Disregolazione dell'omeostasi della dopamina e l'elevazione del livello citosolico del trasmettitore sono stati suggeriti per sottendono la vulnerabilità dei neuroni catecholaminergic nel morbo di Parkinson. Perché diverse mutazioni conosciute in alfa-sinucleina o iperespressione della proteina wild-type (WT) provoca forme familiari del morbo di Parkinson, abbiamo studiato i possibili legami tra alfa-sinucleina patogenesi e l'omeostasi della dopamina. Cellule cromaffini isolate da topi transgenici che iperesprimono A30P alfa-sinucleina visualizzato significativamente aumentati livelli di catecolamina citosolica come misurato da elettrochimica patch intracellulare, considerando che le cellule con sovraesprimono relativa proteina WT e quelli da knock-out gli animali non erano diversi dai controlli. Similarmente, catecolo concentrazioni erano superiori in cellule PC12 trattati con L-DOPA all A30P o A53T rispetto a quelli che esprimono WT alfa-sinucleina, sebbene la capacità delle cellule di mantenere un livello di dopamina citosolico basso dopo la sfida di l-dopa era marcatamente inibita da una proteina. Abbiamo anche trovato che incubazione con concentrazioni micromolar bassa di WT, A30P o A53T alfa-sinucleina inibito manutenzione ATP-dipendente di gradienti di pH in vescicole cromaffini isolate e che la proteina WT era significativamente meno potente nell'indurre la perdita del protone. In sintesi, ci dimostrano che sconvolge la sovraespressione di diversi tipi di alfa-sinucleina pH vescicolare e porta ad un marcato aumento dei livelli di specie citosolico catecolo, un effetto che può nel girare a danni cellulari oxyradical trigger. Anche se molteplici meccanismi molecolari possono essere responsabili della perturbazione dell'omeostasi delle catecolamine citosolico, questo studio fornisce la prova critica circa come la alfa-sinucleina potrebbe esercitare la sua citotossicità e danneggiare selettivamente le cellule catecholaminergic.
Dopamina-modificato Alfa-sinucleina Blocca Autophagy Chaperone-mediata
Alterata degradazione della alfa-sinucleina (alfa-syn) è stato implicato nella patogenesi della malattia di Parkinson (MdP). Abbiamo dimostrato che syn-alfa può essere degradata via autophagy chaperone-mediata (CMA), un meccanismo lisosomiale selettivo per la degradazione delle proteine citosoliche. Patogeni mutanti di alfa-syn bloccano traslocazione lisosomiale, indebolendo la loro degradazione insieme a quella di altri substrati di CMA. Mentre le mutazioni patogene alfa-syn sono rare, alfa-syn subisce modifiche di posttranslational, che possono essere alla base di suo accumulo in aggregati citosolici nella maggior parte delle forme di culture di neurone mediale ventrale del mouse utilizzando PD, SH-SY5Y cellule in coltura e lisosomi isolato mouse, abbiamo trovato che la maggior parte di queste modifiche di posttranslational di alfa-syn compromettere la degradazione di questa proteina di CMA ma non influiscono sul degrado di altri substrati. Dopamina-modificato alfa-syn, tuttavia, non è solo scarsamente degradata da CMA ma anche blocchi di degradazione di altri substrati di questo percorso. Come blocco di CMA aumenta la vulnerabilità cellulare a fattori di stress, proponiamo che indotta da dopamina autophagic inibizione potrebbe spiegare la degenerazione selettiva dei neuroni dopaminergici PD.
Analisi Degli Eventi Di Questo Singolo-vescicola Registrata Da Amperometria
Analisi della forma delle spighe amperometrico che provengono dall'ossidazione di molecole di monoamine rilasciato durante la fusione di vescicole secretorie individuale forniscono preziosi dati sui passaggi molecolari coinvolti nel rilascio di stimolazione-dipendente dal trasmettitore. La sensibilità di amperometria permette la rilevazione delle monoamine rilasciato da vescicole singole, dando informazioni su omeostasi intracellulare trasmettitore (sintesi, degradazione, reuptake, ecc.) e la probabilità di rilascio (vescicola disponibilità e sensibilità di macchinari di fusione di Ca(+2)). Inoltre, risoluzione temporale di amperometria permette l'osservazione di cinetica in tempo reale delle monoamine rilascio durante esocitosi. Qui, forniamo gli algoritmi per l'analisi computerizzata del segnale amperometrico con enfasi sulle routine che conferiscono coerente determinazione dei parametri di picco su registrazioni con frequenze di campionamento differenti, livelli di segnale-rumore, spike durate e segnale circostante.
Vescicola Secretoria Rimbalzo Hyperacidification E Quantal Dimensione Derivante Dall'esposizione Prolungata La Metanfetamina è Aumentato
L'esposizione acuta alle anfetamine (AMPHs) crolla gradienti di pH vescicola secretoria, che aumenta i livelli di catecolamine citosolico diminuendo la dimensione quantal di catecolamina release durante gli eventi di fusione. AMPH e metanfetamine (METH), tuttavia, vengono mantenuti nei tessuti sopra lunghe durate. Abbiamo usato ottiche ed elettrone microscopiche sonde per misurare gli effetti dell'esposizione a lungo termine di metanfetamina sul pH vescicola secretoria e amperometria ed elettrochimica intracellulare patch per osservare gli effetti su neurosecretion e catecolamine citosolici di ratto coltivata cellule cromaffini. In contrasto con gli effetti acuti di METH, l'esposizione al farmaco per 6-48 ore a 10 microM e più alte concentrazioni prodotte un hyperacidification di concentrazione-dipendente rimbalzo delle vescicole secretorie. A livelli di 5-10 microM, METH prolungato aumentato le dimensioni quantal e reintegrato il rilascio delle catecolamine questo, anche se molto alta (> 100 microM) livelli di droga, pur continuando a produrre hyperacidification di rimbalzo, non ha fatto aumentare le dimensioni quantal. Vescicola secretoria rimbalzo hyperacidification era dipendente con risposta ottimale a circa 37 gradi C di temperatura, non è stato bloccato dall'inibitore di trascrizione, con puromicina e sembra essere una risposta compensatoria generale per l'esposizione prolungata con basi deboli membranophilic, compreso AMPHs, metilfenidato, cocaina e ammoniaca. Così, in alcune condizioni di esposizione prolungata, AMPHs e altre basi deboli possono migliorare, piuttosto che esaurire, il rilascio vescicolare di catecolamine attraverso una risposta compensatoria con conseguente acidificazione della vescicola.
Interplay Tra Citosolica Dopamina, Calcio E Alfa-sinucleina Cause Morte Selettiva Dei Neuroni Della Substantia Nigra
La base per la morte selettiva di specifiche popolazioni neuronali in malattie neurodegenerative rimane poco chiara. Malattia di Parkinson (MdP) è un synucleinopathy caratterizzato da una perdita preferenziale di Neuroni dopaminergici nella substantia nigra (SN), mentre i neuroni dell'area tegmentale ventrale (VTA) sono risparmiati. Utilizzando elettrochimica intracellulare patch per misurare direttamente la dopamina citosolica (DA(cyt)) in neuroni coltivati mesencefalo, confermiamo che DA(cyt) elevati e dei suoi metaboliti sono neurotossici e che gli interventi genetici e farmacologici che diminuiscono DA(cyt) forniscano neuroprotezione. L-dopa aumentato DA(cyt) in neuroni SN a livelli 2 - a 3 volte superiore nei neuroni VTA, una risposta dipendente su canali Ca2 + diidropiridinico-sensibili, con conseguente maggiore suscettibilità dei neuroni SN di neurotossicità indotta L-DOPA. DA(CYT) non è stata alterata da alfa-sinucleina eliminazione, nonostante i neuroni dopaminergici privo di alfa-sinucleina erano resistenti alla morte cellulare indotta L-DOPA. Così, un'interazione tra Ca2 +, DA(cyt) e alfa-sinucleina può essere alla base della suscettibilità dei neuroni SN nel PD, suggerendo più bersagli terapeutici.
Fluorescenti Falsi Neurotrasmettitori Visualizzare Rilascio Di Dopamina Dai Singoli Terminali Presinaptiche
Il sistema nervoso trasmette segnali tra neuroni tramite rilascio di neurotrasmettitore durante la fusione della vescicola sinaptica. Al fine di osservare assorbimento del neurotrasmettitore e rilasciare direttamente dai singoli terminali presinaptiche, abbiamo progettato fluorescenti falsi neurotrasmettitori come substrati per il trasportatore di monoamine Vescicola sinaptica. Usando queste sonde a immagine rilascio di dopamina nello striato, abbiamo fatto diverse osservazioni pertinenti a sinaptico plasticità. Abbiamo trovato che la frazione di vescicole sinaptiche rilasciando il neurotrasmettitore per stimolo era dipende la frequenza di stimolo. Una popolazione di Vescicola sinaptica cineticamente distinti "riserva" non è stata osservata in queste condizioni sperimentali. Un'eterogeneità dipendente dalla frequenza dei terminali presinaptiche è stata rivelata che era dipendente in parte su ricevitori della dopamina D2, che indica un meccanismo per la codifica di frequenza-dipendente della selezione presinaptica.
